taq dna 聚合酶的制备及其活性、纯度的检测

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1、TaqDNA聚合酶的制备及活性检测肖碧山（泉州师院化学与生命科学学院生物科学专业2002级学号020304005）指导老师：孙亮先（副教授）摘要：用含有TaqDNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coliDH5α菌株,IPTG诱导表达TaqDNA聚合酶。利用该酶的热稳定性,反复两次-70℃、75℃交替冻融以裂解细胞释放胞浆;以高速离心除去冻融变性的细胞碎片及核酸蛋白的复合物以达到快速纯化TaqDNA聚合酶的目的。以商品酶作对照，用PCR扩增反应和SDS-PAGE检测所制备的TaqDNA聚合酶的活性及纯度。最后用GIS凝胶图像处理系统测定所纯化Taq

2、DNA聚合酶的分子量。关键词：交替冻融；TaqDNA聚合酶；PCR反应；SDS-PAGE电泳；活性；纯度；GIS凝胶图像处理系统ThepurificationandactivitydeterminationofTaqDNAPolymeraseXiaoBi-Shan(DepartmentofBiology,schoolofchemical＆biologyscience,QuanzhouNormaluniversity.Quanzhou,Fujianprovince,362000,China)Abstract:ThestrainofE.coliDH5αwa

3、stransformedwithpTaqexpressingplasmidwithinwhichtheTaqDNApolymerasegenewasinserted.TheexpressionofthegenecouldbeinducedbyIPTG.Exploitingthethermalstabilitypropertyofthisenzyme,thewedevelopedarapidmethodtoisolatedthisenzymebytwocyclesof-70℃freezingand75℃thawing,whichrupturedthece

4、llmembraneandreleasedthecellcontent.Afterahighspeedcentrifugation,thedenaturedmacromoleculesprecipitatedandtheTaqDNApolymerasecouldbecollectedinthesupernatant.Takecommerciallyavailableenzymeasandcontrast,PCRamplifyreactingandSDS-PAGEmeasuresactivityandpurityofTaqDNApolymerasepre

5、pared.UseGISgelpictureprocessingsystemmeasuresthemolecularweightofTaqDNApolymerasefinally.Keywords:freezingandthawing；TaqDNApolymerase；polymerasechainreaction；SDS-PAGE；activity；purity；GISgelpictureprocessingsystem.1引言1958年科学家分离出DNA聚合酶后,就曾设想利用DNA聚合酶扩增大量DNA。1983年karyMullis发明了聚合酶链式

6、反应(PCR)[1]。1985年RandallK.Saiki等利用KlenowDNA聚合酶相应建立了聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction),简称PCR技术[3]，由于klenowDNA聚合酶在高温下很快就失活，故每一轮PCR都要追加KlenowDNA聚合酶，这限制了PCR技术的推广与应用。1986年Erlich分离纯化出热稳定的适用于PCR技术的TaqDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶最初是从耐热细菌Thermusaquaticus中纯化而得[2]，现已有其基因工程酶[3]。1988年RandallK.Saiki等也从水生栖热菌

7、(Thermusaquatics)中分离纯化到了TaqDNA聚合酶并将它应用于PCR技术[3]。自此以后PCR技术才真正地得到了推广，被广泛地应用于基因诊断、定点诱变、DNA序列测定以及DNA多态性研究等各个方面。随着PCR技术的推广和应用，TaqDNA聚合酶的研究日渐重要。陈卫[6]等从嗜热脂肪芽孢杆菌中克隆出编码热稳定的半乳糖苷酶蛋白基因bgaB，构建具T7强启动子的pET20(b)bgaB质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。经IPTG诱导后，重组菌周质中乳糖酶酶活达到0.12U/ml，胞内酶活为1.35U/ml，比酶活为6.66U/m

8、g蛋白，比酶源菌产生的酶活提高50倍。通过对IPTG诱导时机、诱导浓度和诱导时间的优化研究，重