ros在白藜芦醇诱导人结肠癌hct116细胞自噬中的作用

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1、授予单位代码10089学号或申请号20122461_V妗(E搿大5HebeiMedicalUniversity硕士学位论文科学学位ROS在白藜芦醇诱导人结肠癌HCT116细胞自噬中的作用研究生：李雪梅导师：张志勇教授专业：病理学与病理生理学二级学院：唐山工人医院2015年3月河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报

2、的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研宄生签名导师签章:河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人己经发表或撰写的研宄成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。年月目录中文摘要……………………………………………………………………..1英文摘要……………………………………………………………………..4英文缩写……………………………………………………………………..7研究论文ROS在白藜芦醇诱导人结肠癌HCT116细胞自噬中的作用前言…

3、…………………………………………………………………..8材料与方法……………………………………………………………10结果……………………………………………………………………18附图……………………………………………………………………21讨论……………………………………………………………………32结论……………………………………………………………………37参考文献………………………………………………………………38综述细胞自噬与ROS的关系研究...................…………………….…...43致谢………………………………………………………………………….52

4、个人简历…………………………………………………………………….53中文摘要ROS在白藜芦醇诱导人结肠癌HCT116细胞自噬中的作用摘要目的：探讨白藜芦醇(Resveratrol，RSV)诱导人结肠癌细胞HCT116自噬过程中，ROS发挥的作用。同时研究RSV诱导细胞自噬过程中ROS、p53、NQO1等的相关性及其相互调节，以了解ROS在RSV诱导结肠癌细胞自噬中的调节机制，从而为白藜芦醇治疗结肠癌的研究提供充分可靠的理论支持。方法：1用DMEM/F12培养基培养人结肠癌HCT116细胞，待其生长至培养皿的80%左右时，应用ROS清除剂(NAC)预先对其进行处理1h，再用不同

5、剂量的白藜芦醇处理细胞24h后，用倒置显微镜观察细胞的形态和数量的变化。其中培养基含有10%的澳洲胎牛血清。2运用MTT法检测药物处理细胞后的生存率的改变。同时运用NBB法检测NAC与白藜芦醇共同处理组和只加白藜芦醇组细胞生存率变化的比较。3应用单丹磺酰戊二胺(MDC)法检测药物处理细胞后的酸性自噬泡的变化。4应用DAPI染色法检测不同药物处理细胞后的细胞核和染色质的变化。5不同药物处理HCT116细胞和SIRNA技术沉默p53后，Westernblot法检测后，自噬相关蛋白以及p53，NQO1,Nrf2等蛋白的表达情况。6流式细胞术法检测不同剂量的白藜芦醇和双香豆素作用细

6、胞24h后的ROS变化趋势。7应用SPSS13.0处理实验过程中的多次重复和对照的结果，且均采用t检验的方法分析，最后的实验结果会以均数±标准差的形式表示，如果P＜0.05则说明具有统计学意义。结果：1首先用不同剂量药物(0-200μM)作用于HCT116细胞后，MTT的结果显示细胞的存活率会随着药物浓度的升高而减低。此外，在显微镜下观1中文摘要察发现，不同剂量的药物(0-150μM)处理HCT116细胞24h后，随着药物剂量的增加，细胞也会随之发生变化。主要表现为镜下细胞的触角逐渐减少，相互之间的空隙增大，数目越来越少。同样，100μM白藜芦醇作用于人结肠癌细胞HCT11

7、6不同的时间(0,12,24,48h)后，细胞形态和数量的改变与浓度组的改变趋势基本相同。2应用DAPI法和WesternBlot法检测浓度组和时间组的细胞后，发现细胞并没有明显的凋亡现象。经过MDC试剂染色发现，不同剂量的白藜芦醇作用于HCT116后，随着白藜芦醇剂量的增加，自噬泡的数量也会随之增多。同时运用WesternBlot法对自噬相关蛋白Beclin-1和LC3进行了检测，结果发现二者的表达均随着药物剂量的增加而升高，同时抗凋亡有关的蛋白bcl-2和凋亡有关的Bax也是呈升高趋势，且bcl-2/Bax的比