土壤中细菌纯种分离和培养

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1、实验七土壤中细菌纯种分离和培养一、目的要求掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中初步分离培养细菌的方法，从而获得细菌纯培养技能；了解基本接种技术。二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌。为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的

2、稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免菌源中各类微生物的相互干扰。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表所示。三、仪器和材料样品：新鲜土壤培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基无菌水：带有玻璃珠装有90mL无菌水三角瓶、装有9mL无菌水的试管。其它：无菌培养皿、无菌吸管、酒精灯、培养箱等。四、细菌纯种分离的操作方法细菌纯种分离的方法有两种：平板划线法和浇注平板法。（一）平板划线分离法1．平板的制作将融化并

3、冷至约50℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。每组制培养皿3套。在无菌培养皿底部注明分离菌名、稀释度。用接种环挑取一环土壤悬液，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（切勿划破培养基），划线完毕盖好皿盖，倒置，30℃培养24-48h后观察结果。2．操作划线的方式可取图中任何一种1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法（二）浇注平板法1．采土样选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm深度的或特殊要

4、求的地方土壤数10g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实验室供分离用。2．制备土壤稀释液将1瓶90mL和4管9mL的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4及10-5依次编号。称取土样10g放入盛99mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，置摇床振荡5min使土样均匀分散在稀释液中成为土壤悬液（10-1），在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸取lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯度的菌液需换用不同

5、的吸管。3．平板的制作取10套无菌培养皿编号，10-3、10-4、10-5各3个，另1个为空气对照。取1支lmL无菌移液管从浓度小的10-5菌液开始，以10-5、10-4、10-3为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀）。加热融化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30

6、℃培养24-48h，然后观察结果。取“对照”的无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖10min后盖上皿盖，倒置于30℃培养24-48h后观察结果。土壤稀释液的制备和稀释液的取样五、微生物的几种接种技术操作由于实验的目的、所研究的微生物种类、所用的培养基及容器的不同，因此，接种方法也有多种，现简介如下：（－）接种用具常用的接种用具有接种环、接种针、接种钩、玻璃刮刀、铲、移液管、滴管等。接种环和接种针等总长约25cm，环、针、钩的长为4.5cm，可用白金、电炉丝或镍丝制成。上述材料以白金丝最为理想，其优点是在火焰上灼烧红得快，离火焰后冷得快，不易氧

7、化且无毒。但价格昂贵，一般用电炉丝和镍丝。接种环的柄为金属的，其后端套上绝热材料套。柄也可用玻璃捧制作。（二）接种环境微生物的分离培养、接种等操作需在经紫外线灯灭菌的无菌操作室、无菌操作箱或生物超净台等环境下进行。（三）几种接种技术1．斜面接种技术是将长在斜面培养基（或平板培养基）上的微生物接到另一支斜面培养基上的方法。（l）接种前将桌面擦净，将所需的物品整齐有序地放在桌上。（2）将试管贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人等相关信息。（3）点燃酒精灯。（4）将一支斜面菌种和一支待接的斜面培养基放在左手上，拇指压住两支试管，中指位于两支试管之间

8、，斜面向上，管口齐平。（5）右手先将棉塞拧松动，以便接种时拔出。右手拿接种环，在火焰上将环烧红以达到灭菌（环以上凡是可能进入试管的部分都应灼烧）。（6）在火焰旁，用