拟南芥atpub19响应干旱胁迫分子机制的研究

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1、分类号：密级：请注明密级及保密期限学号：2009207010单位代码：10759石河子大学博士学位论文拟南芥AtPUB19响应干旱胁迫分子机制的研究学位申请人刘永昌孙杰教授指导教师谢旗研究员吴耀荣副研究员申请学位门类级别农学博士学科、专业名称作物遗传育种植物重要农艺性状基因研究方向克隆与功能研究所在学院农学院中国.新疆.石河子2012年6月StudyonthemolecularmechanismofAtPUB19involvedinresponsetodroughtstressinArabidopsisADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPar

2、tialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofAgricultureByLiuYong-chang(CropBreedingandGenetics)DissertationSupervisor:Prof.SunJieProf.XieQiAssociateProf.WuYao-rongJune,2012石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要

3、贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日拟南芥AtPUB19响应干旱胁迫分子机制的研究摘要1.研究目的植物作为固着生长的生命体，无时无刻不受到外界环境的影响，当环境不适合植物生长和发育时就会对其产生胁迫。胁迫主

4、要分为生物胁迫和非生物胁迫两种，其中非生物胁迫是导致粮食作物减产的重要原因。干旱是最重要的非生物胁迫之一，每年全世界主要粮食作物减产的50%都是由干旱胁迫造成的。随着干旱和半干旱地区面积的增加、全球气候的变暖及水资源的短缺等问题日益严重，干旱胁迫的危害越来越大。因此鉴定干旱胁迫相关的基因并研究其功能具有非常重要的理论意义和应用价值。植物在应对非生物胁迫过程中会启动或调节很多相关基因的表达。除了从转录水平调节胁迫相关基因的表达以外，蛋白翻译后的修饰在这一过程中也起了关键作用。泛素化作为一种重要的蛋白翻译后的修饰方式，在高等植物中参与了很多细胞学过程，包括细胞周期、光周期、激素、信号转导、新陈代谢

5、和DNA修复及植物应对胁迫的反应。数量众多的泛素连接酶决定了底物特异性。U-box泛素连接酶是最近发现的一类具有泛素连接酶活性的E3，也是泛素/蛋白酶体系统（Ubiquitin/proteasomesystem）的重要组分。我们对现有的芯片数据库进行大规模的分析及筛选，试图寻找参与胁迫响应过程的RING或U-box类型的泛素连接酶。2.研究方法与结果通过筛选发现At1g60190的表达受到多种非生物胁迫和ABA诱导。在正常条件下，我们没有检测到AtPUB19的转录产物，但干旱、高盐、冷和ABA诱导后，表达量明显升高。通过Northernblot检测该基因在不同组织中表达情况，结果发现AtPUB

6、19在幼苗中没有表达；在根、花和角果中有微弱的表达，在茎和叶片中表达都比较高。AtPUB19基因启动子驱动GUS基因表达结果再次验证了Northernblot的结果，更详细的组织表达模式分析发现该基因在花药及角果的顶端中有较高的表达。进一步对其编码的蛋白进行分析发现，AtPUB19编码一个U-box类型的泛素连接酶，即PlantU-boxProtein19（PUB19）。体外泛素连接酶活性检测实验证明AtPUB19具有泛素连接酶活性。为了研究AtPUB19的亚细胞定位，我们在AtPUB19的N端融合了绿色荧光蛋白（GFP）。利用烟草瞬时表达的方法表达GFP-AtPUB19融合蛋白，荧光共聚焦显

7、微镜观察发现绿色荧光信号位于细胞周围，呈现不规则分布；在原生质体中表达GFP-AtPUB19也可以得到同样的结果。为了进一步研究该蛋白在细胞内的分布情况，我们进行了细胞组分分离和Westernblot实验，利用GFP的抗体检测蛋白信号。结果显示在总蛋白、膜组分及加入破膜剂后的可溶组分中检测到目的蛋白，在可溶组分及加入破膜剂后的沉淀中检测不到该蛋白信号，说明AtPUB19是一个膜相关的蛋白。为了进一