p47phox介导氧暴露后单个核细胞内活性氧簇产生的机制

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1、中图分类号：R72;R392;R248.4SICHUANMEDICALUNIVERSITY硕士学位论文（科学学位)P47phox介导氧暴露后单个核细胞内活性氧簇产生的机制I院（系)、所护理学院研究生姓名张玲萍学科、专业护理学（新生儿重症监护）导师姓名董文斌教授二〇—五年四月1本研究基金来源：1.中华儿科杂志第二届双鹤珂立苏科研基金（编号：cjp2011-009）2.四川省科技厅项目（编号：4ZQ010-023）3.四川省卫生厅科研基金(编号：110340)4.四川省教育厅科研基金(编号：08ZA150-033)5.泸州市科技局（泸州市政府-泸州医学院联合专项资金）（编号：2013LZL

2、Y-J08）-2-目录介导氧暴露后单个核细胞内活性氧簇产生的机制……1中文摘要……………………………………………………………1英文摘要……………………………………………………………4前言…………………………………………………………………8材料与方法………………………………………………………10结果………………………………………………………………23讨论………………………………………………………………31结论………………………………………………………………38参考文献…………………………………………………………39英汉缩略词对照表………………………………………………46致谢…………………

3、……………………………………………47-3-P47phox介导氧暴露后单个核细胞内活性氧簇产生的机制摘要目的：观察32周以下早产儿不同浓度氧暴露后，外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMCs)内p47phox与活性氧簇产生的变化；以及运用NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘(DPI)和夹竹桃麻素(apocynin)联合高浓度氧处理PBMCs后，p47phox与活性氧簇水平的改变，来探讨NADPH氧化酶亚单位p47phox调节PBMCs内活性氧簇升高的机制，为临床中减轻早产儿氧化应激损伤寻找新的靶点。方法：实验分两部分进行。第一，以临床中32周以

4、下早产儿为对象，将其中入院时诊断为新生儿呼吸窘迫综合征(Neonatalrespiratorydistresssyndrom,NRDS)且需要吸氧的患儿作为氧暴露组，根据吸氧浓度不同分为三组：FiO2<30%为低浓度吸氧组、FiO2在(30-40)%为中浓度吸氧组、FiO2>40%为高浓度吸氧组，每组患儿各10例，其中男18例，女12例。胎龄(28-32)周，体重(1350±138)g，组间患儿胎龄、出生体重无显著性差异。同期选择10例32周以下暂未吸氧的早产儿作为空气组，其中男5例，女5例。胎龄（30-32）周，体重(1347±116)g。氧暴露组与空气组间患儿胎龄、出生体重无显著性

5、差异，具有可比性。该实验通过四川医科大学附属医院伦理委员会的批准，所有患儿进行实验前均征得家属同意并签署知情同意书。空气组及氧暴露组患儿不同浓度氧疗48小时后，均经桡动脉采血3ml。分离取得PBMCs及血清标本用于检测。实验第二部分，出生后即入我科的32周以下早产儿，尚未吸氧前，征得家属同意并签署知情同意书后经桡动脉采血2ml，经Ficoll密度梯度离心法，分离纯化PBMCs，以PBMCs-4-为对象，将其分为以下四组：常规培养组，置于37℃、50ml/L的CO2培养箱中培养48h；高氧处理组，按3L/min通入950ml/L的O2与50ml/L的CO2混合气体，10min后，立即用封

6、口胶密封培养瓶，置于培养箱中培养48h；高氧联合DPI处理组与高氧联合夹竹桃麻素(apocynin)处理组根据文献报道和预实验结果，分别选择5μmol/L、100μmol/L处理细胞后再按上述方法建立高氧损伤模型并培养48h；高氧及相应处理组培养48h后，均用CYS-1数字式测氧仪检测培养瓶中O2的浓度，将低于900ml/LO2的标本弃去。离心采集PBMCs和培养液作为标本。将两部分实验中所获得的标本，均采用MitosoxRed标记结合激光共聚焦显微镜检测PBMCs内ROS的生成量、硫代巴比妥酸比色法检测血清/培养液中丙二醛含量、免疫荧光检测p47phox在细胞内的定位及移位率、Wes

7、ternblot检测p47phox的蛋白表达量。结果：第一，临床样本中，随着早产儿吸氧浓度的升高，PBMCs内活性氧与血清丙二醛明显升高，p47phox由包质向包膜移位的细胞数增多，p47phox的移位率明显增加，p47phox的蛋白表达量也随之增加(P均<0.05)；第二，培养PBMCs各组中，PBMCs经高氧及相应药物处理48h后，与高氧处理组相比，其余三组活性氧和丙二醛明显减少，p47phox移位率与表达量也显著降低(P均<0.05)；与