lec1对棉花体细胞胚胎发生的影响

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1、分类号：密级：公开学号：2013103034单位代码：10759石河子大学硕士学位论文LEC1对棉花体细胞胚胎发生的影响学位申请人赵振军指导教师崔百明申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称细胞生物学研究方向分子细胞生物学所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2016年6月EffectsofLEC1onCottonSomaticEmbryogenesisADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofNaturalScienceByZhaoZhe

2、n-jun（Cellbiology）DissertationSupervisor：Prof.Cuibai-mingShihezi·Xinjiang·ChinaJune,2016摘要目的：棉花在纺织加工和油料生产等方面具有重要的经济价值。目前，通过基因工程进行分子水平育种是棉花种质创新的热点，然而，大多数棉花体胚发生系统都存在体胚发生率低、萌发率低、畸形率高、植株再生率低等问题，且对基因型的依赖性极强。体胚发生和植株再生成为棉花转基因工程的主要技术“瓶颈”。LEC1基因是规范子叶特性和完成胚胎发育成熟所必需的调控因子，可通过激活发育早期参与胚胎形态建成和细胞分化等胚胎特异性基因的表达而诱导体细胞

3、胚胎的形成。农杆菌介导遗传转化时会诱发棉花固有的防御反应，造成其遗传转化率低下。在单子叶植物黑麦草中发现，无肌醇、谷氨酰胺及冷休克的联合优化处理可以降低其自身防御反应，从而提高其遗传转化率。因此，本研究一方面通过LEC1基因在棉花中的遗传转化及体胚发生再生出转基因植株，并希望在后期探究该基因对棉花体细胞胚胎发生的影响。另一方面，研究无肌醇、谷氨酰胺及冷休克的联合处理对棉花下胚轴防御反应及遗传转化率的影响。旨在通过基因工程手段对棉花种质创新和品种改良提供理论指导。方法：本研究利用含棉花LEC1基因（GbLEC1A,GbLEC1B）和大叶落地生根B域短缺LEC1基因(KdLEC1)的地塞米松（DE

4、X）诱导型表达载体pIGbLEC1A,pIGbLEC1B,pIKdLEC1，通过农杆菌介导KdLEC1在棉花新海15号下胚轴以及GbLEC1A,GbLEC1B,KdLEC1在棉花新陆早33号胚性愈伤组织中的遗传转化，经潮霉素筛选，体胚发生过程，对分化的KdLEC1转基因新海15号胚性愈伤组织系和再生植株以及GbLEC1A,GbLEC1B,KdLEC1转基因新陆早33号再生植株进行PCR鉴定。以转基因成功的3个KdLEC1转基因新海15号胚性愈伤组织系为试材，分别进行30ｕMDEX和无DEX的6h悬浮诱导处理，实时定量PCR分析不同处理条件下KdLEC1转基因胚性愈伤组织系中目的基因的相对表达量

5、。通过高效热不对称交错PCR（hiTAILPCR）、测序及Blast序列比对分析KdLEC1-4转基因新海15号再生植株基因组中的T-DNA插入位点。并希望后期以LEC1转基因植株的F1代为材料，探究LEC1基因对棉花胚性转变、体胚发生及植株再生的影响。此外，在农杆菌介导pCAMBIA1301表达载体侵染前和遗传转化过程中，通过肌醇、谷氨酰胺和冷休克不同组合方式处理新陆早33号下胚轴，经pCAMBIA1301遗传转化及共培养后的DAB染色和GUS染色，研究该处理对棉花防御反应及其遗传转化率的影响。结果与结论：（1）经为期13个月的体胚发生过程和PCR鉴定，获得了两棵独立转化的KdLEC1转基因

6、新海15号再生植株；分别获得了一棵PCR鉴定正确的GbLEC1A,GbLEC1B,KdLEC1转基因新陆早33号植株，其再生周期约为10个月。实时定量PCR分析显示，3个KdLEC1转基因胚性愈伤组织系中，KdLEC1的相对表达量在2.5倍和23倍之间波动，表明该DEX诱导型表达载体pINDEX3可以在不同水平诱导KdLEC1的表达。HiTAILPCR及Blast序列比对表明，KdLEC1的T-DNA确实插入到KdLEC1-4转基因新海15号再生植株基因组中，但由于比对的棉花基因信息太少，无法确定其具体的插入位置。（2）相比于其他处理，无肌醇、谷氨酰胺及冷休克联合处理降低了农杆菌侵染诱发的下胚

7、轴中H2O2含量，同时提高了其遗传转化率，表明无肌醇、谷氨酰胺及冷休克的生理性优化处理可通过降低防御反应来提高棉花下胚轴的遗传转化率。关键词：转基因棉花；体胚发生及植株再生；LEC1基因；防御反应；遗传转化率IAbstractObjective:Asweallknow,cottonhasimportanteconomicvalueintextileprocessingandoilproductio