细胞生物学实验报告-凝血

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1、细胞生物学实验报告——植物凝集素介导的细胞凝集反应山东大学细胞生物学实验报告植物凝集素介导的红细胞凝集反应姜政2012/10/6实验目的：观察凝血的过程和凝血后红细胞的聚集状态，理解细胞间凝集反应与细胞膜表面结构的关系，了解植物凝集素使红细胞凝集的基本原理和凝集素的应用领域。实验原理：凝集素（Lectins）是一种能与细胞膜表面糖蛋白寡糖链特异性结合的蛋白质，多数含糖，广泛存在于植物提取物、动物组织、各种微生物包括病毒中，其中以植物凝集素（Phytohemagglutinin，PHA）分离到的种类最

2、多。植物凝集素在植物体内主要参与防卫机制[1]，识别入侵微生物和愈合伤口，在豆类植物中，凝集素还与植物与特定固氮菌形成共生有关[2]；在体外，凝集素最典型的效应是引起细胞凝集。通常认为，凝集素介导细胞凝集的基本原理是：可溶性凝集素分子能与细胞膜表面的糖蛋白寡糖链特异性结合，使不同细胞的糖蛋白通过凝集素分子彼此连结，进而引起细胞间凝集（图1）。红细胞膜表面有大量糖蛋白，其中一些糖蛋白图1.凝集素介导的细胞与分子或细胞间相互作用模具有特异性，比如人类A型红细胞表面的α-N-乙型（引自Chapmanand

3、Hall1989）。酰-D-半乳糖胺和O型红细胞表面的α-L-海藻糖就A.同种细胞间相互作用。B.不同种细胞间相互作分别决定了人类的A血型和O血型[3]。本实验就用。在本实验中，土豆块茎凝集素介导的红细胞凝是利用植物凝集素与红细胞表面糖蛋白受体的特集属于A类中由上至下数第二种类型，即凝集素可异性结合实现红细胞凝集。溶，可以同时与两个红细胞表面的糖蛋白寡糖链结土豆块茎凝集素（potatotuberlectin）是一种合，在两个红细胞之间形成连接。能结合几丁质的富含羟脯氨酸的糖蛋白，单体分子量约50,0

4、00，包含至少三个不同的结构域，其中富含胱氨酸的区域与麦胚凝集素（wheatgermagglutinin，WGA）等几丁质结合蛋白具有同源性[1,4]。土豆凝集素含有50%（质量分数）的糖组分，其中90%是阿拉伯糖，另有少量半乳糖；最丰富的氨基酸是羟脯氨酸，其次是半胱氨酸。土豆凝集素在水溶液中主要以单体形式存在，能与细胞膜寡糖链上的N-乙酰葡萄糖胺特异性结合[5]，这是其具有凝集活性的主要原因。鉴于凝集素对糖蛋白的特异性结合，凝集素常被用于糖蛋白的分离、纯化，此外，一些凝集素还可诱导细胞分裂。在临床

5、医学领域，凝集素被广泛应用于血型鉴定，疾病诊断（如凝集素芯片）等。比如在动物体内，巨噬细胞表面凝集素对半乳糖和N-乙酰半乳糖胺的特异性结合使得巨噬细胞能特异性地区分肿瘤细胞和正常细胞并杀死肿瘤细胞[2]，利用巨噬细胞表面凝集素可以筛选肿瘤细胞。材料、试剂：兔血红细胞，土豆块茎粗提液（含土豆凝集素），PBS缓冲液，生理盐水实验方法：制备2%家兔红细胞悬液，与土豆块茎粗提液各一滴在双凹载玻片上混合，轻轻摇晃使细胞悬液与土豆提取液充分混匀，观察凝集情况。另以生理盐水在同一玻片上作阴性对照。1细胞生物学实验

6、报告——植物凝集素介导的细胞凝集反应实验结果：图2.土豆块茎粗提液与2%红细胞悬液等体积混合后红细胞的凝集现象。在3-5min时，实验组混合液中开始出现微小砂状凝集颗粒，8-10min时，小颗粒逐渐聚集形成较大的颗粒，此时凝集颗粒不再聚集，颗粒周围液体变为无色澄清。实验过程中以生理盐水与2%红细胞悬液等体积混合的对照组没有发生凝集现象。实验组对照组图3.凝集红细胞与对照组红细胞的聚集状态及形态。a.实验组发生完全凝集时红细胞的聚集状态（100×）b.对照组红细胞均匀散布（100×）c.实验组发生完全

7、凝集时红细胞的聚集形态（400×）d.对照组红细胞均匀散布（400×）注：d图对照组棘形红细胞是由实验中生理盐水水分蒸发形成高渗溶液造成的。2细胞生物学实验报告——植物凝集素介导的细胞凝集反应讨论：在植物凝集素介导的哺乳动物红细胞的凝集中，最常见的凝集素受体是具有N-乙酰葡萄糖胺残基的糖蛋白寡糖链。比如人类红细胞上一种能与植物凝集素强烈结合的寡糖链的结构是：2个甘露糖和一个N-乙酰葡萄糖胺构成与蛋白质丝氨酸残基相连的核心糖，核心糖之上有半乳糖-β-N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸-半乳糖-β-N-乙酰葡萄糖

8、胺两个非还原性末端分支[6]。多数情况下，可溶性凝集素与配体寡糖链的连接通过氢键相互作用，在其它情况下也存在疏水相互作用，静电相互作用和金属离子配位等连接方式[7]。虽然氢键键能比共价键键能弱很多，但由于红细胞表面的凝集素受体数量很大，细胞之间仍然能够形成牢固结合。比如扁豆凝集素（lensculinarisagglutinin，LCA）能与红细胞表面糖蛋白寡糖链上的N-乙酰葡萄糖胺和甘露糖特异性结合，而人类单个红细胞表面的扁豆凝集素受体分子数量大约为500,000个[