Na+-牛磺胆酸共转运多肽的表达纯化与行为表征的研究.pdf

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1、硕士学位论文Na+-牛磺胆酸共转运多肽的表达纯化与行为表征的研究THEEXPRESSIONPURIFICATIONANDBEHAVIORALCHARACTERIZATIONOFNTCP熊智哈尔滨工业大学2018年6月国内图书分类号：Q71学校代码：10213国际图书分类号：577.21密级：公开硕士学位论文Na+-牛磺胆酸共转运多肽的表达纯化与行为表征的研究硕士研究生：熊智导师：黄志伟教授申请学位：理学硕士学科：生物学所在单位：生命科学与技术学院答辩日期：2018年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:Q71U.D.C:577.21Dissertatio

2、nfortheMasterDegreeTHEEXPRESSIONPURIFICATIONANDBEHAVIORALCHARACTERIZATIONOFNTCPCandidate：XiongZhiSupervisor：Prof.HuangZhiweiAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：BiologyAffiliation：SchoolofLifeScienceandTechnologyDateofDefence：June,2018Degree-Conferring-Institution：HarbinInstitut

3、eofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（sodiumtaurocholatecotransportingpolypeptide,NTCP）是第10个溶质转运蛋白（solutecarrierSLC10）家族的一名成员。NTCP蛋白特异性地在肝细胞的基底膜上表达，其负责调控肝肠的胆汁酸循环，以维持机体的胆汁酸平衡。最新研究发现，NTCP蛋白是乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus,HBV）和丁型肝炎病毒（HepatitisDvirus,HDV）感染肝细胞的功能性受体。所以获得NTCP的结构，对乙肝的治疗及对NTCP的功能的进一步阐

4、述具有重大意义。本课题以人类、小鼠、大鼠、树鼩、食蟹猴的NTCP蛋白为研究对象，根据这5个物种的NTCP片段设计相应的引物，克隆出这5种NTCP基因片段，并分别构建重组表达载体，以昆虫细胞为表达宿主，利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得目的蛋白。通过Ni柱亲和层析对目的蛋白进行富集粗提；然后利用AKTAFPLC纯化系统，通过Superdex200观察目的蛋白与不同去垢剂的结合情况，找出合适的去垢剂用于蛋白的纯化，为后续的结晶做准备。本课题通过PCR反应获得了人类、小鼠、大鼠、树鼩、食蟹猴的NTCP基因片段，并将这些NTCP基因片段分别与带有不同标签的pFastBac构建了

5、重组载体。利用这些重组载体转化DH10感受态细胞，再通过蓝白斑筛选得到了带有不同标签的NTCP重组黏粒。用转染试剂将这些NTCP重组黏粒转染昆虫细胞获得重组杆状病毒用于感染昆虫细胞，实现了带不同标签的NTCP蛋白在昆虫细胞中的表达。通过对比这些NTCP蛋白在昆虫细胞中的表达量，发现带SUMO标签和MBP标签的树鼩的NTCP蛋白的表达量较多。观察带MBP标签的树鼩的NTCP蛋白在Superdex200与不同去垢剂的结合情况，发现树鼩的NTCP蛋白在去垢剂C325S中有较好的行为表现。最后，在纯化树鼩的NTCP蛋白时，让树鼩的NTCP蛋白先与多肽Myr47结合后，再观察其在去垢剂C3

6、25S中的行为表现，发现树鼩的NTCP蛋白先与多肽Myr47结合后，聚合的树鼩的NTCP蛋白减少了。本课题的研究为抗HBV新药的研发提供一些参考价值。关键词：钠离子-牛磺胆酸共转运多肽；乙型肝炎病毒；蛋白纯化；行为表征I哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractSodium-taurocholatecotransportingpolypeptide(NTCP)isamemberofthetenthsolutecarrier(SLC10)family.TheNTCPproteinspecificallyexpressedinthebasementmembraneofliverc

7、ellsthatareresponsiblefortheregulationofbileacidenterohepaticcirculationofbileacidsinordertomaintainthebalanceofthebody.ThelateststudyfoundthattheNTCPproteinisfunctionalreceptorsforhepatocytesinfectedbyHepatitisBvirusandHepatitisDvirus.Theref