子痫前期患者血清及胎盘中tgf-β1、endoglin表达及其相关性研究

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延安大学学位论文子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究专业名称：妇产科学作者姓名：师媛 分类号：R714.24+4单位代码：10719学号：12144002密级：论文题目：子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究论文作者：师媛指导教师、职称：李红梅教授学科、专业名称：妇产科学提交论文日期：二○一五年六月 创新性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果；也不包含为获得延安大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。本人签名：日期：关于论文使用授权的说明本人完全了解延安大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属延安大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为延安大学。学校有权保留送交论文的复印件，允许查阅和借阅论文；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。（保密的论文在解密后遵守此规定）本学位论文属于保密在年解密后适用本授权书。本人签名：日期：导师签名：日期： 英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称PEpre-eclampsia子痫前期TGF-β1Transforminggrowthfactorbeta1转化生长因子-β1MMPsMatrixMetalloproteinases基质金属蛋白酶TIMP-1tissueinhibitorofmetalloproteinase-1基质金属蛋白酶抑制剂-1ECMextracellularmatrixc细胞外基质ETendothelin内皮素HHThereditaryhaemorrhagictelangiectasia遗传性出血性毛细血管扩张症VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子PLGFplacentalgrowthfactor胎盘生长因子sFlt-1solublefms-liketyrosinekinase-1可溶性血管内皮生长因子受体-1HIF-1hypoxiainduciblefactor-1缺氧诱导因子-1 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究妇产科专业研究生:师媛指导老师:李红梅摘要目的：本实验通过测定子痫前期患者外周血中TGF-β1、sEng的浓度及胎盘组织中TGF-β1、Endoglin的表达水平，对比分析子痫前期和正常孕产妇胎盘组织中TGF-β1、Endoglin的表达及其血清对应的TGF-β1、sEng的含量，研究其相关性，探讨TGF-β1、Endoglin、sEng在子痫前期病因及发病机制中的作用，进一步为以后临床上预测、诊疗方面提供新的理论依据。方法：随机选取2014年6月-2014年12月在我院妇产科住院的子痫前期患者60例（其中轻度子痫前期组30例，重度子痫前期组30例），子痫前期的诊断标准参照谢幸主编的第八版妇产科学。选取血压正常的晚期孕产妇30例作为对照组。三组患者在年龄、孕周、分娩方式及孕次之间均无显著性差异。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定研究对象外周血清中TGF-β1、sEng浓度。胎盘组织中TGF-β1、Endoglin以免疫组化SP法检测。将所得的数据用SPSS19.0软件包进行分析，计量资料用均数±标准差表示，采用方差分析，计数资料采用卡方检验。结果：1.血清TGF-β1在正常对照组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组的浓度分别为673.68±25.16ng/L、930.93±30.34ng/L、1090.88±31.37ng/L，血清sEng在正常对照组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组各组中的浓度分别为24.76±3.39ng/ml、38.15±3.15ng/ml、47.50±3.60ng/ml。随着病情的加重，TGF-β1/sEng浓度呈逐渐上升趋势。与对照组比较，轻度、重度子痫前期组血清TGF-β1/sEng浓度明显升高，重度子痫前期组血清中TGF-β1/sEng高于轻度子痫前期组，且差异均具有显著的统计学意义（p<0.01）。 2.TGF-β1在正常对照组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组TGF-β1的阳性率分别是26.67%、76.67%、93.33%，Endoglin在正常对照组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组胎盘中表达的阳性率分别为30.00%、73.33%、93.33%，从整体局势可见，病情越重，TGF-β1的表达阳性率越高，成递增的趋势。三组之间两两比较显示：轻度、重度子痫前期组胎盘TGF-β1/Endoglin表达强于正常对照组，差异具有统计学意义（p<0.016）,而轻度、重度子痫前期组比较，差异无统计学意义（p>0.016）。3.各组血清中的sEng与血清中的TGF-β1之间呈正相关，相关系数r分别为0.75、0.69、0.72。各组胎盘组织中TGF-β1与Endoglin的表达有正相关性，相关系数r分别为0.70、0.65、0.72；各组胎盘组织中TGF-β1与血清中的TGF-β1之间有正相关性，相关系数r分别为0.67、0.73、0.71；各组血清中的sEng与胎盘中的Endoglin也呈正相关，相关系数r分别为0.75、0.72、0.71。且差异均具有统计学意义（p<0.05）。结论：1.血清TGF-β1、sEng参与了正常妊娠及子痫前期的发生过程。且病情越重，血清TGF-β1、sEng的表达越高。2.胎盘组织中TGF-β1、Endoglin的过度表达，与子痫前期发病关系密切，随着病情的加重，表达逐渐增加。3.血清sEng可能是胎盘组织分泌Endoglin的一种可溶性形式，并通过与TGF-β1之间的相互作用共同参与了血液循环中血压的调控及内皮细胞的损害。关键词：子痫前期；转化生长因子β1、Endoglin；sEng；发病机制。 Researchfortransforminggrowthfactorbeta1,EndoglininserumandplacentaexpressionofhypertensivedisorderscomplicatingpregnancyAbstractObjective:thisstudythroughthedeterminationofTGF-inpreeclampsiapatientsperipheralbloodbeta1,sEngconcentrationandplacentaltissueTGF-beta1,expressionlevelofEndoglin,comparisonbetweenpreeclampsiaandnormalmaternalplacentaltissueintheexpressionofTGF-beta1andEndoglinanditscorrespondingserumTGF-beta1,sEngcontent,studyitscorrelation,exploreTGF-beta1,Endoglin,sEngrolesinpreeclampsiaetiologyandpathogenesis,andfurtherfortheprediction,diagnosisandtreatmentinclinicalprovidenewtheoreticalbasis.methods:RandomlyselectedfromJune2014-December2014inhospitalobstetricsandgynecologyhospitalof60patientswithpreeclampsia(includingmildpreeclampsiagroupandcontrolgroup,30casesofseverepreeclampsiagroup30cases),selectthesamebloodpressurenormalmaternal30casesascontrolgroup.Threegroupsofpatientsinage,gestationalage,birthwayandtherewasnosignificantdifferencebetweenpregnanttime.Byusingdoubleantibodysandwichenzyme-linkedimmunosorbent(ELISA)determinationoftheresearchobjectintheperipheralbloodofqingdynastyTGF-beta1,sEngconcentration.PlacentaltissueTGF-beta1,EndoglindetectionbyimmunohistochemicalSPmethod.WillanalyzethedatausingSPSS20.0package,measurementdatawithmean±standarddeviation,saidusinganalysisofvariance,countdatabychi-squaretest.Results:1.SerumTGF-beta1innormalpregnancygroup,themildpreeclampsiagroup,concentrationofseverepreeclampsiagroupwere673.68±25.16ng/L,930.93±30.34ng/L,1090.88±31.37ng/L,serumsEnginnormalpregnancygroup,mildpreeclampsia, severepreeclampsiagroupconcentrationineachgroupwere24.76±3.39ng/ml,38.15±3.15ng/ml,3.15±3.60ng/ml.Astheillnessaggravating,TGF-beta1/sEngconcentrationshowedatrendofrising.Comparedwithcontrolgroup,mildandseverepreeclampsiagroupserumTGF-beta1/sEngconcentrationincreasedsignificantly,severepreeclampsiagroupofTGF-beta1/sEnginserumishigherthanmildpreeclampsiagroup,anddifferencesaresignificantstatisticalsignificance(p<0.01).2.TGF-beta1innormalpregnancygroup,mildpreeclampsia,severepreeclampsiagroupTGF-beta1positiverateis26.67%,76.67%and93.33%,respectively,Endoglininthenormalcontrolgroup,mildpreeclampsia,severepreeclampsiagroupexpressioninplacentaofpositiverateare30.00%,73.33%and30.00%respectively,fromtheoverallsituation,conditionisheavier,theexpressionofTGF-beta1positiverateishigher,asthetrendofincreasing.Threegroups,accordingtotwocomparisonbetweenmildandseverepreeclampsiagroupplacentaexpressionofTGF-beta1/Endoglinstrongerthanthenormalcontrolgroup,thedifferenceisstatisticallysignificant(p<0.016),whilemildandseverepreeclampsiagroup,therewasnostatisticallysignificantdifference(p>0.016).3.BetweengroupsintheserumbetweensEngandTGF-beta1intheserumwerepositivelycorrelated,correlationcoefficientrof0.75,0.69,0.72,respectively.GroupsofplacentatissueTGF-beta1haspositivecorrelationwiththeexpressionofEndoglin,correlationcoefficientrwere0.70,0.65,0.72;GroupsofplacentatissueTGF-beta1andhasapositivecorrelationbetweenserumofTGF-beta1,correlationcoefficientrwere0.67,0.73,0.71;EachsEngintheserumandplacentaEndoglinalsopositivelycorrelated,correlationcoefficientrof0.75,0.72,0.71,respectively.Andthedifferenceswerestatisticallysignificant(p<0.05).Conclusion:1.SerumTGF-beta1,sEngwasinvolvedintheprocessofnormalpregnancyandpreeclampsia.Theheavierandcondition,theexpressionofserumTGF-beta1andsEngishigher. 