探究偶氮还原酶azr的结构模型与功能研究

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1、大连理工大学博士学位论文偶氮还原酶AZR的结构模型与功能研究姓名：柳广飞申请学位级别：博士专业：环境工程指导教师：周集体20090701大连理工大学博士学位论文摘要近年来偶氮染料的生物降解受到广泛关注，国内外学者陆续分离并考察了众多可脱色偶氮染料的微生物，纯化并研究了多种具有偶氮还原酶活性的蛋白质，但对于偶氮还原酶的结构与功能缺乏深入认识。本论文对细菌脱色偶氮染料的能力，细菌FMN依赖型偶氮还原酶的结构模型与功能等展开研究。考察沼泽红假单胞菌RhodopseudomonaspalustrisASl．2352细胞及其细胞提

2、取物脱色偶氮染料的能力。对于生长过程中的足palustrisASl．2352，在静置缺氧条件下，可在17h内脱色80％以上活性艳红X．3B(50mgL。1)。细菌在30．35oC和pH6-9具有较高脱色能力。脱色速率与染料初始浓度间可用米门方程描述，‰和‰分别为65mggcellJh以和978mgL～。其细胞提取物具有偶氮还原酶活性，脱色速率远高于未破碎的细菌细胞。对比考察两株光合细菌RhodobactersphaeroidesASl．1737，R．palustrisASl．2352和基因工程菌Escherichiaco

3、liYB静止期早期细胞脱色含磺酸取代基的偶氮染料的能力。光合细菌表现出较基因工程菌更强的脱色能力。R．sphaeroidesASl．1737，R．palustrisASl．2352和EcoliYB的‰√‰值分别为0．2，0．15和O．06Lgcelldh一。两株光合细菌具有较好的脱色混合染料的能力，EcoliYB脱色混合染料的效果不佳。利用同源建模方法建立了R．sphaeroidesASl．1737的偶氮还原酶AZR的结构模型。AZR的单体具有类似黄素氧化还原蛋白的甜D型结构，五个相互平行的p．折叠位于分子中央形成一个平

4、面，五个a．螺旋分别位于平面两侧，一侧两个，另一侧三个；分子中结合的FMN辅基可能作为氧化还原反应中电子传递的中介。尽管依序列可将FMN依赖型偶氮还原酶归为两个家族，但它们的单体都具有类似黄素氧化还原蛋白的三级结构。利用NAD(P)H提供电子，AZR可还原多种硝基化合物。以硝基呋喃为底物，AZR硝基还原酶的最适pH=7，最适温度为50oC。NADPH为更适合的辅酶，反应遵循双底物乒乓动力学机理。比较AZR对2，4，6．三硝基甲苯(TNT)、2，4．二硝基甲苯(2，4．DNT)、2，6．二硝基甲苯(2,6．DNT)等几种多

5、硝基取代甲苯的还原发现，n汀为最适底物；2，4．DNT比2。6．DNT更适合降解。经HPLC／MS检测，TNT的还原产物可能为羟胺二硝基甲苯。AZR能遵循双底物乒乓动力学机理还原外加FMN。NADPH和FMN的米氏常数分别为O．5和14．2mM，‰为172．41．tmolmgprotein。1min一；外加FMN抑制AZR的偶氮还原酶和硝基还原酶活性，是NADPH、甲基红和硝基呋喃的竞争性抑制剂，抑制常数肠分别为1．7、2．3和6．4¨M。AZR具有广泛的底物范围，不但可以还原偶氮化合物、硝基化合物和FMN等有机物，还可

6、以还原铁氰化钾和重铬酸钾等无机底物，是一种新的硝基／FMN还原酶家族的成员。偶氮还原酶AZR的结构与功能研究在序列对齐分析和结构模型分析的基础上，选择AZR分子中FMN辅基附近两个环状结构中的Tyr74、His75和Lysl09等氨基酸位点，利用多次PCR的方法进行了K109A，K109H，Y74W和H75N等定点突变研究。利用Ecoli异源表达并纯化几种突变型AZR。对比考察野生型与突变型AZR的活性。以酸性红B为底物，野生型AZR的最适pH为7．8，K109H和H75N的最适pH=6，而K109A和Y74W的最适pH

7、=9。突变的引入可能改变了AZR分子表面的电荷情况，从而改变了其最适pH。与野生型AZR相比，几种突变型AZR的酶活都出现下降，表明Y74、H75和K啪对酶活有重要影响。分析底物结合常数表明，Y74W和H75N突变对NADPH的结合无影响，而只影响AZR对甲基红和硝基呋喃的结合：H75N突变后AZR完全丧失硝基还原酶活性。第109位氨基酸荷正电对甲基红的结合有重要影响，而对硝基呋喃的结合无影响；K109H对NADPH的结合并非保守突变，其结合不仅需要该处荷正电，可能还与空间结构有关。K删可能只参与对NADPH的2’．磷酸

8、基团的结合，而对NADH的结合无影响。自然界中天然存在的偶氮类和硝基类芳香化合物并不常见，因此还原酶AZR可能具有其他功能。醌类化合物广泛存在于自然界和各种生物体的代谢过程中。AZR与来自不同域的醌还原酶的氨基酸序列中都较为保守地存在一段40．50个氨基酸构成的参与结合底物与辅酶的序列。AZR与醌还原酶NQ01的单体