日本沼虾精子游离和遗传灭活技术-研究与顶体反应相关基因的克隆与表达-分析

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1、上海海洋大学硕士学位论文畸形情况，以检测X射线对青虾精子的灭活效果。X射线管照射强度为100kV，5mA，源距10cm，照射时间为0min、30min、60min、90min和120min。照射30min组，抱卵天数及卵的畸形率较0min组无变化，卵的畸形率为0，卵能正常发育至孵化出膜。随着照射时间的增加，在30～90min之间，雌虾抱卵天数逐渐减少，且所抱卵的畸形率呈上升趋势。照射120min组，抱卵天数较90min组变化不大，卵的畸形率达100%。在本实验照射时间范围内，确定了灭活青虾精子遗传物质的最佳照射时间为90～120min。采用彗星实验的方法

2、检测经X射线处理后的各实验组青虾的精子，根据彗星实验结果，推测X射线灭活青虾精子遗传物质的机理为使得青虾精子染色体结构发生改变的变性作用。3、青虾丝氨酸蛋白酶基因（MnSP）的克隆与表达分析丝氨酸蛋白酶是一种参与精子顶体反应的酶，在精子穿透卵膜过程中发挥重要的作用。本研究利用cDNA末端快速克隆方法获得了日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)的丝氨酸蛋白酶基因MnSP（GenBank登录号为KP091755）全长cDNA序列。该基因cDNA全长1792bp，包含132bp的5′末端非翻译区，1071bp的开放阅读框(ORF)和589b

3、p的3′末端非翻译区。开放阅读框编码357个氨基酸，分子质量为39.51KD。氨基酸序列比对分析显示MnSP与其他物种丝氨酸蛋白酶基因的相似度为31%—42%。不同组织荧光定量PCR检测显示：MnSP基因在雌雄虾的鳃组织里面的表达量均最高；MnSP基因在肝胰腺里面也有表达，且远远低于在鳃组织中的表达，其他组织中的表达水平也均显著低于鳃组织中的表达（P<0.05），这说明MnSP基因在青虾中除了起到免疫功能外，可能也参与了青虾的呼吸作用；此外，发现MnSP基因在雌雄虾成体的肌肉组织中均没有表达，说明该基因与成体青虾的生长无关；MnSP基因在精巢中没有表达，

4、在输精管中的表达也极低，而在卵巢中表达显著高于在精巢和输精管中的表达，并且在雌雄虾的相同组织（鳃、肝胰腺、心脏）中的表达量相比较发现，雌虾中的表达量均高于在雄虾中的表达量，说明MnSP基因在性腺中具有表达特异性，仅在雌性性腺中具有表达，且在其他组织中的表达也存在性别差异，推测MnSP基因是与性别差异相关的基因。不同发育时期荧光定量PCR检测显示：MnSP基因在胚胎发育各时期、出膜后幼体期、变态后发育时期均有表达，整体表现为在胚胎发育各时期的表达量高于出膜后及变态后各发育时期，表达变化趋势由高表达变为低表达，在胚胎发育的囊胚期表达量显著升高至顶峰，其后又降

5、低，这可能是由于囊胚期细胞的分化最为旺盛，推测MnSP基因参与胚胎细胞的分化，并且当虾出膜后，MnSP基因参与幼虾生长发育的作用明显降低。II万方数据上海海洋大学硕士学位论文本文首次采用胰蛋白酶消化法成功获得了数量多且存活率高的游离青虾精子，得到了胰蛋白酶消化精荚的最佳处理条件，为青虾精子的遗传操作提供了方法上的支持；首次通过X射线照射雄虾实现了青虾精子遗传物质的灭活，为进一步开展青虾雌核发育研究提供了条件；首次克隆了青虾丝氨酸蛋白酶基因，并且研究了该基因在雌雄虾不同组织以及发育过程的表达特征，有助于阐明青虾精子顶体反应乃至受精过程的遗传机制。关键词：青

6、虾，日本沼虾，游离精子，遗传灭活，基因克隆，丝氨酸蛋白酶III万方数据上海海洋大学硕士学位论文StudyonDissociatingSperms,GeneticalInactivationofSpermsandMolecularCloningandGeneExpressionofAcrosomalReactionRelatedGeneinMacrobrachiumnipponensisAbstractMacrobrachiumnipponensisisanimportantfreshwaterspecieswithhigheconomicprofitsi

7、nChina,whichisalsocalledfreshwatershrimp.Gynogenesisisanimportantgenetictechniquewhichplaysaroleinestablishinggeneticidentitygenealogyandresearchingthesexdeterminationmechanism.Gynogenesisisalsoasignificantbreedingtechnique,especiallyusedincontrollingsex.Gynogenesisisadevelopment

8、alpattern,andinthispattern,spermscanente