日本沼虾精子游离和遗传灭活技术研究及顶体反应相关基因的克隆与表达分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M120150330上海海洋大学硕士学位论文日本沼虾精子游离和遗传灭活题目：技术研究及顶体反应相关基因的克隆与表达分析StudyonDissociatingSperms,GeneticalInactivationofSpermsandMolecularCloningandGeneExpression英文题目：ofAcrosomalReactionRelatedGeneinMacrobrachiumnipponensis专业：渔业研究方向：水产动物遗传育种姓名：颜跃弟指导教师：傅洪拓研究员二O一五年五月上海

2、海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可

3、以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学博/硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注邴旭文淡水渔业研究中心研究员主席杨弘淡水渔业研究中心研究员委员袁永明淡水渔业研究中心研究员委员尤洋淡水渔业研究中心研究员委员沈怀舜淡水渔业研究中心研究员委员张霖淡水渔业研究中心实习研究员秘书2015年5答辩地点无锡南泉答辩日期月26日上海海洋大学硕士学位论

4、文日本沼虾精子游离和遗传灭活技术研究及顶体反应相关基因的克隆与表达分析摘要日本沼虾（Macrobrachiumnipponensis），俗称青虾，是我国重要的淡水养殖品种。雌核发育是一种重要的遗传学技术，在快速建立纯系、性别决定机制研究等方面得到了广泛的应用。与此同时，雌核发育技术也是一种重要的性别控制育种技术，对实现单性养殖具有重要的作用。雌核发育过程中，精子虽正常进入并激活卵子，但其细胞核在染色体中很快消失，其遗传物质并不发挥作用，胚胎的发育仅受母体遗传控制。目前，已有较多关于鱼类雌核发育的研究。然而，由于甲壳类动物的精子被精荚包裹

5、，且青虾等甲壳类动物具有抱卵特性，导致甲壳类动物的雌核发育研究至今未能取得突破。本文拟采用胰蛋白酶酶解青虾精荚以获得游离精子，采用X射线照射活体雄虾灭活精子遗传物质，同时克隆精子顶体反应相关的丝氨酸蛋白酶基因（MnSP），以促进青虾雌核发育技术的进步和精子受精过程分子机制的探索。1、酶解法制备青虾游离精子为了从青虾精荚中获得数量多且存活的游离青虾精子，本试验首次采用胰蛋白酶消化青虾精荚的方法，获得了游离的青虾精子。通过观察游离精子形态，并经台盼蓝染色，以每克精荚所获得形态正常、结构完整且不被染色的存活精子数为依据，探究胰蛋白酶处理的最佳

6、条件。在pH7.1的条件下，设计三因素四水平正交试验。设置了不同酶浓度(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%)、处理时间(5min、10min、15min、20min)和处理温度(30℃、35℃、40℃、45℃)，根据正交试验结果确定酶处理最佳反应条件。结果表明，酶浓度对获得游离精子影响最大，其次是处理温度和处理时间。酶处理的最适条件为：酶浓度0.8%，处理时间10min，处理温度40℃。经优化验证试验，表明上述理论组合确为最佳组合。本研究通过酶解法获得较多数量的存活游离精子，为进一步研究青虾精子提供了前提条件。2、X射线灭活活体青虾

7、精子的初步研究利用X射线对雄性青虾进行不同时间的照射处理，将处理后的雄虾与刚完成生殖脱壳的雌虾交配。待雌虾产卵后，计数雌虾抱卵天数，并在显微镜下观察卵的I上海海洋大学硕士学位论文畸形情况，以检测X射线对青虾精子的灭活效果。X射线管照射强度为100kV，5mA，源距10cm，照射时间为0min、30min、60min、90min和120min。照射30min组，抱卵天数及卵的畸形率较0min组无变化，卵的畸形率为0，卵能正常发育至孵化出膜。随着照射时间的增加，在30～90min之间，雌虾抱卵天数逐渐减少，且所抱卵的畸形率呈上升趋势。照射1

8、20min组，抱卵天数较90min组变化不大，卵的畸形率达100%。在本实验照射时间范围内，确定了灭活青虾精子遗传物质的最佳照射时间为90～120min。采用彗星实验的方法检测经X射线处理后的各实验组青虾的