2.TheplacentatissueofTGF-beta1,theexcessiveexpressionofEndoglin,closelyassociatedwiththeonsetofpreeclampsia,astheillnessaggravating,expressiongraduallyincrease.3.SerumsEngmaybeplacentaltissuesecretesaformofsolubleEndoglin,andwiththemutualinteractionofTGF-beta1betweeninvolvedinthecirculationofthebloodintheregulationofbloodpressureanddamageofendothelialcells.Graduate:shiyuan(SurgeryMajor)DirectedbyProf.LihongmeiKeywords:hypertensivedisorderscomplicatingpregnancy;Transforminggrowthfactorbeta1,Endoglin;sEng;Thepathogenesis. 目录引言……………………………………………………………………………………1研究材料与方法…………………………………………………………………………41.材料…………………………………………………………………………………41.1研究对象………………………………………………………………………41.2诊断标准………………………………………………………………………41.3入选标准………………………………………………………………………51.4采集标本………………………………………………………………………52.研究方法……………………………………………………………………………52.1采用ELISA法测定外周血中TGF-β1、sEng的浓度………………………52.1.1实验试剂…………………………………………………………………52.1.2实验设备…………………………………………………………………62.1.3实验原理…………………………………………………………………62.1.4实验步骤…………………………………………………………………72.2免疫组化SP法检测胎盘组织中TGF-β1、Endoglin的表达………………82.2.1主要试剂及配制…………………………………………………………82.2.2实验设备…………………………………………………………………92.2.3实验原理…………………………………………………………………92.2.4实验步骤…………………………………………………………………92.2.5实验结果判定…………………………………………………………102.3统计学处理……………………………………………………………………10结果…………………………………………………………………………………121一般资料的分析………………………………………………………………122血清中TGF-β1浓度的测定…………………………………………………123血清中sEng浓度的测定……………………………………………………124胎盘组织中TGF一β1的表达结果…………………………………………13 5胎盘组织中Endoglin的表达结果……………………………………………136相关性分析……………………………………………………………………14讨论…………………………………………………………………………………161TGF-β1的生物学特征及致病机理…………………………………………161.1TGF-β1的生物学特征……………………………………………………161.2TGF-β1的致病机理………………………………………………………172Endoglin的生物学特征及致病机理…………………………………………182.1Endoglin的生物学特征…………………………………………………182.2sEng的生物学特征………………………………………………………192.3Endoglin及sEng的致病机理……………………………………………193TGF-β1在子痫前期中的作用………………………………………………203.1TGF-β1在正常妊娠胎盘中的表达……………………………………203.2TGF-β1在子痫前期胎盘中的表达……………………………………203.3TGF-β1在血压调节中的作用……………………………………………214Endoglin、sEng在子痫前期中的作用………………………………………224.1、sEng在子痫前期血清中的表达水平…………………………………224.2Endoglin在子痫前期胎盘中的表达…………………………………225血清TGF-β1、sEng及胎盘TGF-β1、Endoglin的相关性分析……………236不足与展望……………………………………………………………………24结论…………………………………………………………………………………25参考文献………………………………………………………………………………26附图…………………………………………………………………………………30综述…………………………………………………………………………………31TGF-β1及其受体Endoglin在子痫前期中的研究进展………………………31参考文献………………………………………………………………………………35致谢…………………………………………………………………………………39发表文章………………………………………………………………………………40 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究引言子痫前期(pre-eclampsia,PE)是产科常见的特发性疾病，目前报道我国发病率约为9．4％～10．4％，国外约为7％～12％。一般情况下，子痫前期起病于妊娠20周以后，主要表现为高血压、蛋白尿、水肿，可伴有全身多器官损伤及功能障碍（如脑水肿、肺水肿、脑出血、心力衰竭、凝血功能障碍、肝破裂、肾功能衰竭）及胎儿生长受限、胎儿宫内窘迫等，情况严重者可发生抽搐，甚至威胁到生命。有关研究发现子痫前期患者日后发生心血管疾病、糖尿病及脑卒中等的风险显著高于正常人，且其胎儿在今后的成长过程中发生冠心病、高血压、高血脂、2型糖尿病、[1]肥胖也比正常同龄人要高很多。目前，子痫前期的病因及发病机制仍处于研究阶段，很多学者认为是母体、胎盘及胎儿等多因素作用的结果。一些学说也层出不穷，如滋养细胞侵袭异常学说、免疫失衡学说、胎盘缺血缺氧学说、血管内皮受损学说、营养缺乏学说、胰岛素抵抗、环境因素等，这些都从各个方面的阐述了妊娠期高血压疾病的发病过程。然而，越来越多的学者认为滋养细胞功能异常才是子痫前期发生的最关键的环节。在胎盘形成初期，具有高度侵蚀能力的细胞滋养细胞突破突破外层的合体滋养细胞，形成多层细胞柱向母体蜕膜层及子宫浅肌层侵蚀，破坏血管中层的肌弹力纤维．使螺旋动脉管壁变薄，同时又阻断了肾上腺素能神经支配血管的功能，使其管径进行性扩张。子宫螺旋动脉生理性血管重铸，形成了子宫胎盘的低阻力循环，满足了胎儿的生长发育对血液增加的需求。发生子痫前期时，滋养细胞侵袭力受到抑制，导致螺旋动脉重铸不足、胎盘浅着床，造成胎盘组织血供减少，胎盘处于一种缺氧环境，-1- 引言致使滋养细胞分泌释放一些功能尚未明确的细胞因子，导致血管内皮损伤、炎症免疫过度激活，从而使子痫前期从胎盘局部发展到全身各个器官。滋养细胞的正常浸润受局部微环境的精密调控，而这些调控往往通过各种细胞因子的参与发挥效应，如血管生成因子、氧分压等。血管生成因子如TGF-β1及其受体Endoglin的异常表达，与子痫前期的发生有着极为密切的关系。TGF-β转化生长因子β(TGF-β)是一组分子量为25KD且结构相关的二聚体多肽，由二硫键连接的两个相同的肽链组成，每条多肽链由112个相同的氨基酸构成，主要调节细胞的生长及分化。目前研究发现TGF-β有5种亚型（TGF-β1、β2、β3、β4、β5），人类体内存在TGF-β1、β2、β3三种，由于这三者在基因序列表达上有高达70％～80％的同源性，所以其生物学活性也极其相似。在人体中TGF-β1以主要形式存在。TGF-β1主要集中表达在胎盘蜕膜细胞及滋养细胞胞质中，在血管内皮细胞及间质中也有极少的表达。研究发现，TGF-β1在调控下丘脑一垂体一卵巢轴系统有一定的生物学效应，可以促进卵子成熟，黄体形成，及子宫内膜及滋养细胞的增殖与分化。在正常妊娠过程中，TGF-β1及其受体表达于胎盘滋养细胞及子宫蜕膜细胞中，且于妊娠中、晚期分别两次达高峰，说明TGF-Bl及其受[2][3]体参与并调节着胎盘成长、分化。Irving等所开展的体外试验显示，TGF-β1[4]对滋养细胞浸润有抑制作用。BenianA等研究发现胎盘绒毛滋养细胞和蜕膜细胞中有TGF-β1、TGF-βRI、TGF-βRII的表达,且和正常妊娠组相比子痫前期组的表达程度更高。提示TGF-β1可能参与滋养细胞和蜕膜细胞功能的调节而导致子痫前期的发生。Endoglin（又称CD105）是TGF-β1受体复合体的成分之一。它位于人类染色体第9q34号，由658个氨基酸残基组成，是一种同二聚体膜糖蛋白成分。它能调节细胞对TGF-β反应，是细胞膜表面表达的一种糖蛋白。在新愈合的伤口、新生的血管内皮细胞及肿瘤生长迅速的边缘均高表达，也可表达于合体滋养层细胞、巨噬细胞、红系祖细胞中，调控血管内皮细胞的增殖。有关学者使用反义的寡核苷酸或Endoglin抗体阻断Endoglin的表达后发现，绒毛滋养细胞的分化和浸润明显提高，说明Endoglin是对滋养细胞分化浸润起着负性调控作用。因此可以大胆的推测，2 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究如果endoglin表达过度或者是表达缺失将可能会引发与滋养细胞侵润异常相关的[5]疾病，比如说子痫前期或者绒毛膜癌。可溶性Endoglin（sEng）是一种抗血管生成因子，是Eng胞外域结构部分的一种可溶性结构，分子量为65kDa。sEng主要由胎盘组织Endoglin产生，释放到血液循环中，以一种可溶的形式存在。它是TGF–β的细胞表面共受体，通过与循环中的TGF-β结合，阻断TGF-β与细胞膜上TGF-β受体结合，进而阻断TGF-B信号传递，增加血管通透性，抑制血管形成；其次，它通过抑制血管内皮上的TGF-β介导的一氧化氮合酶（eNOS）活性，调节血管的紧张度。动物实验研究发现，给[6]孕鼠注射重组sEng后，孕鼠可出现高血压、蛋白尿等妊娠高血压疾病的临床特征。正常情况下胎盘组织分泌Endoglin较少，但在缺氧诱导下血清sEng表达增加。许多研究发现sEng在子痫前期患者体内水平明显升高，甚至在临床症状出现前8-10周就开始升高。这也从另一方面证实了胎盘缺血缺氧学说。-3- 研究材料与方法研究材料与方法1.