应用wt1抗原肽体外剌激培养dc-cik细胞杀伤k562细胞实验研究

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1、授予单位代码10089龜学号或申请号20122012对妗(E搿七5HebeiMedicalUniversity硕士学位论文科学学位应用WT1抗原肽体外剌激培养DC-CIK细胞杀伤K562细胞实验研究研究生：张娜娜导师：郭晓玲副教授专业：内科学二级学院：第二医院2015年3月河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学

2、，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名导师签章:中文摘要目录中文摘要…………………………………………………………………....1英文摘要…………………………………………………………………....5英文缩写…………………………………………………………………..

3、10研究论文应用WT1抗原肽体外刺激培养DC-CIK细胞杀伤K562细胞实验研究前言…………………………………………………………………..11材料与方法…………………………………………………………..12结果……………………………………………………………….....17附图…………………………………………………………………..20附表…………………………………………………………………..22讨论…………………………………………………………………..24结论…………………………………………………………………..28参考文献………………………………

4、……………………………..29综述白血病相关抗原诱导的细胞免疫治疗急性白血病研究进展…..32致谢………………………………………………………………………..40个人简历…………………………………………………………………..41中文摘要应用WT1抗原肽体外刺激培养DC-CIK细胞杀伤K562细胞实验研究摘要目的：以WT1基因阳性的患者为研究对象，提取其外周血单个核细胞，体外诱导产生树突状细胞(DC)，负载WT1复合抗原肽，体外诱导产生细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，检测DC细胞与CIK细胞的增殖能力、免疫表型变化，并检测DC-CIK混合培养后对

5、WT1基因阳性K562细胞的杀伤作用，探索收获WT1抗原特异性效应细胞的合理途径。方法：DC细胞的培养：抽取WT1阳性白血病患者经肝素抗凝后的外周血，经肝素抗凝后，用淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(MNC,6mononuclearcells)。然后用RPMI1640培养液将细胞浓度调整至5×10/ml，6孵育4小时后，提取贴壁细胞，调整细胞浓度为5×10/ml加入6孔培养板中，并加入细胞因子，使得重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)浓度为1000U/ml、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)浓度为1000U/ml。第5天加入W

6、TI混合抗原肽50ng/ml，实验组DC细胞负载WTI混合抗原肽，对照组DC细胞不负载WT1抗原肽，第6天，两组加重组人肿瘤坏死因子-a(rhTNF-a)，使浓度为1000U/ml，促进DC细胞成熟。CIK细胞的体外培养：同上来源的细胞经过单个核细胞的分离，孵育64小时后，收集悬浮的细胞，将细胞浓度调整至1×10/ml，加入干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)1000U/ml，24小时后加入CD-3单抗(CD-3monoclonalantibody)50ng/ml，重组人白细胞介素-2(rh-interleukin-2,rhIL-

7、2)500U/ml，以后隔日更换新的培养液并计数，同时补充加入rhIL-2。培育第7天，用台盼蓝排斥法染色DC细胞和CIK细胞，计数活细胞，用完全培养基(含10％胎牛血清的RPMI1640液)调整DC细胞浓度为661×10/ml，CIK细胞浓度为5×10/ml，按照l:5比例混合，继续培养，在共培养的第1天、第3天、第7天收集共培养细胞，计数，应用流式细胞术检测其免疫分子标记，并检测其对靶细胞的杀伤活性。结果：1负载WT1抗原肽组与未负载WT1抗原肽组来源的DC-CIK细胞增1中文摘要殖能力的比较在温箱中孵育过的贴壁单个核细胞，经过GM-CSF

8、和IL-4诱导后成树突状细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，培育中细胞外形发生变化，细胞量亦有增加。培育48小时后细胞体积较前增大，表面有毛刺样突起，随着