微生物学实验课-实验六微生物的显微直接计数法

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1、实验六微生物的显微直接计数法—、实验目的了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。二、实验原理测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌抱子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫•霍泽（PetrofHausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有

2、4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为lmm,则计数区的面积为1mm?,每个小方格的面积为1/400mm2o盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm,所以每个计数区的体积为0.1mm3,每个小

3、方格的体积为1/4000mm3o使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。已知：lent'体积二10mmX10mmX10mm=1000mm3所以：lmn?体积应含有小方格数为1000mm71/4000mm3-4X106个小方格，即系数K=4X106o因此：每ml菌悬液中含有细胞数二每个小格中细胞平均数(N)X系数(K)X菌液稀释倍数(d)三、实验器材1.活材料：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)斜面或培养液。1.器材：显微镜、血球计数板、盖玻片(22mmX

4、22mm)吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。1.视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到IO。，以每小格的菌数可数为度。2.取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。3.将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4.静置片刻，将血球计数板置载物台上

5、夹稳，先在低倍镜下找到计数区后,再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。5.计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央1个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。5.对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时,即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次(每次数值不应相差过大，否则应重新操作)，求出每

6、一个小格中细胞平均数(N),按公式计算出每ml(g)菌悬液所含酵母菌细胞数量。6.测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。五、实验作业：将实验结果填入下表中:计数次数每个中方格菌数稀释倍数试管斜面中的总菌数平均值12345第-次第二次实验七酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别一、目的要求学习并掌握形态观察及死活细胞的鉴别方法。二、基本原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比细菌大几十倍甚至几百倍。大多数以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖

7、是通过接合产生子囊抱子。本实验是通过負蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。.美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还£型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由書细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝市蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。OoScanningelectronmicrographofthecommonbaker'sandbrewer'syeastSaccharomycescerev

8、isiae.Notethebuddingdivisionandpreviousbudscars.三、操作程序1、菌种活化將酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