氨基葡萄糖阳离子脂质体基因载体的合成和性能研究

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1、硕士学位论文氨基葡萄糖阳离子脂质体基因载体的合成和性能研究学科专业有机化学学位类型□√科学学位□专业学位研究生姓名彭嘉勋导师姓名、职称曾佑林副教授论文编号湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一五年五月湖南师范大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体臣经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中臥明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结栗由本人承捏。－＊又／＾／学位论文作者签名：５年月Ｉ曰湖南师范大学学位论文版权使用

2、授权书、使用学位论文的规定本学位论文作者完全了解学校有关保留，研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查网和借闕。本人授权湖南师范大学可秋将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｌ义采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于１、保密□。，在年解密后遁用本授权书２、不保密＂。／（请在Ｌ乂上相应方框内抒ｖ）Ｗ６作者签名日期：ｊ：：吹年月日导师签省：曰期：月曰碟糾产６！！分类号密级学校代码10542学号20120212

3、1002氨基葡萄糖阳离子脂质体基因载体的合成和性能研究Synthesisandpropertiesofglucosamine-basedcationicliposomesforgenedelivery研究生姓名彭嘉勋指导教师姓名、职称曾佑林副教授学科专业有机化学研究方向有机合成湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一五年五月摘要基因治疗的核心是设计一类高效、安全的基因载体。作为非病毒载体的一类，阳离子脂质体可与核酸药物静电吸引形成复合物，它与细胞膜的磷脂分子相互作用而附着在其表面，随着细胞膜的内陷，复合物进入细胞并且释放核酸药物至细胞核。糖化学是生物化学的一个重要分支。糖类化合物承载了大量生物分

4、子信息，在生命有机体中扮演重要角色，如识别和调控生物分子、确定生物分子的表面形貌和提供能量等。因此，研究具有生物活性的糖类化合物对于生物结构关系的认知显得尤为重要。本论文设计了两个系列氨基葡萄糖阳离子脂质体。一类以氨基葡萄糖盐酸盐为原料，通过全乙酰化、脱1-O-乙酰基、三氯乙酰亚胺酯化、糖苷化、叠氮化、脱全部乙酰基、4,6-O-异丙叉基保护、苄氧基保护、脱异丙叉基、醚化、还原氨化和季铵盐化反应，合成不同疏水链长度的一系列氨基葡萄糖阳离子脂质体：di-C12-GluNAc-TMA、di-C14-GluNAc-TMA、di-C16-GluNAc-TMA和di-C18-GluNAc-TMA；另一类以

5、氨基葡萄糖盐酸盐为原料，通过全乙酰化、脱1-O-乙酰基、三氯乙酰亚胺酯化、糖苷化、叠氮化、脱全部乙酰基、还原氨化、叔胺化和季铵盐化反应，合成不同疏水链长度和不同物理结构的一系列氨基葡萄糖阳离子脂质体：GluNAc-DiC12MA、GluNAc-DiC14MA、GluNAc-DiC16MA和GluNAc-DiC18MA。通过ZetasizerNanoZS激光粒度仪激光粒度仪测试了阳离子脂I质体和脂质体/DNA二元复合物的Zeta电势、粒径和PDI；凝胶阻滞实验检测了阳离子脂质体缩合质粒DNA的能力。原子力显微镜表征了阳离子脂质体及二元复合物的表面形貌。激光粒度仪数据显示di-C18-GluNAc

6、-TMA平均粒径为182.4nm，大于其他阳离子脂质体纳米颗粒尺寸，分散系数（PDI）为0.43，粒径分布不够均一；其他七种阳离子脂质体的粒径范围是80-150nm，脂质体对应复合物的粒径范围在65-140nm；阳离子脂质体的Zeta电势在38-60mV之间，复合物的电势在0.5-28mV之间。这些数据表明脂质体及复合物的粒径和Zeta电势适宜，符合体外转染实验的要求。凝胶电泳实验证明阳离子脂质体有能力与DNA分子结合。当脂质体的量增多时，DNA轨道的亮度减弱，当N/P为3时，两类阳离子脂质体与DNA分子结合完全。原子力显微镜结果表明单一脂质体及脂质体/DNA复合物呈圆球状、尺寸分布均一、表面

7、光滑且直径略大于脂质体。核磁共振仪的图谱结果证明阳离子脂质体的化学结构符合预期的设计。以上述两类所合成的氨基葡萄糖阳离子脂质体作为基因载体，检测它们携带质粒DNA进入HEK293细胞系的转染性能。经24小时的细胞培养后，通过观察绿色荧光蛋白的表达和细胞计数的方法评价阳离子脂质体的转染效率。体外转染实验结果说明：di-C12-GluNAc-TMA、di-C14-GluNAc-TMA、di-C16-G