转植酸酶基因玉米的获得及后代鉴定分析

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1、分类号：Q5单位代码：10193密级：公开学号：2012211硕士学位论文转植酸酶基因玉米的获得及后代鉴定分析ObtentionofTransgenicPhytaseGeneMaizeandProgenytestAnalysis作者姓名：赵邯郸学位类别：理学硕士专业名称：生物化学与分子生物学研究方向：植物分子生物学与基因工程指导教师：关淑艳教授所在学院：生命科学学院2015年6月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林

2、农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）

3、吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月摘要玉米是重要的经济农作物，在各个领域都被广泛应用，对发展国民经济有着巨大的推动作用。如今玉米育种研究的重要内容之一就是利用基因工程技术进行玉米品质改良和提高产量，应用此技术不仅缩短了育种周期，还可以避免种质间远缘杂交不亲和的问题，是一种非常有效的育种途径。植酸酶是一种具有特殊的空间结构并且

4、能够对植酸和植酸盐进行催化作用，使其水解成磷酸（盐）和肌醇的一类酶的总称，可以有效水解植酸态和磷脂态的有机磷，并释放出无机磷。植物生长需要众多大量元素，土壤能够在很大程度上满足植物所需元素的供给，作为必需元素的磷在土壤中绝大部分是以有机态磷形式存在，植酸盐占50%以上，植物无法直接对其吸收利用，植酸酶基因可以使土壤中植酸盐水解成为无机磷、肌醇以及一些微量元素，能够直接将其吸收并利用。通过基因工程手段将植酸酶基因导入玉米中，可以直接吸收并利用土壤中将有机磷水解之后的无机磷，这不仅可以提高玉米利用土壤磷素的效率，改善玉米的生长状态，并且能够提高玉米的产量，促进我国玉米产业的快速发展。

5、本研究主要是将含有根部特异启动子和植酸酶基因（phyA）的植物表达载体转入玉米自交系，利用根部分泌出的植酸酶，使土壤中的有机磷发生降解，促进玉米吸收土壤中磷的能力，创制磷高效吸收利用的玉米新种质。该研究利用pCAMBIA1301-ZmGLU1P-phyA-Nos-BADH植物表达载体对玉米自交系H99进行了遗传转化，对pCAMBIA1301-ZmGLU1P-phyA-Nos-bar植物表达载体遗传转化得到的T3、T4代植株进行了鉴定分析，取得的结果如下所示：1.利用农杆菌介导法将植物表达载体pCAMBIA1301-ZmGLU1P-phyA-Nos-BADH转入玉米自交系H99中，

6、通过对愈伤组织NaCl筛选压的确定，获得转化玉米植株。提取转化植株的叶片总DNA，并以其作为模板，用以phyA基因序列设计好的特异引物，对T0代植株进行PCR检测，检测结果有7株T0代植株为阳性植株，使其自交并收获T1代种子。2.将实验室保存的含有phyA基因和抗除草剂基因的转基因玉米T3代种子在转基因试验田种植，通过对T3代植株的PCR检测获得147株T3代阳性植株，然后对T3代植株进行自交得到T4代种子147穗。3.将T4代转植酸酶基因玉米（Bar筛选）种子在转基因试验田种植，对T4代植株进行PCR检测及荧光定量分析检测，获得160株T4代阳性植株（来自T3代97株阳性植株）

7、。对PCR检测为阳性的T4代植株进行Southern杂交分析，结果证明了植酸酶基因整合到T4代植株基因组中。利用偏钒酸铵法对经Southern杂交检测为阳性的T4代植株根部植酸酶I活性进行测定，其测定结果显示，转植酸酶基因玉米根系的植酸酶活性与对照植株相比均有极显著（P>0.05）提高，平均比对照植株提高了10.9倍，活性最高的达到5.432U/g。4.利用Bowman-Cole法对检测为阳性的T4代转植酸酶基因玉米（Bar筛选）植株根际土壤进行土壤有机磷组分测定，并用未转化植株