载脂蛋白m对炎症因子表达的影响及其与冠心病的易感性

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1、SOOCHOWUNIVERSITY博士学位论文论文题目载脂蛋白M对炎症因子表达的影响及其与冠心病的易感性研究生姓名郑璐指导教师姓名张晓膺-专业名称心胸外科学研究方向冠心病的基础研究论文提交日期2015年5月载脂蛋白M对炎症因子表达的影响及其与冠心病的易感性中文摘要I载脂蛋白M对炎症因子表达的影响及其与冠心病的易感性中文摘要I载脂蛋白M对炎症因子表达的影响及其与冠心病的易感性中文摘要载脂蛋白M对炎症因子表达的影响及其与冠心病的易感性中文摘要第一部分apoM单克隆抗体的制备目的：制备高亲和力、高纯度的小鼠抗人apoM的单克隆抗体。方法：选取

2、68周龄、雌性BALB/c小鼠，每只小鼠以弗氏佐剂加apoM重组蛋白50g/只进行初次免疫，每隔15天免疫1次，共免疫6次。于融合前45天，再次以弗氏不完全佐剂加apoM重组蛋白50g/只加强免疫。选取检测阳性的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合及选择性培养。筛选阳性杂交瘤细胞并进行克隆化培养，直至抗体分泌阳性率大于95%。利用小鼠腹腔接种法获得含大量特异性抗体的腹水，经ProteinG柱纯化，对抗体进行定量及特异性检测。结果：经筛选、融合、选择性培养及亚克隆，成功获得4株持续分泌特异性鼠抗人apoM单克隆抗体的杂交

3、瘤细胞株。Western检测结果显示，在约25kD处4株单抗均有特异性条带，与apoM重组蛋白的分子大小位置符合。进而选择克隆号为1368CT871.72的杂交瘤，采用腹水诱生方案进行抗体的大量表达。腹水经proteinG柱纯化后，apoM单抗蛋白含量为1mg/ml。Westernblot检测结果显示，纯化后的apoM单抗经梯度稀释后，在1:4000仍能检测出目的蛋白。结论：制备的小鼠抗人apoM单克隆抗体具有很好的灵敏度和特异性。关键词：apoM，单克隆抗体+第二部分apoMHDL的分离纯化及其与SR-BI结合能力检测＋－＋目的：分离

4、HDL组分中apoMHDL和apoMHDL颗粒，检测apoMHDL－和apoMHDL颗粒在体外与SR-BI的结合能力。方法：小鼠抗人apoM单克隆抗体通过共价结合方式不可逆的与HiTrapI中文摘要载脂蛋白M对炎症因子表达的影响及其与冠心病的易感性＋NHS-activatedHP1ml预装柱结合，通过亲和层析的方法，将HDL蛋白中apoM－HDL和apoMHDL两个组分分离，进而采用BCA蛋白定量方法对分离的蛋白进行–定量分析。选取人单核细胞株THP-1细胞经体外PMA、ox-LDL诱导，再经apoM+HDL、apoMHDL、重组人ap

5、oM蛋白于37℃培养箱中分别孵育6h，收集细胞并提取总蛋白，用抗SR-BI的单克隆抗体沉淀蛋白复合物后进行Westernblot检测。通过＋－免疫共沉淀方法检测apoMHDL、apoMHDL和重组apoM蛋白在THP-1细胞表面与SR-BI的相互作用。结果：人高密度脂蛋白HDL经HiTrapNHS-activatedHP柱子纯化，分别收集–＋流出液（apoMHDL）、洗脱液（apoMHDL），apoM抗体进行Dotblot及western检测，结果显示，在未经纯化的HDL蛋白、纯化后第一、二、三管洗脱液中均能检––测到apoM蛋白，流出

6、液（apoMHDL）组分中未检测到apoM蛋白。apoMHDL、＋apoMHDL蛋白经透析后定量，终浓度分别为3.23mg/ml和0.34mg/ml，总体积为6.2ml和3.5ml。PMA处理THP-1细胞，其表面SR-BI的表达会有升高约10%左右，–+免疫共沉淀结果显示，apoMHDL、apoMHDL孵育组的总蛋白经SR-BI抗体沉淀复合物中均能检测到SR-BI和HDL蛋白，重组人apoM孵育组的总蛋白经SR-BI抗体沉淀复合物中也能检测到SR-BI和apoM蛋白。–＋结论：经HDL蛋白成功分离apoMHDL和apoMHDL两种蛋白

7、成分。证实–+THP-1细胞表面apoMHDL、apoMHDL和重组人apoM与SR-BI蛋白之间存在相互作用。+关键词：ApoMHDL，分离纯化，SR-BI，结合＋第三部分apoMHDL对巨噬细胞炎症因子表达的影响及可能的作用机制目的：拟利用体外诱导人单核细胞株THP-1分化为巨噬细胞，进而构建体外＋－泡沫细胞模型。分别利用apoMHDL和apoMHDL蛋白进行刺激，luminex200分＋－析apoMHDL和apoMHDL对炎症因子的影响，并结合全基因组芯片扫描分析可能的作用机制。II载脂蛋白M对炎症因子表达的影响及其与冠心病的易感

8、性中文摘要方法：（1）以PMA诱导人THP-1细胞株分化为巨噬细胞，经ox-LDL负载＋－24hr，经油红O染色观察细胞内脂质情况。（2）apoMHDL和apoMHDL蛋白分别刺激诱导后的THP-124hr