免疫实验报告-王鹏

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1、成绩：北京农学院研究生课程论文高级免疫学课程实验学生姓名王鹏学号201030311009系别动物科学技术学院专业基础兽医学任课教师李焕荣副教授2011年06月01日多克隆抗体的制备、蛋白质粗提及鉴定实验一多克隆抗体的制备一实验目的1．加深对抗体基本知识的了解。⒉了解多克隆抗体的制备方法。二实验原理1.抗原注入家兔体内后，由于是外源大分子物质，将充当抗原刺激免疫系统，由B细胞产生多克隆抗体。在实验中，抗原的纯度越高，越有利于实验。如果抗原同免疫佐剂一同注入，佐剂将加强抗原的刺激效果，使家兔表达更多的抗体，

2、其血清中的抗体浓度也会明显升高。佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，本次实验采用弗氏不完全佐剂，由羊毛脂与液体石蜡以1：1混合，再与抗原溶液以1：1混合，研磨后形成“油包水”剂，抗原浓度为1mg/ml，每次注入1ml。佐剂组与非佐剂组血清抗体效价的差别可以用ELISA检出。2.双向免疫扩散实验原理可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂凝胶层中从两个孔中向四周扩散，若两者分子比例适当，则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线。观察该白线出现的最大稀释倍数即是抗体的效价。3.ELISA原理（免

3、疫酶链反应吸附实验）该技术属于免疫酶技术。酶免疫技术是利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。4、抗原和抗体在体内外均可以发生特异性结合，在体外特异性结合后可出现用肉眼或仪器鉴定的现象，并根据结果对样品中的抗原或抗体能进行定性、定量、定位的检测。在进行抗原抗体反

4、应时，多采用人或动物的血清作为抗体来源。蛋白质抗原一般要求相对分子质量约在10000以上。一般而言，相对分子质量越大，结构越复杂，免疫原性越强。BSA的分子量约为67kDa，本实验以它为载体，与半抗原Hb和Dx偶联，可作为抗原刺激机体产生免疫应答。为获得高质量的免疫血清通常使用免疫佐剂，它可增强抗原的免疫原型，延长其在体内的存留时间，使初次反应和二次反应融合在一起，使机体的抗体水平持续上升达到理想效果。三实验材料1实验动物12周龄家兔（2.0kg左右）2主要仪器高速低温离心机酶标仪3试剂弗氏完全佐剂，弗

5、氏不完全佐剂HRP标记羊抗兔二抗1%明胶免疫原（Hb-BSA、Dx-BSA）、包被原（Hb-OVA、Dx-OVA）。4主要溶液配制包被液（0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液）：准确称取Na2CO31.59g,NaHCO32.93g，溶于950mL的蒸馏水中，调pH值为9.6，定容到1L。0.01mol/LPBS（pH7.4）:NaCl8gKH2PO40.2gNa2HPO4（无水）2.13gKCl0.2g37℃加热溶解后，定容至1000mL，121℃高压灭菌。洗涤液（0.01mol/LpH7.4的

6、PBST溶液）：1LPBS中加入0.5mLTween-20。封闭液（血清稀释液）：于PBST中加入明胶至终浓度为1%。终止液（2mol/LH2SO4）：分别取蒸馏水177.8mL和浓硫酸22.2mL混和即可。0.1mol/lpH6.0磷酸盐缓冲液（PB）：称取Na2HPO4·2H2O1.09g,NaH2PO4·H2O6.05g,蒸馏水溶解后定容至500ml，4℃贮存备用。TMB贮液:称取TMB10mg,溶于10ml二甲基亚砜中，4℃避光贮存备用。TMB应用液（底物）:1ml的0.1mol/lpH6.0磷

7、酸盐缓冲液，100ml的TMB贮液加15.l的30%H2O2，先用现配。饱和硫酸铵（SAS）：查硫酸铵饱和度表，配置不同饱和度的硫酸铵，热至50～60℃保温数分钟，趁热滤去沉淀，再在0℃或25℃下平衡1～2天。四试验步骤1针对Hb-BSA和Dx-OVA的多克隆抗体的制备5周龄大耳白兔，Hb-BSA和Hb-BSA分别用无菌生理盐水配成2mg/ml溶液。取上述溶液和等量的福氏完全佐剂混合并充分乳化后作为免疫抗原，试验组每只每次注射1ml乳化好的抗原，首次颈背部多点皮内免疫。第二次以BSA溶液和等量福氏不完全

8、佐剂混合并充分乳化作为免疫抗原皮下免疫一次。第2次免疫7d后耳缘颈脉采血，间接ELISA方法检测效价，若没达到要求则重复一次第2次免疫操作；若达到要求，则以0.1mg/ml的1mlHb-BSA或Dx-BSA溶液（不加佐剂）皮下加强免疫，分三次注射，每次间隔15min。一周后心脏采血，分离血清，4℃保存备用。2间接ELISA方法检测多抗效价将抗血清从1：100倍比稀释至1：6400检测其效价。ELISA操作步骤：1）将Hb-OVA和Dx-OV