拟南芥t1n6_22基因抗灰霉病的分子机制研究

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文拟南芥T1N6—22基因抗灰霉病的分子机制研究学位申请人：蒋深茵指导教师：邢继红教授•、董金皋教授学科专业：生物化学与分子生物学学位类别：理学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二零一五年五月三十一日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包禽为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本

2、研究所做的任何贡献均已在论文中作丫明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名签字日期：年月曰学位论文版权使用授权书本受仿论卞作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定’有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。木人抟权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：爲*师签名：签字日期：艾年了月七I日签字日期：年厂月v日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：由M:通讯地址

3、:分类号：Q945.8单位代码：10086密级：公开学号：2012063拟南芥T1N6_22基因抗灰霉病的分子机制研究MolecularmechanismofT1N6_22fromArabidopsisthalianaagainstBotrytiscinerea学位申请人：蒋琛茜指导教师：邢继红教授董金皋教授学科专业：生物化学与分子生物学学位类别：理学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二零一五年五月三十一日摘要蔬菜灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytiscinerea）引起的一种极为严重的世界性病害。利用分子和基因工程的手段，发掘植物抗灰霉

4、病的相关基因，继而研究其抗病机制，以此培育蔬菜抗病品种，是非常重要和有效的途径。本实验室前期获得了1株对灰葡萄孢敏感的拟南芥突变体，确定了其突变基因为T1N6_22，通过Real-TimePCR、RT-PCR技术和互补回复试验，明确了T1N6_22为抗B.cinerea的正调控因子和抗PstDC3000（Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000）的负调控因子，确定了其通过SA和JA两条信号途径来影响拟南芥的抗病性。本研究通过RT-PCR技术，确定了T1N6_22在不同组织部位和不同生长时期的表达规律；通过检测T

5、1N6_22与SA和JA途径关键基因的双突变体接种B.cinerea和PstDC3000后，SA、JA途径关键基因ICS1、PR1、JAR1及PDF1.2基因的表达情况，确定了T1N6_22基因与SA和JA信号途径的关系；利用GFP瞬时表达技术，确定了T1N6_22基因的亚细胞定位；利用GUS染色技术，确定了T1N6_22基因的组织定位；利用原核表达技术，获得了纯化的T1N6_22蛋白。研究结果为进一步阐明T1N6_22基因在拟南芥抗灰霉病中的分子机制及抗病育种奠定了基础。1.利用RT-PCR技术，分析T1N6_22基因在拟南芥野生型的莲

6、座叶、茎生叶、花、种荚、茎和根中的表达情况。结果发现，拟南芥野生型的莲座叶、茎生叶、花、茎和根中T1N6_22基因的表达水平比较相近，在花、茎和根的表达水平相对较高，在种荚中的表达水平最低。利用RT-PCR技术，检测生长7d、14d、21d、28d、35d的拟南芥野生型中T1N6_22基因的表达情况。结果发现，拟南芥野生型在生长前3周，T1N6_22基因的表达水平呈上升趋势，3周后下降，5周时表达水平明显降低。2.将t1n6_22突变体与SA、JA途径关键基因突变体NahG、eds5和jar1进行杂交，获得了双突变体t1n6_22/Nah

7、G、t1n6_22/eds5和t1n6_22/jar1。对所获得的双突变体和野生型拟南芥接种灰葡萄孢B.cinerea和PstDC3000后进行抗病性分析，发现野生型拟南芥表现出典型的抗病反应，双突变体在接种后叶片出现水渍状感病症状；利用RT-PCR技术，检测接种灰葡萄孢的叶片中BcACTIN基因的表达情况，发现双突变体中的BcACTIN基因表达水平明显高于野生型，表明双突变体对灰葡萄孢的敏感性较野生型明显增强。将PstDC3000接种于拟南芥野生型和双突变体t1n6_22/eds5、t1n6_22/NahG和t1n6_22/jar1发现

8、，野生型与双突变体t1n6_22/eds5、t1n6_22/NahG及t1n6_22/jar1均出现了叶片萎蔫卷曲等感病症状，接种叶片中cfu值测定结果显示双突变体对PstDC3000的敏感性