calpain在脂毒性心肌病中作用机制及运动保护效果的研究

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1、中文摘要研究目的：随着肥胖和2型糖尿病人群的逐年增加，与脂毒性相关的心血管疾病引起人们普遍关注。脂毒性心肌病属于慢性病理改变，就其发病机制的认识仍十分缺乏。本研究集中探索calpain蛋白水解酶在脂毒性心肌病中的作用，从内质网应激，心肌细胞凋亡和促炎因子等方面讨论抑制calpain产生对抗脂毒性心肌病的机制。研究还进一步探讨运动改善脂毒性心功能紊乱是否通过影响calpain活性而产生保护效益，为预防和治疗脂毒性心肌病提供理论和实验依据。研究方法：心肌细胞特异性Capn4基因敲除（Capn4KO）小鼠及其

2、野生型同窝小鼠（雄性，6周龄，n=6）喂食普通饲料或高脂饲料（60%能量来自脂肪）20周，诱导脂毒性心肌病动物模型。造模结束后，开展葡萄糖耐量和胰岛素耐受测试检查胰岛素敏感性。应用超声心动图技术评价小鼠心脏收缩和舒张功能。获取血清分析甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白浓度。计算心重/胫骨长度比评估整体水平心脏肥大。心肌组织包埋切片后，采用采用天狼猩红-饱和苦味酸染色，观察胶原纤维沉积；胚凝集素-Hochest荧光染料染色后观察心肌细胞大小。采用RT-PCR技术分析心肌组织mRNA表达，包括检

3、测纤维化特征基因collagen-I和collagen-III，肥大特征基因ANP和β-MHC，促炎因子基因TNF-α和IL1β。分析心肌组织caspase-3活性反映心肌细胞凋亡情况。应用Westernblot技术检测内质网应激相关蛋白CHOP，BIP和磷酸化JNK的表达。培养乳鼠心肌细胞，以棕榈酸（0.2mM）处理24h，形成细胞水平水平脂毒性模型，检测DNA断裂片段和caspase-3活性评价心肌细胞凋亡。使用calpain抑制剂III和siRNA（capn1和capn2）分别抑制calpain酶

4、活性或蛋白表达，也应用内质网应激抑制剂抑制内质网应激，共同观察calpain参与脂毒性心肌细胞凋亡的作用。促炎因子采用RT-PCR技术检测。Westernblot技术检测内质网应激相关蛋白表达。C57小鼠（雄性，6周龄，n=6）分为四组：高脂饮食对照组（20周高脂饮食），I高脂饮食锻炼组（20周高脂饮食+8周游泳运动），普通饮食对照组和普通饮食锻炼组。四组静养12周后，运动组开始游泳。小鼠进行每周5天，每天30分钟游泳运动，持续8周。锻炼结束后分析心功能，检测血清脂质和心肌组织calpain酶活性。研究

5、结果：1高脂饮食20周后，野生型和Capn4KO小鼠均表现出体重明显增加，血浆中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平升高，葡萄糖耐量受损。2与喂食普通饲料野生型小鼠比较，高脂饮食野生型小鼠心脏收缩功能指标射血分数（EF）和短轴缩短率（FS），心脏舒张功能指标E/A比值及冠脉血流量均显著下降。但是与高脂饮食野生型小鼠比较，高脂饮食Capn4KO小鼠这些指标均得以改善。与普通饲料野生型小鼠比较，高脂饲料野生型小鼠心肌中calpain活性升高；capn4敲除后降低了高脂诱导的calpain活性增

6、加。3在野生型小鼠中，高脂饮食小鼠的心重/胫骨长度比值高于普通饮食小鼠，形态学分析也发现心肌细胞横截面积增大；而在capn4敲除后减少了这些心肌肥大表现。此外，capn4KO正常化高脂饮食诱导的心脏肥大特征基因(ANP，β-MHC))的表达。类似的，脂毒性诱导心脏出现总胶原，1型胶原和3型胶原沉积增加，而capn4KO小鼠减少了这些胶原的沉积。与此一致，纤维化特征基因（collagen1，collagen3）在capn4KO小鼠心脏中表达也低于高脂野生型小鼠。4高脂饮食显著升高心肌组织中内质网应激相关蛋

7、白CHOP，BIP以及磷酸化JNK1/2D的蛋白水平，而敲除Capn4降低高脂饮食引起的内质网相关蛋白水平的升高。5在培养乳鼠心肌细胞中，棕榈酸能激活calpain，诱导caspase-3活性和DNA断裂片段增加，同时也升高CHOP，BIP以及磷酸化JNK蛋白表达水平；而通过calpain抑制剂III或capn1siRNA抑制calpain均能降低内质网相关蛋白表达，最终减少心肌细胞凋亡。6游泳运动显著降低了高脂饮食引起的小鼠体重，Lee’s指数，血清中甘油三酯和总胆固醇水平的增加。7游泳运动显著降低了

8、高脂饮食导致的calpain活性增加。运动改善了高脂诱导的小鼠心脏功能紊乱。II结论：1高脂饮食成功诱导脂毒性心肌病表型。心肌细胞capn4敲除减缓脂毒性心肌病。2抑制calpain活性通过减弱内质网应激和炎症反应途径，减少毒性脂质诱导的心肌细胞凋亡，最终提高心功能。3抑制calpain-1而不是calpain-2，可以通过内质网应激途径减少棕榈酸诱导的心肌细胞凋亡。4calpain酶活性的减少可能是游泳运动改善脂毒性心肌功能紊乱的机制之一