材料1.1研究对象:随机选取2014年6月-2014年12月在我院妇产科住院的子痫前期患者60例（其中轻度子痫前期30例，重度子痫前期30例），年龄分别为(28.40±3.43)、(28．97±3.55)岁，平均孕周分别为(36．89±0.68)、(36.73±0.67)周，平均收缩压分别为(151.53±3.95)、(170．13±6.37)mmng，平均舒张压分别为(101.53±3.59)、(119.00±6.38)mmHg；选取同期血压正常的孕产妇30例作为对照组平均年龄(27.57±3.21)岁，平均孕周(37．19±0.72)周，平均收缩压(113．47±9.12)mmHg，平均舒张压(75.07±7.67)mmHg。各组孕妇年龄、孕周指数比较，差异无统计学意义p>0．05，各组孕妇收缩压、舒张压比较，差异有统计学意义p<0．05。1.2诊断标准：按照谢幸主编的第八版妇产科学，子痫前期的诊断标准如下：疾病名称临床表现轻度子痫前期妊娠20周以后出现收缩压≥140mmHg和（或）舒张压≥90mmHg伴蛋白尿≥0.3g/24h或随机尿蛋白（+）重度子痫前期血压和尿蛋白持续升高，发生母体脏器功能不全或胎儿并发症。出现以下情况方可诊断:①收缩压≥160mmHg和（或）舒张压≥100mmHg②蛋白尿≥5.0g/24h或随机尿蛋白≥（+++）③持续性头痛或视觉障碍或其他脑神经症状④持续性上腹部疼痛，肝包膜下血肿或肝破裂症状；肝功异常：肝酶ALT或AST升高⑤肾功异常:少尿（24h尿量<400ml或每小时尿量<17ml）或血肌酐>106umol/L4 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究⑥低蛋白血症伴胸腔积液或腹腔积液⑦血液系统异常：血小板持续性下降并低于100×109/L；血管内溶血、贫血或血LDH升高⑧心力衰竭、肺水肿⑨胎儿生长受限或羊水过少⑩早发型即妊娠34周前发病1.3入选标准:1）所有选定研究对象均为单胎、初产；2）既往均无慢性高血压、糖尿病、甲状腺功能亢进，无肝炎、结核等慢性传染性疾病，无严重的心、肝、肾功能障碍；3）均无吸烟、酗酒、滥用毒品、药物及精神性疾病病史；4）母体采血前均未临产及未采取任何治疗；5）均以剖宫产终止妊娠；6）均无产科合并症（如前置胎盘、胎膜早破、胎儿窘迫等)。1.4采集标本各组研究对象均在分娩及治疗前清晨空腹抽取肘静脉血5ml，室温下静置1小时后，3000r／min离心15min，取上清液放入Eppengorf管，于-70℃冰箱冻存。在剖宫产手术胎盘娩出后，立即取无菌剪于胎盘中央脐带附着部对应的母体面，避开出血钙化、梗死区，取胎盘组织约1.0cm×1.0cm×1.0cm大小2块，用生理盐水反复冲洗后，于10%甲醛中固定24-48h，自动脱水机脱水后，常规石蜡包埋。2.研究方法2.1双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定外周血中TGF-β1、sEng的浓度2.1.1实验试剂人转化生长因子β1(TGF-β1)ELISA试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）1.30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶2.酶标试剂6ml×1瓶3.酶标包被板12孔×8条4.样品稀释液6ml×1瓶5.显色剂A液6ml×1瓶6.显色剂B液6ml×1/瓶-5- 研究材料与方法7.终止液6ml×1瓶8.标准品（2000ng/L）0.5ml×1瓶9.标准品稀释液1.5ml×1瓶10.封板膜2张11.密封袋1个可溶性Endoglin（sEng）ELISA试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）1.30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶2.酶标试剂6ml×1瓶3.酶标包被板12孔×8条4.样品稀释液6ml×1瓶5.显色剂A液6ml×1瓶6.显色剂B液6ml×1/瓶7.终止液6ml×1瓶8.标准品（80ng/ml）0.5ml×1瓶9.标准品稀释液1.5ml×1瓶10.封板膜2张11.密封袋1个2.1.2实验设备酶标分析仪（DNM-9602，北京普朗新技术有限公司）低速台式离心机（TDL-40B,上海安亭科学仪器厂）恒温水浴箱（420.A型，上海佳敏仪表有限公司）-70℃冰箱（DW-HL388，中科美菱低温科技有限责任公司）-20℃冰箱（FYL-YS，长岭集团股份有限公司）2.1.3实验原理应用双抗体夹心法测定血清中sEng/TGF-β1水平。微孔板采用纯化的sEng/TGF-β1抗体包被，形成固相抗体，往包被的单抗微孔中加入待测标本，然后再加入酶标试剂，使待测样本中sEng/TGF-β1与HRP标记的sEng/TGF-β1抗体结6 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后再加入底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色。颜色的深浅和样品中的sEng/TGF-β1呈正相关。在450nm波长下使用酶标仪测定吸光度（OD值），通过制作标准曲线计算样品中sEng/TGF-β1浓度。2.1.4实验步骤实验前1天把待测标本从-70℃冰箱中取出，移至-4℃冰箱解冻，实验开始前20min左右取出ELISA试剂盒及血清，平衡至室温。1.标准品的制备：设置6个标准孔，每孔各加入标准品稀释液150ul，于第一个标准孔加入原倍标准品150ul，混匀后使用加样器吸出150ul移至第二孔，依次反复进行倍比稀释至第5孔，然后弃去第5孔吸出的液体，第六孔为空白对照，不做标准品倍比稀释。TGF-β1标准品浓度依次为1000ng/L、500ng/L、250ng/L、125ng/L、62.5ng/L。sEng标准品浓度依次为40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml。2.加样：首先，往待测样品孔依次加入样本稀释液40ul，然后再加入待测样品10ul混匀。加样过程中尽量不要触碰孔壁，直接迅速的加入微孔板底板。一次加样控制在5min以内。3.温育：用封板膜覆盖反应板后置于37℃温育箱温育30分钟。4.洗涤液的制备：将试剂盒提供的浓缩洗涤液用蒸馏水按照1:30的比例稀释。5.洗涤：仔细去掉封板膜，弃去里面液体，甩干后再次加入洗涤液，浸泡1min后，弃去液体，甩干，重复洗板5次，在吸水纸上拍干。6.加酶：于标准孔、待测样品孔（空白孔除外)分别加入酶标试剂50ul。7.温育：用封板膜封板后置于37℃温育箱温育30分钟。8.洗涤：去掉封板膜，弃去里面液体，甩干，再次加入洗涤液，浸泡1min左右，弃去液体，甩干，重复洗板5次，拍干。9.显色：于各孔依次分别加入显色剂A50ul、显色剂B50ul，微震混匀，置于37℃避光显色15min。10.终止：于各孔分别加入终止液50ul，此时蓝色转为黄色。-7- 研究材料与方法11.测定：在反应终止5min内，使用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）并记录数据。12.计算：首先制作标准曲线，用标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制。然后根据样品测得的OD值对应标准曲线查出浓度，再乘以稀释倍数，即为实际样品浓度。或者根据标准曲线计算得出的直线回归方程式，将样品OD值代入，计算样品浓度，再同样乘以稀释倍数即为实际样品浓度。2.2免疫组化SP法检测胎盘组织中TGF-β1、Endoglin的表达2.2.1主要试剂及配制：1.一抗：兔抗人TGF-β1免疫组化多克隆抗体（RAB-0238，福州迈新生物技术开发有限公司）鼠抗人Endoglin单克隆抗体（SN6h，北京中杉金桥生物技术有限公司）2.SP试剂盒组成：A：内源性过氧化酶阻断剂；B：正常非免疫动物血清；c：生物素标记的第二抗体；D：链霉素抗生物素蛋白一过氧化酶；（福州迈新生物技术开发有限公司）3.DAB显色剂(DAB-1031，福州迈新生物技术开发有限公司）试剂A.15ml缓冲液，无色试剂B.15ml底物H202，无色试剂C.15ml显色液，即3,3一二氨基联苯胺盐酸盐，棕红色配制：取1ml蒸馏水，按顺序滴加A、B、C试剂各一滴混匀，现配现用。4.粉剂型PBS即磷酸盐缓冲液（PBS-0060，福州迈新生物技术开发有限公司)配制：一包PBS粉剂充分溶解于2000ml蒸馏水后使用。5.EDTA抗原修复液（福州迈新生物技术开发有限公司）配制：EDTA抗原修复液用蒸馏水1:50的比例稀释后使用。6.苏木素（延安大学附属医院病理科提供）配制：将2g苏木素溶解于95%乙醇20ml，制成A液。将16g硫酸铝钾放入100ml蒸馏水，加热溶解后，再加300ml蒸馏水，制成B液。等B液室温冷却后加入A液，再加入200mg碘酸钠，搅拌，30min后加入10ml冰醋酸。苏木素复染液制备完成。8 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究其余试剂及设备均由延安大学附属医院病理科提供。2.2.2实验设备切片机(ThermoShandonFinesse325)自动脱水机（LEICAASP300S）包埋机（LEICAEG1150C，德国）生物组织摊烤片机（YT-7FB，湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司）不锈钢高压锅(HPC-1001，福州迈新生物技术开发有限公司)GH型隔水培养箱(天津泰斯特仪器公司)光学生物显微镜(OLYMPUSCX31)数码显微成像系统(尼康DS-SM/SMC)-4℃冰箱（延安大学附属医院病理学提供）2.2.3实验原理本实验采用外在显色剂标记的特异性单/多克隆抗体（兔抗人TGF-β1多克隆抗体、鼠抗人Endoglin单克隆抗体）和胎盘组织中相对应的TGF-β1/Endoglin抗原结合，借助显微镜的显像和放大技术，通过化学显色来确定胎盘组织中的抗原含量，并对其进行定位、定性分析研究。2.2.4实验步骤1.使用切片机将石蜡包块连续切片，切片厚约5um。2.用粘附载玻片在水浴中将组织平整的捞起，然后放在60℃烤片机上烤干，约4-5小时。3.常规脱蜡至水：将预热后的切片依次浸入二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min脱蜡，然后再依次浸入无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各3min。4.蒸馏水冲洗，PBS冲洗3次，5min/次。5.热修复抗原：取配制好的EDTA抗原修复液2000ml于高压锅中，将高压锅放置在电磁炉上大功率加热至沸腾。然后将切片置于塑胶切片架上放入高压锅中，调小功率，继续加热20min后，离开电磁炉，室温下冷却10min，用流水在锅外冲淋。冷却后取出切片。-9- 研究材料与方法6.蒸馏水冲洗，PBS冲洗3次，5min/次。7.用3％过氧化氢(H202)室温孵育20min，以消除内源性过氧化物酶的活性。8.PBS冲洗3次，5min/次。9.加A试剂培养箱孵育lO分钟。10.PBS冲洗3次，5min／次。11.加B试剂培养箱孵育l0分钟。12.拭去血清加一抗试剂，与4℃冰箱中过夜。13.次日从冰箱中取出后室温放置10min，PBS冲洗3次，5分钟／次。14.加C试剂培养箱孵育l0分钟lO分钟，PBS冲洗3次，5分钟／次。15.加D试剂培养箱孵育l0分钟10分钟，PBS冲洗3次，5分钟／次。16.DAB显色：使用DAB显色剂配置后，进行室温下显色，显微镜下控制反应时间，一般在5min左右，蒸馏水冲洗。17.苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。18.镜下观察结果，用已知阳性对照片作为阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照。2.2.5实验结果判定光学显微镜下观察，按照每张切片的阳性细胞的比例及着色深浅进行评分，然后在进行统计学分析。阳性细胞着色评分：<5％为0分，5％-25％为1分，26％-50％为2分，>50％为3分。阳性强度评分：细胞及间质内无阳性棕黄色颗粒或呈均匀一致黄色为0分，细胞及间质可见少量淡黄色颗粒，明显高于背景为1分，较多深棕色颗粒为2分，大量深棕色颗粒为3分。然后根据两项指标之和进行计分。积分0-1分为一，2-3分为+，4-5分为++，＞5分为+++。2.3统计学处理本实验采用SPSS19.0软件包进行统计学处理，ELISA测得的血清中TGF-β1与Endoglin的数据用均数±标准差表示，采用单因素方差分析，实验组各组之间的两两比较采用SNK法检验。