细胞生物学综合性实验报告

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1、本科学生实验报告学号000000000姓名xxx学院生命科学学院专业、班级11级生物科学C班实验课程名称细胞生物学实验指导教师及职称吴暇玉开课时间2013至2014学年第一学期填报时间2013年12月1日云南师范大学教务处编印实验名称：人宫颈癌HeLa细胞的培养实验时间：星期二上午三、四节课小组合作：是一、实验预习1、实验目的（1)能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒；掌握湿热灭菌法的操作；(2)自学各类仪器用具清洗及各种消毒方法；(3)熟练掌握RPMI1640培养基的配制方法；(4)熟练掌握细胞传代培养的操作方法；(5)

2、观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况；(6)掌握死活细胞的鉴别原理及方法。2、实验设备及材料（一）仪器超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器、蒸馏水器、磁力搅拌器、天平、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、微量加样器（移液枪）、倒置显微镜、光学显微镜、细胞培养瓶、250ml和125ml试剂瓶、量筒、研钵、离心管、血球计数板、滴管（二）材料紫外灯、微孔滤膜（直径25mm）：孔径为0.22um、HeLa细胞株、pH试纸(三）试剂70%或75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、HCl、蒸馏水、0.4%台盼蓝溶液（生理盐水配制）等3、实验原理及实

3、验流程或装置示意图：（1）清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。（2）体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。（3）灭菌手段的选择也十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。（4）组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、

4、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等，是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。（5）传代培养(subculture):培养细胞的生存环境是瓶皿或其他容器，生存空间和营养是有限的，当细胞增殖到一定密度后，需要分离出一部分细胞并更新营养液，这一过程称为传代。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。（6）悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水

5、型恶性细胞等的培养。由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中，而不附着在固体表面上，因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段，其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大（7）悬浮型细胞传代培养的最大特点是原代细胞不必经过机械分离或消化酶消化处理，传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。因此，细胞在从原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少，损伤程度也较轻，相对而言，传代的成功率较高。（8）细胞的存活率

6、是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。其原理是：许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞内，却能渗入死亡的细胞内，使其着色，以次来区别死活细胞。3、实验方法步骤及注意事项：洗液的配制：成分强酸洗液次强酸洗液重铬酸钾6.3g12g浓硫酸100ml20ml蒸馏水20ml100ml配制方法：1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在磁力搅拌器上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。塑料制品的清洗：1）用洗涤剂清

7、洗，自来水冲洗数遍2）强（次强）酸洗液浸泡2~6h.3）自来水冲洗10次以上，蒸馏水刷洗10次4）浸泡在70%乙醇0.5~1h,备用。5）用前从乙醇中取出，在超级工作台内紫外线照射1h。配制100mlRPMI1640培养液：1）每组称取RPMI1640干粉1.04g，溶于100ml的3DW。2)置于搅拌器上搅拌40分钟，直到液体变为澄清为止。3)加入0.1ml1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。4)配制好的培养基，用时用饱和NaHCO3液调节PH至6.8-7.0。5)溶好以后的培养液在超净台中进行0.22u

8、m滤过除菌，分装至试剂瓶中。6)瓶口封好，-20℃或4℃贮存。RPMI1640生长培养基的配制50毫升储备液浓度终浓度RPMI1640培养液44.5——谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml双抗0.05100000u/ml100