最新二pcr反应体系taq dna聚合酶 - 昆明医科大学教学讲义ppt.ppt

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1、二pcr反应体系taqdna聚合酶-昆明医科大学第二节聚合酶链式反应polymerasechainreactionPCR教学内容和目的要求：＊掌握PCR的原理＊掌握PCR的反应体系和方法＊熟悉PCR在法医学的应用＊一.PCR原理（PCRprinciple）在体外，以一对人工合成的特异性寡核苷酸为引物，四种脱氧核苷酸为底物，以待测目的DNA为模板，在DNA聚合酶的催化作用下，通过高温变性、低温退火、中温延伸的温度循环，选择性扩增目的DNA片段，经过30个循环周期后，目的DNA片段达到百万倍的扩增。ThePCRpr

2、inciplePCRisjustlikeDNAreplicationinvivo.apairofoligonucleotides--primers（引物）dNTP--substrate（底物）TargetDNA--template（模板）TaqDNApolymerase--enzyme（酶）Denaturation（变性）---高温Annealing（复性）---低温Extension（延伸）---中温ThePCRprocedureTheReactionThermalCyclerPCRtubesDNADenat

3、uration（DNA变性）通过加热（94℃）使模板DNA双链间氢键断裂，双链解离形成两条单链DNA的过程。DNAAnnealing（DNA退火）又称DNA复性，将反应体系降温（60℃），引物与单链模板DNA按照碱基互补配对的原则重新形成模板-引物杂化双链的过程。DNAExtension（DNA延伸）DNA聚合酶在适当温度条件下（72℃）催化4中dNTP原料按照碱基互补配对原则从引物的3’末端开始渗入，延模板有5’3’方向延伸，合成一条新的DNA链的过程。DNAtemplate95℃Denaturation(

4、heatto95oC)95℃50-60℃AntisensePrimerSensePrimerAnnealwithprimers(lowerto50-60℃)PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50-60℃72℃Taq酶Taq酶Extension(increaseto70oC)AntisensePrimerSensePrimerPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃ThefirstcyclePCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃65℃72℃TaqTaqTaq

5、TaqThesecondcyclePCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点DNAtemplate20－30cycles1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1～3步25～30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍预变性(93-95C,2-5m)变性(93-95C,30s)退火(50-70C,30s)延伸(75C,30-60s)总延伸(75C,7m)(25-35)PCR的一般过程

6、：经过30次的循环,扩增的DNA片段可达100万倍以上。＊二.PCR反应体系TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)引物(primer)dNTP(A、T、C、G)模板(template)Mg2+（PCRbuffer）标准的PCR反应体系（100l）4种dNTP混合物各200mol/L（A、C、T、G）引物各10～100pmol（上游引物、下游引物）模板DNA0.1～2gTaqDNA聚合酶2.5u缓冲液Mg2+1.5mmol/LKCl50mmol/LTris-HCl(Ph8.4)10mmol/

7、L0.001%明胶或牛血清蛋白What’sintheTubeTargetDNA5’3’3’5’primersABdNTPTaqDNApolymeraseMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Buffercontainingmagnesium1.TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）最适温度：72℃，半衰期：92.5℃130min；95℃40min；97.5℃5—6min。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。1.TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）水生栖热菌

8、(thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶。①5’3’DNA聚合酶活性；②无3’5’外切酶活性，没有引物3’端错配碱基的校正功能，35轮循环有0.25%错配，与原始模板有差别。人工合成的寡核苷酸序列,与靶DNA片段两侧翼的序列互补。引物序列限定了PCR产物的长度和特异性。引物浓度一般为0.1～0.5mol/L。2.引物（primer）例如IL-3：5‘GCTCCA