免疫组化染色胎盘组织中TGF-β1、Endoglin所得的结果，采用卡方检验，各组之间的两两比较采用卡方分割法（检验水准α根据公式重新规定α´=0.016）。计量资料的相关性分析采用pearson直线相关法，计量资料与半计10 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究量资料及半计量资料之间相关性分析采用Spearman等级相关分析，以a=O．05作为检验的标准，当p≤0．05时，代表差异有统计学意义；当P≤0．01时，表示差异的具有显著的统计学意义。-11- 结果结果1.一般资料的分析正常对照组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组平均年龄分别是27.57±3.21岁、28.40±3.43岁、28.97±3.55岁，平均孕周分别是37.19±0.72周、36.89±0.68周、36.73±0.67周。实验组各组（正常对照组、子痫前期轻度组、子痫前期重度组）相比，在年龄、孕周之间差异无统计学(p<0.05)。见表1。表1.各组一般临床资料的比较例数年龄（岁）孕周（周）正常对照组3027.57±3.2137.19±0.72轻度子痫前期组3028.40±3.4336.89±0.68重度子痫前期组3028.97±3.5536.73±0.672.血清TGF-β1浓度的测定TGF-β1在正常妊娠及子痫前期的血清中均有一定量的表达。在正常对照组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组的浓度分别为673.68±25.16ng/L、930.93±30.34ng/L、1090.88±31.37ng/L，三组之间进行单因素方差分析，差异具有显著的统计学意义(F=1571.18,p=0.000<0.01)。各组之间进行两两比较，差异均具有统计学意义。与正常对照组相比，轻度子痫前期组、重度子痫前期组血清TGF-β1的浓度明显增高，且均具有统计学意义（p<0.01）。重度子痫前期组患者中血清TGF-β1的含量明显高于轻度子痫前期组，差异具有统计学意义（p<0.01）。见表2。3.血清sEng浓度的测定血清sEng在正常对照组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组各组中的浓度分别为24.76±3.39ng/ml、38.15±3.15ng/ml、47.50±3.60ng/ml。随着病情的加重，sEng浓度呈逐渐上升趋势。三组之间进行单因素方差分析，差异具有显著的统计学意义(F=319.53,p=0.000<0.01)。与对照组比较，轻度、重度子痫前期组血清sEng12 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究浓度明显升高，差异具有显著的统计学意义（p<0.01），重度子痫前期组血清中sEng明显高于轻度子痫前期组，且差异具有显著的统计学意义（p<0.01）。见表2，表2.各组血清中TGF-β1和sEng浓度的比较例数血清TGF-β1（ng/L）血清sEng含量（ng/ml）正常对照组30673.68±25.1624.76±3.39轻度子痫前期组30930.93±30.34*38.15±3.15*重度子痫前期组301090.88±31.37*#47.50±3.60*#注：*轻度及重度子痫前期组与正常对照组比较，p<0.01；#轻度与重度子痫前期比较，p<0.014.胎盘组织TGF一β1的表达结果免疫组化染色可见，实验组各组胎盘中都有TGF-β1的阳性表达，TGF-β1主要集中在胎盘的蜕膜细胞及合体滋养细胞的细胞质和细胞膜中，在绒毛间质细胞及血管内皮细胞中也可见少量的表达。在轻度、重度子痫前期胎盘中大量分布着大而粗的深棕黄色颗粒，而正常对照组胎盘中的棕黄色颗粒则数量减少，颜色较浅。在正常对照组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组TGF-β1的阳性率分别是26.67%、276.67%、93.33%，三组之间差异具有显著的统计学意义（x=31.98，p=0．000<0．01）。与对照组相比较，轻度、重度子痫前期组胎盘组织中TGF一β1表达较高，差异具有统计学意义（p<0.016）。而轻度、重度子痫前期组之间比较，差异无统计学意义（p>0.016）。从整体局势可见，病情越重，TGF-β1的表达阳性率越高，成递增的趋势。见表3。见图1、图2、图3。表3.各组胎盘组织中TGF-β1阳性表达的比较例数TGF-β1（例数）阳性率（%）－++++++正常对照组302262026.67轻度子痫前期组30789676.67*重度子痫前期组302713893.33*#注：*轻度及重度子痫前期组与正常对照组比较，p<0.016；#轻度与重度子痫前期比较，p>0.016-13- 结果5.胎盘组织Endoglin的表达结果免疫组化染色显示，Endoglin在三组胎盘组织中均有表达，主要集中在胎盘合体滋养细胞的细胞膜上，并且在血管内皮细胞膜及蜕膜细胞膜上也有少量的表达。随着病情的加重，胎盘合体滋养细胞胞膜逐渐深染，表达逐渐增强。Endoglin在正常对照组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组胎盘中表达的阳性率分别为30.00%、273.33%、93.33%，三组之间差异具有显著的统计学意义（x=27.85，p=0．000<0．01）。三组之间两两比较显示：轻度、重度子痫前期组胎盘Endoglin表达强于正常对照组，差异具有统计学意义（p<0.016）,而轻度、重度子痫前期组比较，差异无统计学意义（p>0.016）。见表4。图4、图5、图6。表4.各组胎盘组织中Endoglin阳性表达的比较例数Endoglin（例数）阳性率（%）－++++++正常对照组302172030.00轻度子痫前期组30898573.33*重度子痫前期组302812893.33*#注：*轻度及重度子痫前期组与正常对照组比较，p<0.016；#轻度与重度子痫前期比较，p>0.0166.相关性分析⑴各组血清中的sEng与血清中的TGF-β1之间呈正相关，相关系数r分别为0.75、0.69、0.72。见图7、图8、图9。⑵各组胎盘组织中TGF-β1与Endoglin的表达有正相关性，相关系数r分别为0.70、0.65、0.72。⑶各组胎盘组织中TGF-β1与血清中的TGF-β1之间有正相关性，相关系数r分别为0.67、0.73、0.71。⑷各组血清中的sEng与胎盘中的Endoglin也呈正相关，相关系数r分别为0.75、0.72、0.71。14 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究图7.正常对照组血清TGF-β1与sEng的散点图图8.轻度子痫前期组血清TGF-β1与sEng的散点图图9.重度子痫前期组血清TGF-β1与sEng的散点图-15- 讨论讨论子痫前期是妊娠特有的疾病中较为严重的一类，其主要以高血压、蛋白尿为特征，累及全身多个器官，严重危害母婴健康。对产妇而言，子痫前期因全身小血管痉挛，内皮损伤，可发生脑水肿、脑出血、肺水肿、心力衰竭、肝肾功能实质性损害等，亦可引起胎盘早剥、HELLP综合征、产后出血等产科并发症。对胎儿而言，因胎盘供血不足，导致胎儿窘迫、胎儿生长受限、死胎、死产等意外。在过去几十年里，国内外学者进行了大量的研究，其确切的病因仍还未阐明。有关研究发现，伴随着胎儿、胎盘的娩出，妊娠期高血压的病理改变可以自行逆转。由此推测子痫[7]前期可能是一组与妊娠相关的胎盘性疾病。大多数学者一致认为子宫螺旋动脉的重铸障碍、胎盘浅着床是妊娠高血压疾病发病的关键所在，而子宫螺旋动脉的重铸障碍的实质是滋养细胞侵蚀能力下降。本实验也意图从这方面研究其发病机制。正常妊娠约10周左右，子宫螺旋动脉管壁的平滑肌细胞、内皮细胞逐渐凋亡，绒毛外滋养细胞开始沿着子宫螺旋动脉浸润，约12周左右达子宫蜕膜层，20周达子宫肌层内1／3，从而使螺旋动脉管径增大，形成子宫胎盘低阻力，以满足正常胎儿血液供应。发生子痫前期时，滋养细胞侵蚀力受到抑制，以至于螺旋小动脉的重铸不足，主要表现为浸润数量的明显减少及深度的下降。相关研究表明，滋养细胞浸润深度大多仅限于蜕膜层，而且胎盘蜕膜板的螺旋动脉血管内滋养细胞未侵入的比例甚至可达30％-50％，致使子宫螺旋动脉不能进行性扩张，胎盘灌注不足而发[8]病。Brosens在研究子痫前期和正常产妇子宫螺旋动脉重铸水平发现，正常产妇子宫螺旋动脉平均直径约500Ntm，而子痫前期的患者平均约200ILm。1.TGF-β1的生物学特征及致病机理1.1TGF-β1的生物学特征TGF-β最初发现于1978年，是从小鼠肉瘤病毒转化的3T3细胞无血清培养液中[9]分离得到的，是一组具有多种生物活性的蛋白超家族。1981年，Roberts等研究发现，TGF-β可以是转化正常的成纤维细胞为肿瘤细胞，故命名为此。TGF-β在人16 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究体中以TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三种形式存在，而TGF-β1在含量、功能上最为重要。TGF-β1是一类具有多种生物学功能的细胞因子，可以由多种组胞织细合成，在哺乳动物界的多种病理和生理过程中都有一定的作用。它通过自分泌和旁分泌的方式，调节细胞的生长分化，参与了炎症反应、免疫调节、组织纤维化和肿瘤的生成。因其生物学功能的复杂性，在不同的细胞之间，同一种细胞不同的生长时期，不同的生理过程中，可以产生完全相左的作用。对于大多数间质细胞、上皮细胞、TB淋巴细胞和内皮细胞，TGF-β1有着抑制其生长的功能．而国内外学者经过大量研究证实TGF-β1的异常升高，对于多种肿瘤细胞（如肺癌、结直肠癌、皮肤癌、胰腺癌、妇科肿瘤等），既有抑制其早期生长的作用，又有促进其后期浸润[10]转移的双重作用。研究发现，TGF-β1的异常表达，还参与了肝脏、胰腺、肾脏及肺各种脏器的纤维化过程。它主要通过刺激各种胶原蛋白、纤粘连蛋白等细胞外基质的合成，调节MMPs、胶原酶的生成和活性实现的。TGF-β1在新生的瘢痕组织[11]及粥样硬化的动脉中亦有异常高水平的表达。Cordeiro等研究发现TGF-β1能够促使典型肉芽组织的形成及伤口愈合。TGF-β1能刺激TIMP-1的表达，抑制ECM的分解，在纤维肉瘤组织修复中有着重要的作用。体外实验研究发现，TGF-β1与TGF-β2协同有着良好的营养神经的作用，并可以维持神经元存活及促进轴突生长。TGF-β1在免疫调节方面起着负调控作用，它能影响免疫细胞的增殖、分化及激活，并且抑制了细胞因子的产生及释放。1.2TGF-β1的致病机理TGF-β1通过抑制滋养细胞浸润，导致胎盘浅着床及血压升高，而引发子痫前期，可能的机理是:①蜕膜细胞分泌的TGF-β1可直接作用于邻近的滋养细胞，抑制其增殖、分化，阻碍其正常的侵润；此外，它还可以刺激细胞外基质（ECM）的合成，从而使胶原蛋白及纤维黏连蛋白得以聚积，而影响滋养细胞的侵润；②滋养细胞分泌的TGF-β1通过自分泌或旁分泌的方式对自身及其周围的滋养细胞产生作用，使其分化成为合体滋养细胞，这种滋养层细胞是没有浸润能力的，故使得其对子宫螺旋动脉的浸润能力下降；③TGF-β1能刺激滋养层细胞基质金属蛋白酶抑制因子的合成及释放，使基质金属蛋白酶活性减弱，从而抑制细胞外基质的分解；此-17- 讨论外，TGF-β1还可激活纤溶酶原抑制因子，使组织激酶的活性受到抑制，细胞外基[12]质的分解减少；④TGF-β1使整合素的表达上调，该作用影响了滋养细胞的迁移能力，对滋养细胞的浸润很不利；⑤TGF-β1对滋养细胞端粒酶的活性可能具有抑制作用，导致滋养细胞的生长和浸润能力减弱；⑥TGF-β1还可以诱导刺激血管内皮细胞表达内皮素（ET）增加，使缩血管因子比例上调，血管收缩，导致血压升高；⑦TGF-β1可能促进肾素、血管紧张素Ⅱ合成及释放，导致肾素-血管紧张素一醛固酮系统失衡，血管呈持续收缩状态，使子痫前期加重。2.Endoglin的生物学特征及致病机理2.1Endoglin的生物学特征Endoglin又称CD105，是一种细胞膜表面的结核性糖蛋白，二硫键连接的同源二聚体，其中包含17个半胱氨酸残基，分子量为180kDa。它是由一个N-端信号肽、一个孤儿域、一个透明带（ZP）结构域、一个近膜区、一个跨膜区和一个短的胞质[13]结构域组成。研究发现，去除所有的糖，其分子量减少了约25kDa。Endoglin主要表达在血管内皮细胞、间质细胞、造血干细胞及胎盘滋养细胞中。胎盘中Endoglin的表达是其在人体内的主要来源。