基因组编辑新技术对猪ccr5基因的靶向作用

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1、学校代码：10264研究生学号：M120104122上海海洋大学硕士学位论文基因组编辑新技术对猪CCR5基因题目：的靶向作用GenomeengineeringinpigCCR5英文题目：geneusingneweditingtools专业：临床兽医学研究方向：动物胚胎工程姓名：吴鋆龙指导教师：张德福研究员二O一五年六月十日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人

2、或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：

3、指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注李家乐上海海洋大学教授主席刘惠莉上海市农业科学院研究员委员易建中上海市农业科学院研究员委员俞菊生上海市农业科学院研究员委员孙晓梅上海市农业科学院助理研究员秘书答辩地点上海市农业科学院答辩日期2015.6.5基因组编辑新技术对猪CCR5基因的靶向作用摘要动物基因组编辑技术是指研究人员能够依照特定的目的去修饰动物的遗传组成，这是一项综合性的并且富有挑战性的技术。该技术由于能够比较容易并且精确的对基因组进行DNA的添加、删除和置

4、换的操作，使得其在改良畜产品质量，提高生产性能，研究疾病模型，研发生物医药产品等方面都显示出广阔的应用前景。基因定点敲入时，需要为一些外源基因，如报告基因、自杀基因、筛选基因、治疗性基因和外源性优良性状基因提供一个安全可靠的停泊“港口”，在这些“港口”外源基因既可稳定高效表达，又对细胞和组织无已知的副作用。近年来，转基因动物的生物安全性一直是人们讨论的热点问题。从目前已经已发表的文献看来，针对猪基因组安全港位点的研究凤毛麟角。因此，寻找合适的安全港位点对于转基因猪的制备显得尤为重要。在克隆动物的制备中，耳成纤维细胞作为供

5、核体细胞具有取材简便，成本低，对动物生长影响小等优点，并且从耳部组织的采样能够实现活体取样，从而为优良猪种的保种育种奠定基础。本研究第一部分采用组织块培养法分离、培养并建立猪耳成纤维细胞系，然后用电转染的方法将质粒pEGFP-C1导入该细胞系，探索并优化其最适条件和参数。最后成功建立上海白猪耳成纤维细胞系。电转后经过对各组转染效果的观察，发现在DNA量为20ng，电压为150V，电阻为500Ω，电容为500μF的条件下进行电转，并且电转后经37℃孵育，其效果最好。第二部分为了研究CCR5基因作为安全港基因的可能性，首先分

6、析了CCR5基因序列，发现该基因位于猪基因组第13号染色体上，基因总长4565bp，CDS区位于第二外显子上。然后针对CDS区atg下游约110bp处分别设计并成功构建了TALEN和CRISPR/Cas9系统的打靶载体，并将其分别电转染猪耳成纤维细胞。然后用CruiseTM酶对细胞池进行酶切验证后，发现TALEN打靶CCR5基因CDS区的结果为阴性，CRISPR的pool验证显示敲除效率很低。初步怀疑这两种技术在该位点上进行打靶可能存在的脱靶效应。I第三部分为检测分析上海梅山猪封闭群携带猪内源性逆转录病毒(porcine

7、endogenousretrovirus,PERV)存在与表达的情况，为该猪种作为器官移植供体的生物安全性提供现实依据，笔者从上海嘉定区梅山猪育种中心的梅山猪封闭群内随机采集45头猪的耳组织，并构建耳成纤维细胞系，利用PCR检测PERV前病毒核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)以及囊膜基因(env)的基因组DNA，利用RT-PCR的方法检测mRNA表达状况。结果发现被检测的45份样品均携带完整的3种亚型的PERV前病毒DNA；RT-PCR结果显示，45份样品中有40份同时有PERV-A和PERV-B两种亚型的表达

8、，还有5份样品仅检测到PERV-B亚型的表达，未检测到PERV-C亚型的表达。鉴于生物安全性方面的考虑，该猪种能否作为人异种移植的供体仍有待进一步商榷。关键词：基因组编辑，耳成纤维细胞，猪，趋化因子受体5，内源性逆转录病毒IIGenomeengineeringinpigCCR5geneusingneweditingt