牛支原体诊断技术规程（定稿）

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1、ICS11.220B41DB37山东省地方标准DB37/TXXXXX—XXXX牛支原体诊断技术规程CodeofPracticefortheDiagnosisofMycoplasmaBovisXXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/XXXXX—XXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13术语与定义14试剂及仪器14.1试剂14.2仪器25样品采集与处理25.1疑似牛支原体感牛只的判断25.2疑似病例样品的采集25.3样品处理26微生物学检测法26.1液体培养26.2菌落形态观察26.3Dienes染色36.4生化试验36.5结果判定37核酸

2、检测法37.1DNA模板的制备37.2PCR检测37.3凝胶电泳47.4质量控制47.5结果判定48废弃物的处理和检测过程中安全措施49操作注意事项5附　录　A（规范性附录）培养基的制备方法66DB37/XXXXX—XXXX前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、中国农业科学院兰州兽医研究所、威海市畜牧兽医局。本标准主要起草人：张亮、杨宏军、解晓莉、孙阳阳、储岳峰、赵国清、程凯慧、楚会萌、刘来兴、杨美。6DB37/XXXXX—XXXX牛支原

3、体诊断技术规程1　范围本标准规定了牛支原体诊断技术的术语和定义、试剂及仪器、样品的采集与处理方法、生化鉴定方法、核酸检测方法和操作注意事项等。本标准适用于牛支原体的实验室诊断。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB6682—2008　分析实验室用水规格和试验方法GB/T14926.8—2001　实验动物　支原体检测方法GB15981—1995　消毒与灭菌效果的评价方法与标准GB19489—2008　实验室生物安全通用要求3　术语与定义下列术语和

4、定义适用于本文件。3.1　牛支原体　Mycoplasmabovis柔膜菌纲支原体目支原体科支原体属，可引起成母牛乳腺炎、犊牛肺炎和关节炎等多种疾病的病原之一。3.2　Dienes　染色液一种经典的利用天青美蓝染色检测支原体的染色液。3.3　类胸膜肺炎微生物培养基　Pleuropneumonia-LikeOrganismsmedium，PPLO培养基该培养基主要成分为牛心汤、酵母浸出物、牛肉膏等，不含精氨酸、酚红、葡萄糖等成分，主要用于多种支原体的分离和培养。4　试剂及仪器4.1　试剂6DB37/XXXXX—XXXX去离子水（符合GB6682—2008的相应要求）；牛支原体检测培养基所

5、需试剂及配制方法见附录A；TaqDNA聚合酶及其反应缓冲液；生理盐水；Dienes染色液；TAE电泳缓冲液；琼脂糖1.1　仪器接种环、酒精灯、移液器（5～100μL和100～1000μL）、枪头（200μL和1mL）、培养试管（15mL）和玻璃平皿（90mm）、CO2恒温培养箱、移液器、1L容量瓶、核酸扩增仪、电泳仪、高压灭菌锅、正置光学显微镜。2　样品采集与处理2.1　疑似牛支原体感牛只的判断2.1.1　肺炎型，主要表现为咳嗽、喘，有清亮或脓性鼻液，伴随出现关节炎或角膜结膜炎；不同病死牛只的病变差异较大，通常病牛心叶及部分膈叶的局部红色肉变，或同时有化脓灶散在分布。2.1.2　乳腺

6、炎型，主要表现为临床型乳腺炎和隐性乳腺炎，前者乳汁带血或呈灰色，后者体细胞数较高，无明显临床症状，但多数情况下单纯感染无明显的红肿热痛。2.1.3　关节炎型，主要表现为犊牛膝关节肿大、跛行，关节炎淡黄色或浓稠，常与肺炎性伴随发生。2.2　疑似病例样品的采集根据“5.1”所述牛支原体感染的三种临床表现型，分别进行样品的采集，具体要求如下：a)肺炎型：应采集新病死牛只的肺部实变部分或病牛的鼻腔液，置专用采样器或无菌容器中；b)乳腺炎型：采集前，应弃病牛的前三把奶，再采集病牛乳汁约15mL，置注射器或无菌容器中；c)关节炎型：对采集部位进行消毒后穿刺吸取关节液约2mL～5mL，置注射器或无

7、菌容器中。2.3　样品处理2.3.1　组织样品的处理剪至云雾状后，用2mL生理盐水重悬，7500g离心5min，用注射器吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。2.3.2　鼻拭子的处理用2mL生理盐水浸润拭子后，7500g离心5min，吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。2.3.3　奶样或关节液样品的处理分别取1mL原液与1mL生理盐水充分混合，7500g离心5min，用注射器吸取1mL上清液经0.45μm滤膜滤过后备用。3　微生物学检测法