有关研究显示，Endoglin主要存在于足月胎盘的合体滋养细胞中。也有学者发现它在整个孕期都有表达。当血管受到炎症刺激或着有新生血管形成时，血管内皮细胞活化使Endoglin表达增加。动物实验发现，敲]除其编码Endoglin基因的大鼠在妊娠10-14日胎鼠会死亡，其死亡原因是血管发[14]育不良。也有实验证实，血管内皮细胞Endoglin基因的突变会引发1型遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT），这种血管内皮功能障碍，可能是由于破坏了Endoglin与内皮细胞NO合酶（eNOS）的相互作用，致超氧化物的产生和血管舒缩功能受损，[15]主要表现为严重而频繁的出血及血管动静脉畸形。由此发现，Endoglin在维持血管内皮功能的稳定性及新生血管的形成过程中有着重要的作用。大量研究证实，在新愈合的伤口、新生的血管内皮细胞及肿瘤生长迅速的边缘，Endoglin均有特异性[16]的高表达。Endoglin主要的生物学功能是：（1）调节细胞对TGF-β的反应，促进新生血管的形成；（2）维持血管功能的稳定性；（3）作为内皮细胞增殖的标志物。此外，还有一些学者认为，Endoglin还可能有独立于TGF-β以外的其他功能，研18 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究[17]究发现，血管内皮细胞表达的Endoglin只有少部分与TGF-β结合，推断Endoglin可能还有与其他未明确的配体有相互作用。最近研究发现Endoglin与activin—A、[18]骨形态发生蛋白(BMP一2，BMP一7)以及它们相应的信号受体有关联。2.2sEng的生物学特征sEng是Endoglin的一种短的、可溶的形式，主要存在于人体的血液循环中，故被称为可溶性Endoglin（solubleEndoglin,sEng）。与Endoglin相比，sEng缺少跨膜区及胞质区而拥有配体结合域，分子量仅为65kDa。sEng是TGF-β1的细胞表面共受体，对TGF-β1有很高的亲和力，通过与血液循环中的TGF-β1竞争性结合，阻断其与内皮细胞膜上相对应受体TGF-βR的结合，从而使TGF-β1的信号传[19]导中断，引起血管通透性增加，并抑制新生血管的形成。还有学者认为sEng的是通过阻断各种促血管生成因子，如VEGF和PLGF等，而引起的血管内皮细胞受损[20]和生成障碍。动物实验研究发现，sEng的异常表达，可诱发机体的氧化应激反应，释放大量的氧自由基及过氧化脂质等，破坏内皮细胞的完整性，使血管通透性[21]增加，血管内血栓形成。2.3Endoglin及sEng的致病机理Endoglin及其可溶性形式sEng在子痫前期中具体的发病机制尚未完全阐明，可能与以下作用有关：①sEng对滋养细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)以及基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达有抑制作用，使细胞外基质分解下降，影响早孕期滋养细胞的浸润能力，引起子宫螺旋动脉的重铸障碍，导致胎盘滋养细胞浅着床，同时这种[22]作用又会加重胎盘的缺血缺氧，刺激胎盘分泌sEng进入血液循环中；②Endoglin是胎盘释放的合体滋养细胞微粒中的一个重要组成部分，在改变母胎界面纤维溶解蛋白和血管生成的调控中有着很重要的作用，参与了子痫前期的发生过程；③胎盘组织在缺氧状态下，缺氧诱导因子-1(HIF-1)表达增加，激活下游Endoglin基因转录和血清sEng的表达，Endoglin的异常升高，抑制了滋养细胞的侵润及分化，导致胎盘浅着床；④sEng能够和血循环中的TGF-β1相结合，其结果是TGF-β1失去了和血管内皮细胞表面TGF-βRII相结合的能力，致使TGF-β1的信号传递到胞[23]内的过程受阻，导致血管形成过程出现障碍，最终使血管的通透性增加。⑤sEng-19- 讨论可以与血液循环中TGF-β1结合，抑制内皮型一氧化氮合酶(eNOS)中Thr495的去磷酸化的过程，使TGF-β1对内皮细胞的的信号转导过程发生障碍，并且使TGF-β1介导的内皮型一氧化氮合酶的活性受到影响，致使NO合成的量减少，引起血管舒缩失调，血压升高，血栓形成的概率大大增加，使得血管功能及内皮细胞在很大程度上受到损伤。⑥sEng通过阻断各种促血管生成因子如VEGF和PLGF的表达，从[24]而使血管生成障碍及内皮细胞损伤，其作用机理与sFlt相似。3..TGF-β1在子痫前期中的作用3.1TGF-β1在正常妊娠胎盘中的表达[25]Selick等用免疫组织化学法检测发现，TGF-β1在正常胎盘绒毛小叶的合体[26]滋养细胞、细胞滋养细胞及蜕膜细胞和间质中均有少量的表达。Lyall等研究证实，TGF-β1及其受体mRNA在正常子宫蜕膜和滋养细胞中有一定量的表达，且于妊娠17周、34周左右达高峰。在妊娠中期第一个高峰时，细胞滋养细胞大量侵蚀子宫蜕膜层并进入子宫肌层，相互融合形成多核细胞，而在此时TGF-β1能够恰到好处的抑制滋养细胞向子宫肌层的过度侵润。有研究证实，TGF-β1主要定位于合体滋养细胞层，而合体滋养细胞层缺乏增生分裂的活性，其含量的增多，提示TGF-β1可能参与抑制滋养细胞向母体肌层的过度侵润，精密的调控着正常妊娠的发展。在妊娠末期的第二个高峰时，细胞滋养细胞因胎盘生长DNA的减少，增殖接近停止，TGF-β1的增多可能以某种方式影响胎盘DNA的合成，从而抑制滋养细胞的增殖和胎盘的过度生长。研究发现，TGF-β1在血管形成方面也有很重要的作用，它可以促使新生血管形成、调节血管壁的完整性，同时可以促进子宫内膜蜕膜化，调节胎[27]盘的生长及滋养细胞的增殖分化。TGF-β1亦可通过抑制淋巴细胞的增殖分化和单核细胞产生TGF-α，抑制妊娠期早期母体的免疫反应，参与母体免疫耐受的建立，维持正常的妊娠过程。此外，研究发现，TGF-β1在妊娠末期可增加子宫的兴奋性和收缩性。本实验研究发现，TGF-β1在正常产妇胎盘中也有少量的表达，主要分布于在蜕膜细胞、合体滋养层细胞、绒毛间质细胞的细胞膜和细胞质中。由此可以推断，TGF-β1在正常妊娠过程中是一个不可缺少的调控因子。3.2TGF-β1在子痫前期胎盘中的表达20 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究子痫前期的发病原因跟胎盘的形成缺陷有着密切的关系。滋养细胞的正常侵润受到抑制，导致胎盘浅着床，子宫螺旋动脉重铸障碍，导致胎盘缺血缺氧，引起[28]子痫前期的发生。Benian等的研究发现，子痫前期患者胎盘中TGF-β1的表达明显高于正常孕产妇，且随着血压的升高，病情的严重程度加剧，含量有明显增加趋势。Irving等在体外实验中证实，TGF-β1的异常表达有抑制滋养细胞正常侵润的[29]作用。符爱珍等研究发现，在同一实验条件下，TGF-β1可以抑制正常滋养细胞的增殖，却对绒毛膜癌JAR细胞的增殖有促进作用。本实验采用免疫组化法检测正常孕产妇、轻度子痫前期、重度子痫前期胎盘组织中TGF-β1的表达水平，发现轻度、重度子痫前期较正常对照组表达明显升高，差异具有显著的统计学意义（p<0.016）。轻度、重度子痫前期组比较，差异无统计学意义（p>0.016）。而且随着病情的发展加重，胎盘组织TGF-β1的表达成递增趋势。由此提示，TGF-β1的过度表达可能参与了妊娠期高血压疾病的发生及发展，且与病情的严重程度的有关。3.3TGF-β1在血压调节中的作用TGF-β1还可能参与了血压的调节。母血中TGF-β1的异常升高可能促使血管内皮细胞分泌内皮素增多，内皮细胞功能紊乱，血管平滑肌收缩，从而使血压升高；此外，TGF-β1亦可刺激肾脏分泌肾素，使血管紧张素Ⅱ增加，血压升高，肾素一血管紧张素一醛固酮系统失衡，引发妊娠期高血压疾病的特征性表现。Shaarawy等[30]研究发现，重度子痫前期组母血中TGF-β1的表达水平明显升高，且与血肌酐、尿酸的水平，胎儿生物学评分、低体重儿成正相关，推测，血母中TGF-β1的表达水平对妊娠期高血压疾病严重程度的评估及胎儿结局的分析都有一定的价值。然而也有学者研究发现，妊娠高血压疾病患者血清中TGF-β1的表达水平低于正常孕妇，是由于外周血淋巴细胞分泌TGF-β1减少，TH1细胞的活性升高，TH2的活性降低，[31]TH1细胞/TH2细胞免疫失衡的结果。各个学者研究结果的差异，可能受多种因素的影响，如临床因素、检测方法、样本量、试剂等不同。而且TGF-β1的含量也与缺血、缺氧、其他细胞因子的影响有关。本次试验研究显示，与正常对照组相比，轻度子痫前期组、重度子痫前期组血清TGF-β1的浓度明显增高，且均具有统计学-21- 讨论意义（p<0.01）。重度子痫前期组患者中血清TGF-β1的含量明显高于轻度子痫前期组，差异具有统计学意义（p<0.01）。相关性分析显示，三组胎盘组织中TGF-β1与血清中TGF-β1均存在正相关性，由此推测，血清中TGF-β1可能来源于胎盘组织的分泌，并与胎盘TGF-β1协同，共同参与了子痫前期的发病过程。4.Endoglin、sEng在子痫前期中的作用4.1、sEng在子痫前期血清中的表达水平有关研究发现，在正常非妊娠妇女，血清sEng水平很低几乎很难测到，在进入妊娠过程中，随着孕周的增加，逐渐缓慢上升，进入妊娠25周后大幅度增加，分[32]娩前达到高峰，在胎盘胎儿娩出后又逐渐恢复至非孕水平。有学者对妊娠期高血压疾病血清中sEng检测发现，轻度子痫前期组、重度子痫前期组及HELLP组sEng水平程逐步递增趋势，与同期正常妊娠组相比，分别是其3、5、10倍。而在胎盘胎儿娩出后48h，血清sEng迅速下降约70%。故推断，sEng可能是由胎盘组织分泌，[33]释放到血液循环中，引起血管内皮受损，血压升高，妊娠期高血压疾病的发生。[34]Venkatesha等研究发现，通过腺病毒转染sEng的孕鼠，临床上只出现平均动脉压的升高和轻度蛋白尿，而将sEng与sFlt-1同时通过腺病毒转染给孕鼠，这一效应被扩大，甚至出现HELLP综合征（即溶血、肝酶升高和血小板减少）、胎儿生长受限等严重的子痫前期症状，而且随着血清sEng表达的增高病情越重。组织学检查发现有严重的肾小球内皮增生、胎盘梗死、肝区坏死及外周血中的细胞碎片。研究发现，sEng与sFlt-1过度表达会导致局造性的血管痉挛、高血压、脑水肿，类[35]似于后可逆性脑病综合征。大量研究表明，胎盘组织通过释放到血液循环中的一些血管生成抑制因子，引起内皮细胞受损，功能障碍，从而参与了妊娠期高血压疾病的发生。本实验采用ELISA法检测各组研究对象血清中sEng浓度发现，正常对照组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组血清sEng的含量随着病情的加重，逐渐[36][37]升高，且各组之间差异均具有统计学意义。与Levine、刘蔚等研究成果相一致。4.2Endoglin在子痫前期胎盘中的表达本实验还采用免疫组化检测胎盘组织中的Endoglin表达，Endoglin主要于胎盘合体滋养细胞的细胞膜上表达，还可见于血管内皮细胞及蜕膜细胞。研究发现轻度、重度子痫前期组胎盘Endoglin表达强于正常对照组，差异具有统计学意义22 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究（p<0.016）,而轻度、重度子痫前期组比较，差异无统计学意义（p>0.016）。且随[34]着病情的逐渐加重，各组胎盘表达有逐渐增加趋势。Venkatesha等采用了同样的方法检测胎盘组织中和血清中的Endoglin，发现Endoglin染色主要定位于胎盘合体滋养层，且Endoglin和sEng在子痫前期患者中均有明显的升高。有关研究发现，[38][39]子痫前期患者胎盘表达Endoglin是正常孕妇的2.5倍。Sa’nchez-ElsnerT等体外培养胎盘滋养细胞发现，在低氧状态刺激下，sEng表达可显著升高，从而使滋养细胞的浸润能力下降。这种表达的增加主要是通过缺氧诱导因子-1(HIF-1)介导的。在正常妊娠孕早期胎盘Endoglin的表达相对较高，大约10周左右达高峰，之后则逐渐降低，这可能胎盘形成过程中氧环境的变化有关。子痫前期发生时，由于胎盘持续的缺血、缺氧，上调了HIF-1a的表达，从而刺激Endoglin及血清sEng的表达增加，Endoglin的异常表达，抑制了滋养细胞的侵润及分化，导致滋养细胞侵润过浅；同时，胎盘通过释放抗血管生成因子sEng到血液循环中，导致血管内皮受损和生成障碍，引起全身小血管痉挛，从而加重了胎盘的缺血缺氧，促使子痫[40]前期的发生发展。本实验还通过对各组胎盘组织中的Endoglin和血清中的sEng进行相关性分析，发现各组两者之间成正相关性，故推测血清中的sEng增加是由胎盘组织分泌增加所致。