乌头类中药复方中化学成分吸收转运机制的体外研究

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1、乌头类中药复方中化学成分吸收转运机制的体外研究InVitroStudiesonMechanismsofIntestinalTransportofChemicalConstituentsinTraditionalChineseFormulawithAconitumcarmichaeliiDebx.作者姓名：阚鸿专业名称：药物分析研究方向：药物分子与生物分子相互作用研究指导教师：刘忠英教授学位类别：医学博士培养单位：吉林大学药学院论文答辩日期：2015年5月26日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位周余来

2、教授吉林大学主席周义发教授东北师范大学崔勐研究员长春应用化学研究所委员宋凤瑞研究员长春应用化学研究所黄百渠教授东北师范大学刘志强研究员长春应用化学研究所孟繁浩教授中国医科大学李平亚教授吉林大学魏尔清教授浙江大学刘忠英教授吉林大学中文摘要乌头类中药复方中化学成分吸收转运机制的体外研究中药复方是中医理论的重要组成部分，但由于中药复方组成多样，成分复杂，缺乏现代科学技术的分析与理论佐证，成为中医药理论传承和发展的障碍，因此利用现代分析检测技术，对中药复方中化学成分及其吸收转运进行系统研究，对促进中药的世界化与现代化进程极为重要。本文运用高效液相色谱联

3、用质谱技术，对治疗风湿、类风湿性关节炎的经典中药复方“甘草附子汤”（甘草、黑顺片、白术、桂枝）和“乌头汤”（制川乌、甘草、白芍、麻黄、黄芪）的化学成分进行分析，同时对两个复方中主要成分的体外吸收转运过程进行深入研究。研究内容主要包括以下几个方面：1.“甘草附子汤”的化学成分鉴定建立了UPLC-Q-TOF（高效液相色谱联用四级杆飞行质谱）分别在正、负离子模式下测定“甘草附子汤”全方水煎液的分析方法，共检测到72个化合物，E通过精确分子量（误差小于15ppm）及MS二级串联质谱得到“甘草附子汤”中各化学成分的离子碎片，结合相关文献报道的碎裂规律及标

4、准品的质谱数据，对各化合物进行归属鉴定，鉴定出黄酮类化合物17个，三萜皂苷类化合物13个，生物碱类化合物25个，酚酸类化合物4个，内酯类化合物1个，尚未明确鉴定的化合物12个。其中黄酮和三萜皂苷类化合物主要来源于甘草，生物碱类化合物主要来源于黑顺片，酚酸类化合物主要来源于桂枝，内酯类化合物主要来源于白术。上述研究结果为“甘草附子汤”复方中主要成分的体外吸收转运机制研究奠定了基础。2.“甘草附子汤”的黄酮类化学成分研究从“甘草附子汤”中单味药、药对及全方制剂中提取出黄酮组分，分别采用紫外分光光度计法和HPLC-MS法对各组黄酮提取液中的化学成分的

5、含量变化进行研究。由于液质联用检测黄酮成分均来源于甘草，因此对“甘草附子汤”中黄酮类成分的研究主要集中在甘草中黄酮类成分的变化。研究结果表明，白术与甘草共煎时，白术可促进甘草中黄酮类化合物的析出，白术与甘草共煎的药渣提取液中较甘草药渣提取液中甘草苷的含量降低说明共煎中白术已充分促进甘草中的黄酮类成分的析出；与甘草单煎液比较，黑顺片与甘草共煎后，甘草苷的含量I减少，二者药渣提取液中的甘草苷也有所降低，说明黑顺片具有减少黄酮类化合物含量的作用；桂枝与甘草共煎后，减少了甘草苷的含量，在二者共煎的药渣提取液中甘草苷的含量却有所增加，表明桂枝在共煎过程中

6、抑制了甘草苷的析出。对比单煎液、药对及全方的黄酮提取液中各化合物的HPLC色谱峰峰面积可以看出，“甘草附子汤”各药材间可协同促进黄酮类有效成分的含量增加，该结果为阐明复方中各味药材配伍后相互作用机理提供了理论依据。3.“甘草附子汤”黄酮纯化工艺及抗氧化作用研究分别采用AB-8、DM130大孔树脂及聚酰胺树脂对“甘草附子汤”全方制剂中的黄酮组分进行分离纯化，最终确定最佳纯化工艺为采用DM130大孔树脂和聚酰胺树脂联合过柱法，所得总黄酮纯度高达47.9%，回收率为47.0%。采用以上联合过柱法对甘草单煎液、甘草与白术共煎液、甘草与黑顺片共煎液、甘草

7、与桂枝共煎液、“甘草附子汤”全方水提液进行纯化得到各黄酮组分。因自由基参与了风湿性疾病的发生与发展过程，因此本文研究了上述各黄酮组分的抗氧化能力（DPPH测定法、超氧阴离子测定法、•OH测定法及FRAP测定法），结果显示，“甘草附子汤”全方黄酮组分的抗氧化能力明显强于全方水煎液，对比各药对黄酮组分的抗氧化能力，桂枝与甘草共煎液黄酮组分的抗氧化能力最强，且强于甘草单煎液黄酮组分，推测桂枝中的酚酸类成分对黄酮的抗氧化能力有协同促进作用，结果揭示了桂枝在“甘草附子汤”治疗风湿性疾病中发挥的重要作用。4.“甘草附子汤”黄酮成分吸收转运的体外研究（a）药

8、材配伍对黄酮成分吸收转运的影响通过建立Caco-2单层细胞模型，模拟药物经过小肠的吸收过程，对“甘草附子汤”中各药材单煎合并液、共煎液及“甘草附子汤”