钱迪纳米二氧化钛对多重耐药质粒rp接合转移的影响研究

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1、D201002043密级：纳米二氧化钛对多重耐药质粒RP4接合转移的影响研究Effectofnano-TiO2ontheconjugativetransferoftheRP4plasmid姓名钱迪学科专业生物化学与分子生物学研究方向基因工程与酶工程指导教师张部昌教授完成时间2013年4月49/60独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得　　　　　或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究

2、所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：　　　　　　　　　签字日期：　　　　年　　月　　日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解　　　　　　有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权　　　　可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：　　　　　　　　　导师签名：签字日期：　　　年　　月　　日　　　签字日期：　　　　　年　　月　　日学位论

3、文作者毕业去向：工作单位：　　　　　　　　　　　　　　　　电话：通讯地址：　　　　　　　　　　　　　　　　邮编：49/60摘要随着广谱抗生素的过度使用而引发的抗生素耐药问题日趋严重，世界卫生组织（WHO）已将抗生素抗性基因（ARGs）作为21世纪威胁人类健康的重大挑战之一。细菌产生抗生素抗性基因的原因之一是由于过度使用和滥用抗生素导致细菌产生抗生素抗性突变；另一主要原因是细菌通过水平转移的方式（转化、转导和接合）获得抗生素抗性基因。其中接合是环境中最常见、最有效的水平转移方式，是借助质粒并通过细胞与细胞接触发生DNA的转移。细菌抗生素抗性基因往往编码在可移动质

4、粒上，通过质粒接合转移在细菌间进行传播。接合转移受许多环境因素的影响，而环境水体是细菌发生耐药基因水平转移的重要场所。由于纳米TiO2具有比表面积大，光催化活性高，化学性质稳定等特点，因而成为优良的光催化材料，并被广泛用于空气净化、污水处理和消毒杀菌等方面。然而，纳米TiO2在环境中的残留对环境、生物以及人体的负面影响正在引起人们重视。大量研究表明，纳米TiO2可产生大量活性氧，破坏细菌细胞膜，影响蛋白质和基因，载带DNA或RNA分子进入动物和植物细胞。现在，水环境中存在着大量耐药菌和纳米TiO2，纳米TiO2是否影响耐药基因在细菌间传播还不清楚。本研究基于以

5、上事实提出，水中纳米TiO2可作用于细菌细胞膜和/或调控基因表达，促进细菌耐药基因接合转移的假说，并建立质粒介导的接合转移模型，研究水中纳米TiO2对细菌耐药基因接合转移的影响及规律，分析纳米TiO2作用过程中各种因素的影响规律，从细胞生物学、生物化学、分子生物学角度探讨了纳米TiO2促进细菌耐药基因接合转移机制。主要研究结果如下：研究结果表明，纳米TiO2可以显著地促进RP4接合转移，而且随着纳米TiO2浓度的升高，这种促进作用先逐渐增强再减弱。在0.5mmol/L纳米TiO2干预下，接合4h后接合转移频率上升约100倍，1mmol/L干预组产生的接合转移频

6、率最高，是空白对照组的150倍左右，随后开始下降。纳米TiO2的作用效果随浓度的变化有峰值出现，可能原因是纳米TiO2在对RP4接合转移有促进作用的同时，能够使细胞产生严重的氧化应激反应，对细菌细胞产生毒性，造成细菌死亡。纳米TiO2促进RP4接合转移的作用随着初始菌密度的升高而增强。随着接合时间的延长，纳米TiO2对RP4接合转移的促进作用先升高再下降，其中49/601mmol/L纳米TiO2干预下，24h时接合转移频率达到最大值，为空白对照的1500倍，随后开始下降。而且随着温度的提高，相同浓度处理组的接合转移频率也逐渐升高，即温度越高接合转移频率越高，但

7、高于15℃后差异不太明显。在水体中pH值对纳米TiO2促RP4接合转移没有显著影响。机制研究发现：透射电镜结果表明，纳米TiO2对细菌细胞膜产生影响，细胞膜表面变得不光滑，部分细胞膜发生溶解。纳米TiO2浓度越高对细菌细胞膜影响越严重。大颗粒TiO2却无类似的结果，说明纳米TiO2的纳米结构是产生细胞膜损伤的主要因素。纳米TiO2对细菌细胞膜的影响为供、受体菌的细胞膜融合和DNA跨膜转运创造了便利条件。纳米TiO2通过抑制korA和korB的mRNA表达，激活了trbBp基因的mRNA表达，进而促使供、受体菌间形成“接合桥”，促进了接合转移的第一个过程。电镜结

8、果也证实纳米TiO2使形成的“接合桥”