5.血清TGF-β1、sEng及胎盘TGF-β1、Endoglin的相关性分析本实验对血清TGF-β1、sEng进行了相关性分析，结果表明，各组血清中的sEng与TGF-β1之间变化趋势相同，呈正相关。sEng作为TGF-β1及TGF-β3的复合受体，与TGF-β有高度的亲和力，通过调节细胞对TGF-β的反应，参与了血压的调控。sEng与血循环中的TGF-β1相结合，阻止其与血管内皮细胞表面TGF-βRII相结合，致使TGF-β1的信号传递中断，导致血管形成障碍，血管的通透性增加，血管血压升高，引起子痫前期胎盘外的一系列临床症状。本实验还对胎盘组织TGF-β1、Endoglin进行了相关性分析，各组胎盘组织中TGF-β1与Endoglin的表达水平有正相关性，由此推测，TGF-β1与Endoglin可能通过一系列复杂的相互作用，抑制滋养细胞的侵润，导致子宫螺旋动脉重铸障碍，胎盘浅着床，共同参与了子痫前期的发病过程。6.不足与展望-23- 讨论本实验通过对子痫前期血清TGF-β1、sEng水平及胎盘TGF-β1、Endoglin表达的检测，及其相关性分析，研究表明，两者的异常表达与子痫前期的病理过程密切相关。且随着病情的加重表达逐渐升高。但由于样本例数较少、实验设备的限制及时间关系，实验结果的准确性还需要进一步研究证实。今后应继续扩大样本量、进行多种体内外实验，改善实验设备，投入更多的时间，通过多种方式深入研究子痫前期的发生发展过程。24 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究结论1.血清TGF-β1、sEng参与了正常妊娠及子痫前期的发生过程。且病情越重，血清TGF-β1、sEng的表达越高。2.胎盘组织中TGF-β1、Endoglin的过度表达，与子痫前期发病关系密切，随着病情的加重，表达逐渐增加。3.血清sEng可能是胎盘组织分泌Endoglin的一种可溶性形式，并通过与TGF-β1之间的相互作用共同参与了血液循环中血压的调控及内皮细胞的损害。-25- 参考文献参考文献[1]KaufmannP,BlackS,HuppertzB.Endovasculartrophoblastinvasion:implicationsforthepathogenesisofintrauterinegrowthretardationandpreeclampsia[J].BiolReprod,2003,69:1–7.[2]SchillingB，YehJ．Transforminggrowthfactor-beta(1),-beta(2)，-beta(3)andtheirtypeIand11receptorsinhumantermplacenta[J]．JGynecolObstetInvest，2000；50(1)：19-23．[3]IrvingJA，LalaPK．FunctionalRoleofCellSurfaceIntegrinsOnHumanTrophoblastCellMigration：RegulationbyTgf-Beta，Igf-li，andIgfbp-1[J]．ExpCellRes，1995，217(2)：419-427．[4]BenianA,MadazliR,Aksuf,etal.Plasmaandplacentallevelsofinterleukin-10.transforminggrowthfactor-beta1andepithelial-cadherininpreeclampsia[J].ObstetGynecol,2002，100(2):327-331.[5]JohanssonS，FuchsA，OkvistAetal，ValidationofEndogenousControlsforQuantitativeGeneExpressionAnalysis：ApplicationOnBrainCorticesofHumanChronicAlcohohcs．[J]BrainRes，2007，1132(1)：20～28．[6]VenkateshaS，ToporsianM，LainC，et，a1．SolubleEndoglinContributestothePathogenesisofPreeclampsia[J]．NatMed．2006，12：642-649．[7]BenianA，MadzliR，Aksu，eta1．Plasmaandplacentallevelsofinterleukin一10，transforminggrowthfactor'betal，andepithelial，cadherininpreeclampsia[J]．ObstetGynecol，2002，100(2)：327—331[8]MervilP，Evain—BrionD，ChallocrJC，etal．Themolecularbasisofembryoimplantationinhuman．IentralblGynak01．2001，123(6)：328—329．[9]LinHY，MoustakasA，Tgf-BetaReceptors：StructureandFunction[J],CellMolBiol(Noisy-le—grand)，1994，40(3)：337—349．[10]李佳，韦敏怡．转化因子β1对肿瘤免疫抑制作用的研究进展[J]．医学综述，2008，14(3)：350—352.[11]CordeiroMF．Beyondmitomycin：TGF—betaandwoundhealing[J]．ProgRetinEyeRes，2002，2(1)：75.[12]XuG，ChakrabortyC，LalaPK．RestorationofTGF—betaRegulationofPlasminogen26 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究ActivatorInhibitor2inSmad32RestitutedHumanChoriocarcinomaCell[J]．BiochemBiophysResCommun，2002，294(5):1079-1086．[13]DennisAT,CastroJ,CarrC,etal.Haemodynamicsinwomenwithuntreatedpre-eclampsia[J].Anaesthesia,2012,67:1105-1118.[14]Red—HorseK,ZhouY，GenbaeevO，etal．Trophoblastdifferentiationduringem—Bryoimplantationandformationofthematemal—fetalinterface[J]．JClinInvest,2004，l14(6)：744-7546.[15]GoodwinBL,PendletonLC,LevyMM,etal.Tumornecrosisfactor-areducesargininosuccinatesynthaseexpressionandnitricoxideproductioninaorticendothelialcells[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2007,293:1115-1121.[16]KeiserSharonD,VeillonEdwardW,ParrishMarcR,etal.Effectsof17-hydroxyprogesteroneontumornecrosisfactor-alpha-inducedhypertensionduringpregnancy[J].AmJHyp,2009,22(10):1120-1125.[17]CheifetzS,BellonT,CalesC，eta1．Endoglinisacomponentofthetransforminggrowthfactor-betareceptorsysteminhumanendothelialcells[J]．JBiolChem，1992，267：19027-19030.[18]BarbaraNP，WranaJL，LetarteM．EndoglinisanaccessoryproteininthatInteractswiththesignalingreceptorcomplexofmultiplemembersofthetransforminggrowthfactor—betasuperfamily[J]．JBiolChem，1999，274：584．594[19]RuizS,MorenoP,GumiJ,etal.AReal-TimeRt-PcrAssayforDetectionandAbsoluteQuantitationofCitrusTristezaVirusinDifferentPlantTissues[J].JVirolMethods,2007,145(2):96-105.[20]Lopez-NovoaJM.SolubleEndoglinisanAccuratePredictorandaPathogenicMoleculeinPre-Eclampsia[J].NephrolDialTransplant,2007,22(3):712-714.[21]ChenY,HaoQ,KimH,etal.SolubleEndoglinModulatesAberrantCerebralVascular-Remodeling[J].AnnNeurol,2009,66:19-27.[22]董微，许群星，韩玉环等.可溶性endoglin减弱人早孕细胞滋养细胞的浸润功能[J].ActaPhysiologicaSinica,2011,63(3):267-271-27- 参考文献[23]VenkateshaS，ToporsianM，LarnC，etal．Solubleendoglincontributestothepathogenesisofpreeclampsia[J]．NatMed,2006，12（6）：642-649．[24]LuftFC．Solubleendoglin(sEng)joinsthesolublefinsliketyrosinekinase(sFlt)receptorasapre-eclampsiamolecule[J]．NephrolDialTran—SplanL2006，21(11)：3052-3054．[25]SelickCE，HorowitzGM，GratchMetal，ImmunohistoehemiealLocalizationofTransformingGrowthFactor-BetainHumanImplantationSites，JClinEndocrinolMetab，1994,78(3)：592-596．[26]LyallF，SimpsonH，BulrnerJNetal，TransformingGrowthFactor-BetaExpre．ssioninHumanPlacentaandPlacentalBedinThirdTrimesterNormalPregnancy，Preeclampsia，andFetalGrowthRestriction,AmJPathol，2001，159(5)：l827-1838．[27]SalahuddinS,LeeY，VadnaisiM，ela1．DiagnosticutilityOfsolublefmsliketyrosinekinaseandsolubleendoglininhypertensivediseasesofpregnancy[J]．AmJObstetGynecol，2007，197(1)：28[28]BenianA，MadazliReta1．Plasmaandplacentallevelsofinterleukin．10，transforminggrowthfactor—betal，andepithelial．cadherininpree．clampsia[J]．ObstetGynecd，2002，100(2)：327—331[29]符爱珍，蔡永广，李英勇等．TGF．8I对人早孕滋养层细胞和绒毛膜癌JAR细胞增殖的影响及其意义[咒．中国妇幼保健，2008，23(18)：2582—25851.[30]ShaarawyM，EIMeleigyM，RasheedKMaternalSUllltransforminggrowthfactorbeta-2inpreeclampsiaandeclampsia,apotentialbiomarkerfortheassessmentofdiseaseseverityandfetaloutcome[J]．JSocGynecolInveStig，2001，8(1)：27—31．