联合调控pparγ及cgrp基因表达预防酒精性股骨头坏死的实验研究

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1、学校代码10459学号或申请号201111440168密级公开博士学位论文联合调控PPARγ及CGRP基因表达预防酒精性股骨头坏死的实验研究作者姓名：李劲峰导师姓名：王义生教授学科门类：医学专业名称：外科学（骨科）培养院系：郑州大学第一附属医院完成时间：2015年5月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityfortheDegreeofDoctorAnexperimentalstudyonthepreventiveeffectofcombinedregulationoftheexpressionofPPARγandCGRPonalcohol-inducedos

2、teonecrosisoffemoralheadByJinfengLiSupervisor:Prof.YishengWangDepartmentofOrthopedicsTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityMay.2015原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研宄作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者日期：年：月学位论文使用授权声明本人在

3、导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。中文摘要联合调控PPARγ及CGRP基因表达预防酒精性股骨头坏死的实验研究博士研究生李劲峰导师王义生教授郑州大学第一附属医院骨科河南郑州450052中文摘要研

4、究背景酒精性股骨头坏死是骨科常见病，发病率有逐年增加的趋势。该病多见于中青年，且多为双侧发病，未经有效治疗者将发生股骨头塌陷，关节功能损毁，致残率极高，严重影响患者的生活质量。股骨头塌陷患者最终需要进行人工关节置换手术，手术效果对于年轻患者来说尚不确定，早期行人工关节置换将不可避免地行翻修术，经济成本较大，增加患者家庭与经济负担，且并发症多、远期疗效不能肯定，可见该病不仅给病人增加极大痛苦，还引发一系列社会问题。研究发现酒精可诱导骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）内过氧化物酶体增殖子活化受体γ(peroxisomeproliferat

5、or-activatedreceptor-γ,PPARγ)基因的高表达，诱导股骨头髓腔内干细胞的成脂分化，促进其向脂肪细胞发展，并因脂类物质沉积而引发股骨头内高压，同时成骨分化能力减弱，最终发生股骨头坏死。抑制或阻断PPARγ基因的表达则抑制其成脂分化，保持成骨分化的特点，减少股骨头坏死的发生率。降钙素基因相关肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)为一种调节骨组织生长代谢的神经肽基因，可促进骨髓干细胞的增殖能力和成骨活性，与骨代谢和修复密切相关。因此，通过联合调控PPARγ基因和CGRP基因的表达，抑制骨髓干细胞的成脂分化，同时主动增强其成骨分化的能力成为

6、预防酒精性股骨头坏死新的研究方向。I中文摘要研究目的通过构建能够沉默PPARγ，同时表达CGRP的双基因重组载体，观察联合调控PPARγ基因和CGRP基因的表达对酒精诱导下兔BMSCs成脂、成骨分化能力的影响；采用致敏法与酒精灌胃法制作兔酒精性ONFH模型，将双基因重组载体转染的BMSCs植入动物模型股骨头内，观察其对酒精性股骨头坏死的预防效果，对预防股骨头坏死的进一步研究提供新的实验基础。本研究分为以下三个部分：第一部分：沉默PPARγ表达CGRP基因重组载体的构建与鉴定方法（1）发卡样siRNA（shRNA）寡核苷酸链的设计与合成：按照siRNA片段的设计原则，依据GenBank中PPA

7、Rγ的基因序列，筛选并合成合成2条PPARγsiRNA寡核苷酸链，3'和5'端分别加入BamHⅠ和HindⅢ的酶切残基，并在设计时改变BamHⅠ酶切位点的一个碱基。（2）兔CGRP基因完整ORF克隆：前期得到兔CGRP基因完整ORF克隆，设计其两端带MluI酶切位点，与TGFP融合蛋白表达单元间用一段柔性链连接。（3）重组载体的构建：发卡样siRNA寡核苷酸靶序列退火后克隆入线性化pGFP-V-RS载体，得到