基于质谱的疾病标记物高灵敏度生物传感新方法研究

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1、学校代号10532学号B12110040分类号密级博士学位论文基于质谱的疾病标记物高灵敏度生物传感新方法研究学位申请人姓名林向成培养单位化学化工学院导师姓名及职称俞汝勤教授学科专业分析化学研究方向质谱分析论文提交日期2016年9月学校代号：10532学号：B12110040密级：湖南大学博士学位论文基于质谱的疾病标记物高灵敏度生物传感新方法研究学位申请人姓名：林向成导师姓名及职称：俞汝勤教授培养单位：化学化工学院专业名称：分析化学研究方向：质谱分析论文提交日期：2016年9月论文答辩日期：2016年9月答辩委员会主席：吴海龙教授AnalysisofDiseaseBiomarke

2、rsbyHighSensitivityBiosensorsBasedonMassSpectrometrybyLINXiangchengM.S.(GuangxiNormalUniversity)2004AdissertationsubmittedinpartialsatisfactionoftherequirementsforthedegreeofDoctorofScienceinAnalyticalChemistryintheGraduateSchoolofHunanUniversitySupervisorsProfessorYuRuqinSeptember,2016湖南大学

3、学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研巧所取得的研究成果。除了文中特别加Ｗ标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品，。对本文的研巧做出重要贡献的个人和集体均己在文中Ｗ明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。巧？作者签名：夺、曰期：方年９月户曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保。留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅本人授权湖南大学可Ｗ将本学位论文的全部或部分内容编入有关数

4、据库进行检索，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于１、保密□，在年解密后适用本授权书。２、不保密＂＂（请在Ｗ上相应方框内打Ｖ）兴｜＆作者签名；日期：年９月知日导师签名；曰期：年／＞月？曰博士学位论文摘要近年来，生物传感与生化分析新方法的研究进展，极大地推动了分析化学与生命科学的学科发展，在分析化学和生命科学的交叉领域，无论在科学研究方面还是实际应用都发挥着越来越重要的作用。质谱技术是近些年来发展迅速的生物分析技术之一。质谱作为生物活性分子的检测手段，具有多种优点：高灵敏度，可测定纳摩尔以下物质的量；快速，数分钟

5、内即可完成测试；能同时提供精确分子质量和结构信息；既可以定性分析，也可以用于定量分析；有效地与各种色谱分离技术联用。质谱的特点可以概括为灵敏、快速、专一、高通量，充分展示了质谱比其它方法优越。本论文以质谱为研究平台，建立了多种生物传感新方法。以具有重要生物功能和研究意义以及重大疾病相关的生物标志物为研究对象，发展了一系列简单、快速、成本低、稳定性好,且具有高灵敏度、高选择性和高通量的新型生物传感方法。研究论文的主要内容如下：第2章提出了DNA目标序列碎片化质谱检测DNA甲基化水平的方法。无需经过链扩增方法，将目标DNA链水解后释放出单个碱基，单个碱基的质谱灵敏度远高于DNA链的

6、质谱灵敏度。纳升电喷雾离子源（NanoESI）的流速远低于毫升/分钟，离子化效率同时得到大大提高。结合NanoESI，DNA水解物由流动注射直接进样并质谱检测，5-甲基胞嘧啶（5mC）的检出限达0.11pM。采用经济的甲酸水解法，水解效率高，便于实现。DNA水解物混合溶液无需经过色谱分离即可高灵敏度检测，实验操作过程简单，快捷。以前列腺癌相关基因的CpG岛特定序列为研究对象，通过质谱准确测定了20个临床组织样本的甲基化水平。第3章将目标序列碎片化质谱检测的方法应用到DNA重复序列拷贝数的检测中。重复序列的动态突变不仅可以发生在上代的生殖细胞中从而遗传至下一代，也可在当代的体细胞

7、中发生突变。研究已发现，重复序列的动态突变与多种神经性疾病相关，是当前研究热点之一。利用PCR扩增方法提高目标重复序列的浓度，PCR引物上标记生物素。链霉亲和素磁珠与PCR产物中的生物素结合，目标重复序列被磁珠捕获纯化。随后，目标重复序列从磁珠上释放下来，甲酸水解。得到的水解物以质谱检测，胞嘧啶碱基的检测限为18.23fM。测定单个CAG拷贝数时，所需基因组DNA最小量为0.07μg，完全满足临床检测要求。第4章以脂质体纳米粒子对蛋白质疾病标记物进行标记，实现蛋白质的高灵敏度免疫质谱检测。蛋