[31]WilezynskiJK,GlowackaE，ChonarM．DeficientOftransformingGrowthFactor一81leadstoimmunologicnon-balanceinpreeclampsia．GinekolPol，2000，7I(6)：464-465．[32]焦淑静．妊高征患者血清VCAM一1联合VEGF检测价值[J].冲原期刊，2006，33(24)：87.[33]ClausenT，DjurovicS，BrosstadFR，eta1．Alteredcirculatinglevelsofadhesionmoleculesat18weeks’gestationamongwomenwitheventualpreeclampsia．indicatorsofdisturbeplacentationinabsenceofevidenceofendothelialdysfunction,2000，182(2)．321—325.28 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究[34]VenkateshaS,ToporsianM,LamCetal，SolubleEndoglinContributestothePathogenesisofPreeclampsia,NatMed，2006，12(6)：642．649．[35]A.S.Maharaj,T.E.Walshe,M.Saint-Geniez,etal.VEGFandTGF-betaarerequiredforthemaintenanceofthechoroidplexusandependyma[J].JExpMed,2008,205(2):491-501.[36]王福玲，孙惠安，等．血管细胞黏附分子在妊高征患者子宫胎盘床表达的意义[J]．中国全科医学，2005，8(2)：104．105[37]Zhou，Y，DmaskyCH，ChiuK，eta1．Preeelmapsiaisssosiatedwithabnomalexpressionofdahesionmoleculesby，invasivecytotorPhoblasts．JClinInvest，1993，91(3)：950960.[38]JeyabalanA，McGonigalS,GilmourC，HubelCARajakumarA．Circulmingandplacentalendoglinconcentrationsinpreganaciescomplicatedbyintrautfinegrowthrestrictionandpreeclampsia．Placenta,2008(29)：555—563．[39]Sa’nchez．EisnerT，BotellaLM，VelaseoB，etal．Endoglinexpressionisre—gulatedbytranscriptionalcooperationbetweenthehypoxiaandtransforminggrowthfactor-betaPathways[J]．JBiolChem2002，277(46)：43799-43808．[40]许群星，HDCP患者胎盘及子宫肌层endoglin和TGF－β1的表达及其与血清sEng及TGF-β1相关性研究[D]，天津，天津医科大学，2011.-29- 附图附图图1.正常对照组胎盘TGF-β1的阳性表达图2.轻度子痫前期组胎盘TGF-β1的阳性表达图3.重度子痫前期组胎盘TGF-β1的阳性表达图4.正常对照组胎盘Endoglin的表达图5.轻度子痫前期组胎盘Endoglin的表达图6.重度子痫前期组胎盘Endoglin的表达30 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究综述TGF-β1及其受体Endoglin在子痫前期疾病中的研究进展子痫前期一般于妊娠20周后起病，以血压升高和蛋白尿为临床特征，可伴有全身多器官损伤及功能障碍、胎儿生长受限、胎儿宫内窘迫等，情况严重者可发生抽搐，甚至危及生命。子痫前期病因复杂，可能是多因素作用的结果，遗传、免疫、胎盘功能异常、炎症反应等都参与其中，然而，滋养细胞功能异常是子痫前期发生的最主要的原因，滋养细胞侵袭力下降导致螺旋动脉重铸不足、胎盘浅着床，造成胎盘组织血供减少，胎盘处于一种缺氧环境，致使滋养细胞分泌释放一些功能尚未明确的细胞因子，导致血管内皮损伤、炎症免疫过度激活，从而使子痫前期从胎盘局部发展到全身各个器官。目前国内外研究发现转化生长因子-β1（TGF-β1）及其受体Endoglin与滋养细胞侵润不足，炎症激活，导致血管内皮损伤关系密切。1TGF-β1转化生长因子β(TGF-β)是一组分子量为25KD且结构相关的二聚体多肽，主要调节细胞的生长及分化。TGF-β能转化正常的成纤维细胞表型。TGF-β有4种亚型（TGF-β1、β2、β3和β1β2），TGFβ1-3氨基酸序列具有高度的同源性，故其产生的生物学功能也基本相似。对TFG-β进行基因序列分析，TGF-β1-3基因均含[1]7个外显子，在染色体上分别定位于第19q13、1q41、14q24号。TGF-β是通过与其细胞膜上特异性受体TGF-βR结合发挥其生物学效应，TGF-βR有TGF-βRI、II、III三型。III型受体TGF-βRIII又名Endoglin。TGF-β通过与TGF-βRII受体自由结合，然后和TGF-βRI结合形成TGF-β-TGF-βRI-TGF-βRII复合物。TGF-βRIII作为抗原提呈细胞，不直接参与信号转导，而是将TGF-β提成给信息受体，调节TGF-β的胞内信号传导。其中Smad作为TGF-β胞内受体蛋白起着至关重要的作用。TGF-β1对多种组织细胞的增殖、分化、凋亡起着调控作用。TGF-β1可抑制多种上皮细胞的生长（如血管、肺、胃黏膜、肝、胆管、卵巢等），促使其终末分化-31- 综述或凋亡，还可增加细胞粘附作用和细胞外基质的形成，对上皮细胞的生长及代谢起[2~5]到平衡作用。TGF-β1对不同的细胞或同一细胞的不同功能状态可显示完全不同的功能。TGF-β1在免疫调节方面起着负调控作用，它能影响免疫细胞的增殖、分化及激活，并且抑制细胞因子的产生及释放。2TGF-β1与子痫前期[6]Schilling等研究证明,TGF-β1及其受体mRNA在正常妊娠孕妇的子宫蜕膜细胞及滋养细胞中均有表达。正常妊娠约10周左右，子宫螺旋动脉管壁的平滑肌细胞、内皮细胞逐渐凋亡，绒毛外滋养细胞开始沿着子宫螺旋动脉浸润，约12周左右达子宫蜕膜层，20周达子宫肌层内1/3，从而使螺旋动脉管径增大，形成子宫胎盘低阻力，以满足正常胎儿血液供应。发生子痫前期时，滋养细胞侵蚀力受到抑制，以至于螺旋小动脉的重铸不足，主要表现为浸润数量的明显减少及深度的下降。滋养细胞浸润深度大多仅限于蜕膜层，而且胎盘蜕膜板的螺旋动脉血管内滋养细胞未[7][8]侵入的比例可达30％~50％。Iring等开展的体外试验显示，TGF-β1对滋养细[9]胞浸润有抑制作用。BenianA等研究发现胎盘绒毛滋养细胞和蜕膜细胞中有TGF-β1、TGF-βRI、TGF-βRII的表达,且和正常妊娠组相比子痫前期组的表达程度更高。提示TGF-β1可能参与滋养细胞和蜕膜细胞功能的调节而导致妊娠期高血压疾病的发生。TGF-β1抑制滋养细胞浸润，导致胎盘浅着床及血压升高，可能的机理是:(1)TGF-β1通过自分泌或旁分泌的方式对自身及其周围的滋养细胞产生作用，使其分化成为合体滋养细胞，这种滋养层细胞是没有浸润能力的，故使得其对子宫螺旋动脉的浸润能力下降；(2)TGF-β1可能使滋养层细胞基质金属蛋白酶抑制因子及纤溶酶原激活抑制因子激活并释放，以至于基质金属蛋白酶和组织激酶的活性受[10]到抑制，细胞外基质的分解减少，此外，TGF-β1对细胞外基质的合成有促进作用，使纤维黏连蛋白及胶原蛋白得以堆积，从而抑制滋养细胞浸润；(3)TGF-β1使整合素的表达上调，该作用影响了滋养细胞的迁移能力，对滋养细胞的浸润很不利；(4)TGF-β1对滋养细胞端粒酶的活性可能具有抑制作用，导致滋养细胞的生长和浸32 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究润能力减弱；(5)TGF-β1还可诱导刺激血管内皮细胞表达内皮素（ET）的增加，使缩血管因子比例上调，血管收缩，导致血压升高；(6)TGF-β1可能促进肾素、血管紧张素Ⅱ合成及释放，导致肾素-血管紧张素一醛固酮系统失衡，血管呈持续收缩状态，使子痫前期病情加重。3EndoglinEndoglin又称CDl05，是TGF-β受体复合物的成分之一。Endoglin位于人类染色体第9q34号，由658个氨基酸残基组成。它由两个同源单体构成的二聚体，并由二硫键相连，在人体内存在S-Endoglin和L-Endoglin两种异构体。L-Endoglin尾部氨基酸比S-Endoglin的相应区域多33个。它能调节细胞对TGF-β的反应，是细胞膜表面表达的一种糖蛋白。在新愈合的伤口、新生的血管内皮细胞及肿瘤生长迅速的边缘均高表达，也可表达于合体滋养层细胞、巨噬细胞、红系祖细胞中，调控血管内皮细胞的增殖。Endoglin基因突变能引起遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT)的发生。敲除其编码基因的大鼠在妊娠10~14日胎鼠会死亡，其死亡原因是[11]血管发育不良。4可溶性Endoglin（sEng）[12]可溶性Endoglin（sEng）是Venkatesha等在对endoglin免疫沉淀物进行Western杂交时分析观察到的endoglin的一种形式，它能够释放到血液循环中，以一种短的、可溶性的方式存在，和Endoglin比较缺少跨膜区及胞质区而拥有配体结合域。sEng在妊娠期水平显著增高，分娩后则迅速降低，提示胎盘可能是妊娠期[13][14]sEng的主要来源。Romero等研究发现，血清sEng在正常未孕妇女体内表达极低甚至测不到，而当孕妇处于妊娠早期时其上升的幅度较慢，妊娠25周后幅度增大，到分娩前期达最高峰，分娩后其水平逐渐降低至未孕时的状态。正常妊娠过程中血清sEng水平在33~36周之前基本处于稳定状态，随着时间的推移逐渐上升一直到结束分娩。5Endoglin与子痫前期[15]刘蔚等对Endoglin进行免疫组化研究发现，Endoglin在子痫前期胎盘中的表达增高,它随着疾病病情的加重而逐渐升高。提示胎盘中Endoglin表达升高可能-33- 综述是子痫前期发病的重要机制。但Endoglin是如何引起子痫前期的机制尚不清楚。低氧对Endoglin的表达有促进作用，其机制可能是在低氧的状况下缺氧诱导因子[16]（HIF-1）上调了Endoglin的表达。胎盘缺血缺氧，使得HIF-1和Endoglin表[17]达增多，从而可能导致滋养细胞浅着床，发生子痫前期。Caniggia等试验证实，当使用反义的寡核苷酸或endoglin抗体阻断endoglin的表达后，绒毛外细胞滋养细胞分化和浸润的程度得以加强，这就提示endoglin作为一种负性调节因子在调节滋养细胞分化侵入的过程中起着关键性的作用。6sEng与子痫前期[18]蒋玉蓉等研究发现轻度、重度子痫前期组血清sEng水平明显高于正常晚孕组,且重度子痫前期患者高于轻度子痫前期患者，推测，sEng的异常表达可能与子痫前期的严重程度有关。大量研究发现，sEng在妊娠期高血压疾病临床症状出现前[19]数周至数月已经有明显的升高。而具体升高时间，报道结果则各有差异。倪洁等[20]研究发现早在妊娠中期24-27周，就有血清sEng的高表达。何尧等报道sEng表[21]达开始升高发成在妊娠15-20周左右，Savvidou等报道血清sEng在妊娠23-25[22]周开始升高，而DeVivo等报道sEng于妊娠24-28周开始升高。Levine等通过[23]对子痫前期血清sEng的表达研究发现，sEng在临床症状出现前8-10周开始升高，在临床症状出现后达高峰，在分娩后迅速降至未孕水平，且与病情的严重程度呈正[24]相关性。Sarosh研究表明，在疑似子痫前期34周前测量sEng的表达水平，可以更早的预测子痫前期的发生。有学者研究发现，子痫前期合并胎盘早剥的患者sEng、sFlt-1和PlGF表达高于对照组，故推测联合sEng、sFlt-1和PlGF来预测子痫[25]前期效果更佳。sEng作为血清中一种独立的标志物，可能在临床上早期预测妊娠期高血压的发病有着重要的作用。sEng引起妊娠高血压疾病全身血管内皮损伤可能的发生机制：(1)sEng能够和血循环中的TGF-β1相结合，其结果是TGF-β1失去了和血管内皮细胞表面TGF-βRII相结合的能力，致使TGF-β1的信号传递到胞内[26]的过程受阻，导致血管形成过程出现障碍，最终使血管的通透性增加。