绵羊甲状腺中褪黑素的合成及其生理作用的研究

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1、分类号：密级：学号:2012108006单位代码：10759石河子大学硝士#佐讼忒绵羊甲状腺中褪黑素的合成及其生理作用的研究学位申请人______________欧科鹏_________指导教师刘小军教授申请学位门类级别_____________农学硕士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物遗传资源利用与分子育种所在学院动物科技学院中国•新疆•石河子2015年6月分类号：密级：学号:2012108006单位代码：10759石河子大学硕士学位论文绵羊甲状腺中褪黑素的合成及其生理作用的研究学位申请人欧科鹏指导教师刘小军教

2、授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称动物遗传育种与繁殖研究方向动物遗传资源利用与分子育种所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月AutonomicBiosynthesisandFunctionalCharacteristicsofMelatonininThyroidinSheepADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByKep

3、engOu(AnimalGenetics)DissertationSupervisor:Prof.XiaojunLiuJune,2015Shihezi,Xinjiang,China摘要褪黑素（MEL）和甲状腺素（TH）是绵羊季节性繁殖调控通路中的两个重要激素。MEL主要由松果体合成并分泌，在其过程中，5-羟色胺-N-乙酰基转移酶（AA-NAT）和羟基吲哚-氧-甲基转移酶（HIOMT）是其最关键的两个酶。AA-NAT是合成过程中的限速酶，而HIOMT是全部过程中的关键酶。TH则来自于甲状腺的合成与分泌，并受促甲状腺素释放激素

4、（TRH），促甲状腺素（TSH）的调控。最近在实验动物小鼠的研究中证实，甲状腺存在有合成MEL所必须的AA-NAT和HIOMT两个关键酶，并分布有褪黑素受体（MT1）。同时，在人和小鼠的甲状腺存在TRH及受体（TRHR），以及促甲状腺素β亚基（TSH-β）的剪接变体，暗示甲状腺本身可能存在对TH分泌自主调节的机制以及甲状腺合成的MEL可能参与了TH的合成调节。为了研究绵羊甲状腺能否通过MEL自主调控TH的合成，进而影响绵羊季节性繁殖，开展如下研究：1、利用RT-PCR技术检测MEL合成的关键酶基因AA-NAT和HIOMT，

5、以及MT1和调控TH合成的相关基因TRH，TRHR，TSH-β，TSHR是否在绵羊甲状腺表达。在mRNA水平确定绵羊甲状腺能否自主合成且分泌MEL，并参与调控TH合成。结果表明：绵羊甲状腺表达MEL合成的关键酶基因和MEL受体基因，以及调控TH合成的基因TRH，TRHR和TSHR，但不表达TSH-β基因。2、通过双酶常规消化并分离得到甲状腺滤泡细胞，结合RT-PCR、细胞免疫荧光和ELISA技术，对培养的绵羊甲状腺细胞从形态，甲状腺特异性基因mRNA和蛋白的表达以及甲状腺素T3/T4的合成与分泌功能等方面进行鉴定，确定所培

6、养的原代细胞功能完整性，建立绵羊甲状腺原代细胞培养体系。结果表明：成功地建立了简便可行的绵羊甲状腺细胞的原代培养方法。为深入研究绵羊甲状腺的功能提供了实验平台。3、采用组织免疫荧光，Westernblot，ELISA等技术，验证绵羊甲状腺组织中MEL合成的关键酶基因AA-NAT、HIOMT以及MT1的表达，进而利用体外培养的细胞，在细胞水平验证绵羊甲状腺能否自主合成并分泌MEL，为进一步研究绵羊甲状腺自身合成并分泌的MEL与TH合成的关系打下基础。结果表明：绵羊甲状腺具有自主合成并分泌MEL的功能，绵羊甲状腺内部可能存在有

7、通过MEL调控TH合成的新通路。4、运用组织免疫荧光，ELISA，qPCR技术，检测外培养的绵羊甲状腺原代细胞中TSH-β蛋白的表达，并用外源MEL对体外培养的绵羊甲状腺原代细胞进行处理，检测细胞培养基中T3/T4的水平和甲状腺细胞TPO的表达量。确定绵羊甲状腺自主合成并分泌的MEL是否调控TH的合成。结果表明：绵羊甲状腺组织不表达TSH-β蛋白，自主合成并分泌的MEL在体外细胞水平与TH的合成之间没有关联，但是在外源MEL的刺激下，TPO的相对表达量与对照组差异显著，表明MEL可能参与到甲状腺滤泡细胞的抗氧化过程。I综上

8、所述，我们的研究表明，绵羊甲状腺能够自主合成并分泌MEL，但绵羊甲状腺只部分表达通过MEL通路调控TH合成的相关基因，因此，甲状腺中合成的MEL可能不直接参与调控TH合成。但在外源MEL的刺激下，TPO的表达量增加，表明甲状腺自身合成并分泌的MEL可能参与到甲状腺细胞的抗氧化作用。甲状腺中合成的MEL是