丝素蛋白左旋聚乳酸支架材料与软骨细胞体外相容性研究

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1、丝素蛋白/左旋聚乳酸支架材料与软骨细胞体外相容性研究Thecytocompatibilitystudyofsilkfibroin/poly-L-lacticacidscaffoldandchondrocytesinvitro作者姓名：孙莹专业：口腔医学指导教师：韩冰教授学位类别：口腔医学答辩日期：2015年5月27日中文摘要丝素蛋白/左旋聚乳酸支架材料与软骨细胞体外相容性研究软骨是人体正常组织的一部分，构成了胚胎早期主要的框架结构，在人体生长发育中逐渐被骨取代，至成年时期，仅散在分布一些软骨。软骨是体内重要关节的组成部分，在缓冲摩擦，减轻震动，维持关节窝的正

2、常运动中起重要作用。然而损伤、炎症等慢性变化往往会使关节软骨遭到创伤，从而使关节软骨面的解剖结构发生改变，影响关节运动，从而产生一系列关节症状，如关节疼痛、肿胀、积血等。颞下颌关节（TMJ）是人体关节中唯一与颅底有密切联系的联合（动）关节，具有多运动轴心，既可转动又可滑动，参与咀嚼、吞咽、言语及表情等多种生理功能。当颞下颌关节紊乱（TMJ）、炎症、损伤或肿瘤侵袭至关节软骨时，髁突软骨会缺损，而软骨的自体不可再生性特点使软骨无法进行自我修复，从而影响关节运动。组织工程(TissueEngineering)是1987年在美国华盛顿举办的生物工程小组会上提出的，是

3、运用工程学和生命科学的基本原理、理论、技术和方法，在体外构建一个类生物活性的种植体，植入体内来修复组织缺损，从而替代组织、器官的功能。组织工程的研究围绕三大核心要素，即支架材料、种子细胞、生长因子。丝素蛋白（silkfibroin，SF）是目前被认可的有机高分子支架材料，具有天然的可再生性，聚乳酸（PolylacticAcid，PLA）是第二批被美国食品药品监督管理局（FDA）批准的可用于组织工程研究的生物材料。两者均具有良好的组织及细胞相容性、无毒害、可再生性等特点。利用静电纺丝方法制作出来的丝素蛋白I/左旋聚乳酸（SF/PLLA）支架材料经本课题组前期动

4、物急性毒性实验、体外细胞毒性试验等研究，证实其具备良好的生物相容性。根据前期研究结果，本实验以兔膝关节软骨细胞为实验细胞，静电纺丝的丝素蛋白/左旋聚乳酸（SF/PLLA）为支架材料，将两者复合培养，在第3天、第7天、第14天、第21天分别作HE染色及阿利新蓝+核固红染色；扫描电镜检验细胞的黏着情况；MTT试验检测兔膝关节软骨细胞在SF/PLLA支架上的增殖情况。具体内容如下：1、软骨细胞与支架材料复合。将二代处于对数生长期的软骨细胞与丝素蛋白/左旋聚乳酸（SF/PLLA）支架材料复合，复合初期可见软骨细胞在丝素蛋白/左旋聚乳酸（SF/PLLA）支架材料上均匀

5、分布，细胞圆形可见，4h后部分圆形细胞消失，24h后支架内细胞不可见，支架边缘可见有细胞粘附。2、软骨细胞-支架材料HE染色结果分析。细胞-支架复合物复合培养第3天时，大部分细胞粘附，细胞相对松散，细胞间质染色较浅；第7天时，细胞数量有所增加，部分细胞可见核分裂；第14天时，可见“软骨陷窝”样结构，细胞间质染色明显加深；第21天时，细胞及间质染色连接成片。3、软骨细胞-支架材料阿利新蓝+核固红染色结果分析。细胞-支架复合物复合培养第3天时，软骨细胞数量少，间质成分（粘多糖）染色浅；第7天时，软骨细胞数量有所增加；第14天时，可见“类软骨陷窝”样结构，并可见明

6、显的软骨囊，细胞间质成分染色加深，但不均匀；第二十一天时，蓝染部位连接成片。4、软骨细胞-支架材料复合物扫描电镜观察。细胞-支架复合物培养3天时，见细胞散在分布，部分细胞深入孔径内部，细胞膜表面光滑，细胞基质分泌较少；7天时，可见细胞成团分布，表面有伪足样突起，细胞基质分泌增加，充填于支II架孔径中，细胞伸展良好。5、MTT试验。将SF/PLLA+软骨细胞复合培养组设为实验组，PLLA+软骨细胞组设为对照组，只加软骨细胞组设为空白组，每组设6个复孔，测量490nm波长的吸光度值。分别去掉每组的最高值跟最低值作为每组最终的吸光度值。用SPSS19.0统计软件包

7、分析。实验组比对照组获得更大的吸光度值，更有利于细胞的粘附与增殖。结果表明：软骨细胞在丝素蛋白/左旋聚乳酸（SF/PLLA）支架上可获得良好的粘附；随着细胞-支架复合物培养时间的延长，软骨细胞及细胞基质数量均有所增加，软骨细胞未发生表型的变化；MTT数据显示软骨细胞在丝素蛋白/左旋聚乳酸（SF/PLLA）支架上可获得更好的粘附与增殖。关键词：丝素蛋白/左旋聚乳酸（SF/PLLA）；组织工程；软骨细胞；细胞相容性IIIAbstractThecytocompatibilitystudyofsilkfibroin/poly-L-lacticacidscaffold

8、andchondrocytesinvitroCart