(2)sEng可与TGF-β1结合，抑制内皮型一氧化氮合酶(eNOS)中Thr495的去磷酸化的过程，使TGF-β1对内皮细胞的的信号转导过程发生障碍，并且使TGF-β1介导的内皮型34 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究一氧化氮合酶的活性受到影响，致使NO合成量减少，引起血管舒缩失调，血压升高，血栓形成的概率增加，使得血管功能及内皮细胞在很大程度上受到损伤。(3)sEng通过阻断各种促血管生成因子如VEGF和PLGF的表达，从而使血管生成障[27]碍及内皮细胞损伤，其作用机理与sFlt相似。7不足及展望多年以来，大量学者致力于研究子痫前期的病因，也有了很多学说支持子痫前期的发病过程，但是其确切病因及发病机制尚未阐明。研究其病因，归根结底是为了解决这一多年来危害人类健康的难题。目前临床上仍然以镇静、解痉、降压等对症处理为主，尽量延长孕周，以减少早产给新生儿带来的危害。然而处在妊娠高血压疾病中的胎儿处于一种缺血缺氧状态，在宫内同样会受到伤害。故研究出干预措施迫在眉睫。我们可通过针对Endoglin、TGF-β靶向治疗来促进滋养细胞的正常浸润，改善血管内程皮细胞炎症损害，使胎盘正常着床。另外，临床上可通过检测血清sEng水平更早的预测子痫前期的发生，有利于早发现、早治疗。这将为我们今后的研究方向提供新思路。-35- 参考文献参考文献[1]董微.sEng、TGFâ与妊娠期高血压疾病发生的相关性研究.天津医科大学，2012.[2]MadazliR,BenianA,IlvanS,etal.Placentalapoptosisandadhesionmoleculesespressionintheplacentaandthematemalplacentalbedofpregnaciescomplicatedbyfetalgrowthrestrictionwithandwithoutpre-eclampsia.ObstetGynaecol,2006,26(1):5-10.[3]ValdesF,MurilloMM,ValverdeAM.Tranforminggrowthfactor-betaactivatesbothpro-apoptoticandsurvivalsignalsinfetalrathepatocytes.ExpCellEes,2004,292(1):209-218.[4]JonesRL,StoikosC,FindlayJK,etal.TGF-betasuper-familyexpressionandactionsintheendometriumandplacenta[J].Reproduction,2006,132(2):217-232.[5]EnquobahrieDA,WilliamsMA,QiuC,etal.Matemalplasmatransforminggrowthfator-beta1concentrationsinpre-eclampticandnormotensivepregnantZimbabweanwomen[J].MeternFetalNeonatalMED,2005,17(5):343-348.[6]SchillingB,YehJ.Transforminggrowthfator-beta(l),-beta(2),-beta(3)andtheirtypeIandIIreceptorsinhumantermplacenta[J].GynecolOb,stetInvest,2000,50(1):19-23.[7]MervilP，Evain—BrionD，ChallocrJC，etal．Themolecularbasisofembryoimplantationinhuman．IentralblGynak01．2001，123(6)：328—329．[8]IrvingJA，LalaPK．FunctionalRoleofCellSurfaceIntegrinsOnHumanTrophoblastCellMigration：RegulationbyTgf-Beta，Igf-li，andIgfbp-1[J]．ExpCellRes，1995，217(2)：419-427．[9]BenianA,MadazliR,Aksuf,etal.Plasmaandplacentallevelsofinterleukin-10.transforminggrowthfactor-beta1andepithelial-cadherininpreeclampsia[J].ObstetGynecol,2002，100(2):327-331.[10]XuG，ChakrabortyC，LalaPK．RestorationofTGF—betaRegulationofPlasminogenActivatorInhibitor2inSmad32RestitutedHumanChoriocarcinomaCell[J]．BiochemBiophysResCommun，2002，294(5):1079-1086．[11]Red—HorseK,ZhouY，GenbaeevO，etal．Trophoblastdifferentiationduringem—bryoimplantationandformationofthematemal—fetalinterface[J]．JClinInvest,2004，l14(6)：744-754．36 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究[12]VenkateshaS,ToporsianM，LamC，etal．Solubleendoglincontributestothepathogenesisofpreeelampsia[J]．NatMed，2006，12(6)：642-649．[13]VenkateshaS,ToporsianM,LamC,etal.SolubleEndoglincontributestothepathogenesisofpreeclampsia[J].NatMed,2006,12(6):555[14]RomeroR,NienJK,EspinozaJA.Longitudinalstudyofangiogenic(placentalgrowthfactor)andanti-angiogenic(solubleendoglinandsolublevascularendothelialgrowthfactorreceptor-1)factorinnormalpregnancyandpatientsdestinedtodeveloppreeclampsiaanddeliveryasmallforgestationalageneonate[J].JMaternFetalNeonatalMed,2008,21(1):9-23[15]刘蔚.子痫前期患者血清中sFlt一1和sEng水平及胎盘中Endoglin表达的研究[D],泸州，泸州医学院，2010[16]JeyabalanA,McGoniqalS,CdlmourC，etal．Circulatingandplacentalendoglinconcentrationsinpregnanciescomplicatedbyintrauterinegrowthrestrictionandpreeclampsia[J]．Placenta,2008，29(6)：555—563．[17]CaniggiaI,TaylorCV，Knox-RitchieJW，etal．EndoglinRegulatesTrophoblastDifferentiationalongtheInvasivePathwayinHumanPlacentalVillousExplants[J]．Endocrinology，1997,138(11)：4977-4988．[18]蒋玉蓉，可溶性Endoglin与子痫前期发病机制的研究[D],长沙，中南大学，2009[19]倪洁，子痫前期患者血清中AT1-AA和sEng的表达水平、临床意义及其预测价值[D]，苏州，苏州大学，2014；[20]何尧,方敏等.子痫前期可溶性CD105的表达及变化意义[J].中国实用妇科与产科杂志,2010,26:537-539.[21]SawidouMD,NooriM,AndersonJM,etal.Maternalendothelialfunctionandserumconcentrationsofplacentalgrowthfactorandsolubleendoglininwomenwithabnormalplacentation[J].UltrasoundObstetGynecol,2008,32(7):871-876.[22]DeVivoA,BavieraG,GiordanoD,etal.Endoglin,PIGFandsFlt-1asmarkersforpredictingpre-eclampsia[J].ActaObstetGynecolScand,2008,87(8):837-842.[23]LevineRJ,LamC,QianC,etal.Solubleendoglinandothercirculatingantiangiogenic-37- 参考文献factorsinpreeclampsia[J].NEnglJMed,2006,355(10):992-1005.[24]SaroshRana,AnaSofiaCerdeira,JuliaWenger,etal.PlasmaConcentrationsofSolubleEndoglinversusStandardEvaluationinPatientswithSuspectedPreeclampsia[J].PloSONE,2012,7(10):e48259.[25]C.Signore,J.L.Mills,C.Qian,etal.Circulatingsolubleendoglinandplacentalabruption[J].PrenatDiagn,2008,28(9):852-858.[26]VenkateshaS，ToporsianM，LarnC，etal．Solubleendoglincontributestothepathogenesisofpreeclampsia[J]．NatMed,2006，12(6)：642-649．[27]LuftFC．Solubleendoglin(sEng)joinsthesolublefinsliketyrosinekinase(sFlt)receptorasapre-eclampsiamolecule[J]．NephrolDialTran-SplanL,2006，21(11)：3052-3054．38 子痫前期患者血清及胎盘中TGF-β1、Endoglin表达及其相关性研究致谢时间的车轮滚滚向前，转眼间我在延安大学的三年研究生生涯就要结束了。以往的情景还历历在目，我将再一次踏上征程。三年的时间说长不长说短不短，而这三年是我一生中最为重要的一段时光。在延安大学的课堂上，我学习了医学理论知识，这些知识在我以后的工作学习中将起到极其重要的作用。而我的医学实践知识则是来源于延安大学附属医院。在此我要对我的导师李红梅教授表达我最诚挚的谢意，在延安大学附属医院妇产科实习期间，李红梅教授不但教给我很多的医学知识，而且我从她的身上学到了很多医生所该恪守的职业道德。从某种意义上来说，或许后者比前者更加重要。李红梅主任在该论文的写作过程中给予了我极大的帮助与指导，从该论文的选题开始，李红梅主任一直在给我提供自己的建议，到后期的数据分析阶段，她用自身在统计学方面的造诣为我指出了我的诸多不足之处。李红梅老师的医德和师德在我的心目中留下了深深的烙印，我绝不会辜负老师对我的殷切期望，努力做到在以后的工作中以患者为中心，一心一意为患者服务。同时，衷心的感谢产科一病区所有的医护人员，在她们的支持下我才能够在实验的取材过程中进行的较为顺利。作为我的实习时间最长的科室，各位老师所教授我的临床技能在我以后的工作过程中会愈发显示出其重要性。在本论文的写作过程中，检验科的工作人员给我提供了很大的帮助，尤其是在实验操作阶段，检验科的各位老师给我提供了最便利的实验场所和实验条件，最终使得我能够顺利的将实验进行下去，完成了实验的所有步骤。最后，我由衷的感谢评审该论文的所有专家学者，感谢你们在繁忙的工作中抽出时间来对我的论文进行审议，欢迎你们提出宝贵的建议和意见，指出我论文中的不足之处，我将予以改正，请允许我再次表达我最诚挚的谢意！-39- 读研期间发表论文读研期间发表论文[1]师媛，李红梅，TGF-β1及其受体Endoglin在妊娠期高血压疾病中的研究进展[J].浙江临床医学，201517（1）151-153.[2]师媛,李红梅,未足月胎膜早破相关病因及发病机制的研究进展[J].延安大学学报,已录用40