tbbpa和tbt对褐鲳鲉(sebastiscus marmoratus)体内c-反应蛋白(crp)影响的初步探索

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1、厦门大学硕士学位论文TBBPA和TBT对褐鲳鲉（Sebastiscusmarmoratus）体内C-反应蛋白（CRP）影响的初步探索姓名：毛月霞申请学位级别：硕士专业：环境科学指导教师：余群20080701摘要‘中文摘要本论文以褐菖鲇(Sebastiscusmarmorams)血清CRP作为实验的研究对象，选择了两种目前颇为关注的海洋环境污染物四溴双酚A(TBBPA)和三丁基锡(TBT)茭b污染材料，研究褐菖鲇血清C．反应蛋白(C．reactiveProtein)的基本性质以及在TBBPA和TBT暴露下的免疫反应特征。实验分别以0．2mg／L的TBBP

2、A和0．299Sn／L的TBT为实验的暴露浓度，以7个时间梯度(O，3，6，12，24，36，48h)取样，通过亲和层析纯化法、紫外吸收定量法、未变性电泳法(Native．PAGE)、SDS．PAGE电泳法以及酶联免疫法(ELISA)等检测手段，探索了褐菖鲇血清CRP的结构性质，系统分析了这种蛋白在环境污染物TBBPA和TBT胁迫下其含量水平、分子形态、分子性质、表面抗原物质所产生的变化，并探讨了这些变化的分子内部行为机制。结果表明：1．运用亲和层析法提纯和紫外吸收定量法得出正常褐莒鲇血清中的CRP含量为378．515士13．5199／mL；SDS-P

3、AGE和PAS染色法分析发现该蛋白为糖蛋白，只含有一种亚基，大小约为24．5kDa；表明褐菖鲇和其它绝大部分鱼类一样，CRP中只含有一类为糖蛋白的亚基。2．TBBPA和TBT暴露处理发现，褐菖鲇血清ClIP的浓度都随着时间逐渐增高，并且在12h时达到峰值，暴露于TBBPA的CRP最大值为常量的2．079倍，且暴露于TBT的CRP则为常量的2．748倍；随后，血清CRP的浓度开始下降，到48h时已降到常量水平甚至略低于常量值，这一结果说明了TBBPA和TBT的暴露引起了褐菖鲇CRP含量发生变化，而变化程度的不同则表明TBT对褐菖鲇可能具有更强的毒性作用。

4、3．经7．5％未变性电泳(Native．PAGE)检测发现，未处理的CRPN和经过污染物诱导产生的峰值处的CRP。蛋白条带较为单一，但是各具不同的蛋白质迁移率，一方面表明所提取的CRPs纯度较纯，另一方面可以认为不同污染物的诱导造成相应CRPs分子的分子量、电荷和(或)结构发生了变化。4．从TBBPA和TBT暴露下褐菖囱由血清CRP动力学模式上看，CRP经两种污染物诱导，蛋白质条带随暴露时间经由单一一两条一单一一两条一单摘要一一单一的变化过程。说明TBBPA和TBT诱导产生了新的CRP形式，而且在暴露于污染物的过程中，CRP以常态和诱导态并存。尤其是T

5、BT暴露下CRP诱导态存在时间更长，该现象进一步证明TBT对褐菖伍由CRP具有更强的诱导性。5．SDS．PAGE(12％)检测了CRPN以及经TBBPA和TBT诱导的峰值部分的CRPTBBPA和CRPTBT发现，三种蛋白均有条带出现在相同的位置，但经过污染暴露的诱导态CRPs在电泳中还出现了其他条带，说明CRPs中的亚基已经产生了不同的变化；以10％SDS．PAGE和15％SDS．PAGE检测CRPs均得到同样的结果。Sclliff试剂对这三种蛋白染色仍然均呈阳性反应，表明CRP不但在亚分子水平上发生了变化，而且这些变化可能与其蛋白结构中的碳水化合物的

6、组成有关。6．通过ELISA法观察了CRPN与诱导态CRPTBBPA和CRPTBT的表面抗原性质发现，CRPTBBPA和CRPTBT与兔抗褐菖鱼由CI冲N血清反应作用强烈，但反应程度有差别。表明褐菖鲇经TBBPA和TBT暴露后，尽管三种CRPs均有相似性，但是与抗体结合的亲和性却有明显的变化，他们结合的顺序依次为CRPN>CRPTBBPA>CRPTBT。从而进一步说明TBBPA和TBT污染胁迫已经引起了CRP表面抗原物质的变化，而这些变化可能与褐菖鱼由的血清CRP在免疫早期的解毒机制有着密切的关系。7．将去糖基化的CRPs进行未变性电泳检测发现，常态的

7、CRPN和诱导态的CRP。迁移位置相同，从而证实了碳水化合物是造成CRP变化的主要原因。8．CRPs浓度的变化与形态的转化有关联，在CRPs形态转化的过程中，由于常态CRPs的转化和机体自身生成诱导态的CRPs使诱导态CRPs浓度逐渐升高；另一方面，浓度的升高也可以反应出CRPs形态的变化。9．CRPs的浓度、形态以及与抗体亲和性的改变与污染物的种类有关，这些参数的变化情况可以反应污染物毒性的大小。综上所述，TBBPA和TBT暴露能在短时间内诱导褐菖隹由血清C．反应蛋白(CRP)含量上升，造成相应CRPs分子的分子量、电荷和(或)结构的变化。2摘要在T

8、BBPA和TBT暴露过程中，CRP分子存在着动力学的诱导模式，并以常态和诱导态并存。其中以TB