草鱼irf-2下调ifn、pkr、pkz转录的分子机制

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1、分类号：密级：UDC：学号：405604512022南昌大学硕士研究生学位论文草鱼IRF-2下调IFN、PKR、PKZ转录的分子机制ThemolecularmechanismsofCtenopharyngodonidellainterferonregulatoryfactor2(IRF-2)down-regulatesthetranscriptionlevelofIFN,PKRandPKZ谷美慧培养单位(院、系)：南昌大学生命科学学院生物科学系指导教师姓名、职称：胡成钰教授申请学位的学科门类：理学学科专业名称：水生生物

2、学论文答辩日期：年月日答辩委员会主席：评阅人：年月日一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名C手写）:签字日期：鉍丨了年<月lT日二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同

3、意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写导师签名（手写签字日期：g年乙月K日签字日期：>斤年<月0：日论文

4、题目mpuM姓名学号论文级别博士□硕士院/系/所专业字g#开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开)摘要摘要干扰素调节因子(InterferonRegulatoryFactor,IRF)是一类参与机体内I型干扰素(IFN)及干扰素刺激基因(ISG)转录调控的调节因子。IRF在宿主细胞抵抗病毒侵入、调节细胞生长和免疫应答中都扮演着十分重要的角色。IRF-2是一种多功能的转录调控因子，在细胞凋亡、细胞周期调控过程中起重要作用。现有资料表明，IRF-2除了调控IFN基因、ISG基因转录外还具有启动其他细胞因子、趋

5、化因子转录的功能。而且，在细胞免疫反应中他们能够同时扮演着不同的角色，如IRF-2除了作为干扰素系统基因的负调控因子外，还作为正调控因子激活白细胞介素-7基因、Ⅱ类转录活化子基因和Gig2基因的转录。为了解鱼类IRF-2作为负调控因子下调IFN、PKR、PKZ转录的分子机制。本文着重对实验室前期克隆的草鱼IRF-2(CiIRF-2)的功能进行了分析。系统发育树分析CiIRF-2与鱼类IRF-2进化关系最为亲近，属于IRF-1亚家族。RT-PCR数据分析显示CiIRF-2在不同的组织中均能够表达，但表达量较低。经poly

6、I:C刺激6-12h后，除了脑组织外其他各检测组织表达量均明显上调。说明CiIRF-2参与了细胞的抗病毒免疫反应。实验室前期克隆的CiIFN启动子含有4个预测的IRF结合位点(IRF-E)，分别从-67到-78、-107到-119、-456到-468和-646到-658。CiPKR和CiPKZ启动子各含有1个干扰素刺激应答元件(ISRE)分别是从-39到-51，-48到-58。为研究CiIRF-2与这些基因的启动子的亲和性，我们构建了含有草鱼IRF-2的ORF全长和nDBD结构域的原核表达载体，并通过镍柱亲和层析纯化目

7、的蛋白。体外凝胶阻滞实验分析表明，原核表达纯化的CiIRF-2与CiIFN，CiPKR，CiPKZ的启动子均有较强的亲和性。随后，构建了不同的启动子荧光素酶报告基因载体质粒(pGL3-IFN,pGL3-PKR,pGL3-PKZ)和真核表达载体质粒(pcDNA3.1-IRF-1，pcDNA3.1-IRF-2)分别共转染草鱼肾细胞(CIKcell)，然后检测细胞荧光活性。实验结果表明：在CIK中，CiIRF-2能够抑制CiIFN，CiPKR及CiPKZ的转录水平。为了进一步的了解CiIRF-2抑制CiIFN，CiPKR和C

8、iPKZ转录的分子机理，我们先将pcDNA3.1-IRF-1和pcDNA3.1-IRF-2一起孵育，再与目的基因CiIFN，CiPKR，CiPKZ的启动子荧光素酶报告基因载体质粒分别进行瞬时共转染于CIK中。分析结果显示CiIRF-2是通过与CiIRF-1的相互竞争而对IFN及ISG基因的I摘要转录活性起到负调节作用。此外，共转染