葡萄霜霉病抗性基因mrrpv1结构域及霜霉菌效应分子功能研究

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1、分类号：单位代码：密级学号：盡十犬令学位论文葡萄霜霉病抗性基因结构域及霜霉菌效应分子功能研究研宄生：尹玲指导教师：卢江教授合作指导教师：研究员张雅丽副教授申请学位门类级别工学博士专业名称食品生物技术研宄方向葡萄功能基因组学所在学院食品科学与营养工程学院二零一五年六月分类号：单位代码：密级学号：犬令学位论文葡萄霜霉病抗性基因结构域及霜霉菌效应分子功能研究研究生：尹玲指导教师：卢江教授合作指导教师：研究员张雅丽副教授申请学位门类级别：工学博士专业名称：食品生物技术研究方向：葡萄功能基因组学所在学院：食品科学与营养工程学院独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在

2、导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中已经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：时间：年〈月关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士

3、学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。保密的学位论文在解密后雌守此协议）学位论文作者签名时间：年月厶曰导师签名时间：丨年《月”本研究为国家农业产业技术体系建设专项资金项目和中央高校基本科研业务费专项资金项目的部分研究内容縮略语及中英文对照英文缩写英文名称中文名称抗病基因数量性状位点霜霉菌抗性抗性基因类似物模式识别受体微生物（病原）相关分子模式微生物（病原）相关分子模式引起的免疫效应因子触发的免疫丝裂原活化蛋白激酶受体富含亮氨酸的重复酵母双杂交接种后小时数葡萄糖醛酸酶苄基腺嘌呤萘乙酸萘氧乙酸生长素或吲哚乙酸乙二胺四乙酸

4、细胞程序化死亡摘要由葡萄霜霉菌引起的葡萄霜霉病，是威胁葡萄与葡萄酒产业的一大卵菌病害。基因是第一个被克隆的霜霉病抗性基因，该基因编码的抗性蛋白为典型的类型。研究各结构域的功能和互作蛋白，以及霜霉菌在与寄主亲和互作过程中分泌的效应蛋白，对于明确霜霉病抗性机理以及霜霉菌的致病机理具有重要的意义。首先，本研究利用蛋白截短技术和点突变技术对葡萄霜霉病抗性蛋白的结构域进行了边界界定和功能探究。烟草瞬时表达结果显示，是的具有活性的最小结构域片段，该片段包含来自第二个外显子的前个氨基酸和完整的螺旋结构。定点突变结果显示，突变高度保守的氨基酸位点会阻断结构域介导的信号传导。为

5、了明确结构域对葡萄霜霉特异性识别的影响，本研究将葡萄霜霉病抗性基因和白粉病抗性基因的结构域互换，构建重组表达载体，并成功转化欧亚种葡萄西拉’的体胚系，观察转基因植株对不同病害的抗性。室内接种实验结果显示，植株表现出与转基因苗—致的坏死斑点，所有阳性的转基因系均未观察到坏死斑，转基因植株每个叶盘上的霜霉菌孢子囊数与‘西拉’相比都有显著性降低。和两个株系表现出对白粉病的抗性，这说明，互换后的结构域在一定程度上起到了病原菌识别的作用。本研究构建了融合蛋白，通过融合报告基因定位法发现定位在细胞核和细胞质中。抑制实验发现，受到抑制后，叶片霜霉病的抗性也消失；双分子荧光实

6、验发现与共转化可以在洋葱表皮细胞内观察到荧光。因此我们推测介导的葡萄霜霉病抗性依赖于和的参与。通过转录组从头组装，利用生物信息学手段和卵菌效应蛋白的保守模块结构，本研究从霜霉菌转录组中挖掘出个类效应蛋白和个类效应蛋白。并通过结构域扫描对其分泌组进行分析，发现其分泌组中存在一些激发子，坏死诱导蛋白，泛素连接酶，糖苷水解酶等与致病相关的因子。选取了霜霉菌侵染欧亚种‘赤霞珠’叶片的过程中表达量最高的一个类效应蛋白进行深入的研究发现，该蛋白可以抑制小鼠蛋白或疫霉引起的烟草叶片细胞坏死反应。利用该效应蛋白作为诱饵，筛选利用霜霉菌侵染早期的‘赤霞珠’叶片文库，发现该蛋白可

7、以与碳酸酐酶和活性氧增强子蛋白互作。关键词：葡萄霜霉病，抗病基因，结构域，结构域，效应蛋白AbstractGrapedownymildew，目录葡萄霜霄菌不同葡萄对霜霉病的抗性葡萄霜霉病抗性研究进展植物的免疫系统秘植物抗病基因的研究进展植物抗病基因种类抗病基因结构域功能研究进展抗病基因结构域的功能及研究进展⋯⋯⋯基因抗性信号转导通路相关基因的研究进展植物病原卵菌效应因子植物病原卵菌效应因子的挖掘卵菌效应蛋白转运机制研究进展卵菌效应蛋白的寄主靶标研究进展本研究的目的和意义第二章蛋白结构域信号转导功能研究引言材料与方法菌株与质粒实验仪器与设备酶及主要的实验试剂常用

8、培养基与溶液配置实验方法引物设计、扩增