硫化氢在p38mapk通路中对肝细胞增殖凋亡的影响

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1、分类号•.密级：公开学号：2012109061单位代码：10759石河子大学碩士嗲依铪夂硫化氢在P38MAPK通路中对肝细胞增殖/凋亡的影响学位申请人郑娜娜指导教师陈卫刚申请学位门类级别医学硕士学科、专业名称内科学研究方向慢性肝病及消化系肿瘤的临床与基础研究所在学院医学院中国•新疆•石河子2015年6月分类号：密级：公开学号：2012109061单位代码：10759石河子大学硕士学位论文硫化氢在p38MAPK通路中对肝细胞增殖/凋亡的影响学位申请人郑娜娜指导教师陈卫刚申请学位门类级别医学硕士学科、专业名称内科学研究方向慢性肝病及消化系肿瘤的

2、临床与基础研究所在学院医学院中国·新疆·石河子2015年6月Effectsofthehydrogensulfideonproliferationandapoptosisofhepatocytesfromhepaticfibrosisratsviap38MAPKsignalpathwayADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByZhengNana(Medicine)D

3、issertationSupervisor:Prof.ChenWeiGangJune,2015石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有

4、权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。/摘要目的：探讨硫化氢(hydrogensulfide，H2S)对肝纤维化大鼠肝细胞增殖、凋亡的调节作用以及对P-p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase，p38MAPK)蛋白的表达的影响。方法：①CCl4复合因素法制备肝纤维化大鼠模型，胰酶两步灌流法提取肝纤维化大鼠肝细胞，台盼蓝染色检测细胞活性，细胞活性＞90%，每只肝纤

5、维化大鼠细胞产量＞107，可继续后续实验；②MTT法检测肝纤维化大鼠肝细胞增殖：将新提取的肝细胞按2×104个/孔接种于96孔板，当细胞出现大片岛状连接时，用无血清WME培养基同步化处理12h，分对照组与实验组，实验组按照加药浓度梯度分组：H2S组将NaHS（H2S供体）按照25、50、75、100、200µmol/L浓度梯度给药，SB组分别按照12.5、25、50、100、200µmol/L浓度梯度给药，每组各设6个复孔。在5%CO2培养箱中继续培养48h后终止实验，每孔加入5g/L的MTT20µL，培养箱中继续反应4h，吸出培养基，每孔

6、加入150µLDMSO，震荡混匀10min。利用酶标仪于波长490nm处，测定各孔吸光度值(A)，计算两种药物对各组细胞的增殖率、增殖抑制率；③流式细胞技术检测肝纤维化大鼠肝细胞凋亡率：将新提取的肝细胞按8×105个/孔接种至6孔板，在细胞出现大片岛状连接时，用无血清WME培养基同步化处理12h，分四组：正常对照组、H2S50µmol/L组、SB20358025µmol/L组(SB组)、SB20358025µmol/L+H2S50µmol/L组(SB+H2S组)，放入培养箱培养48h后消化收集各孔细胞，加入bindingbuffer和Ann

7、exinV-FITC/PI双染色剂，4℃避光。1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率；④Westernblot法检测肝纤维化大鼠肝细胞中P-p38MAPK蛋白的表达：实验分对照组、H2S组、SB组、SB+H2S组，Westernblot法检测细胞中P-p38MAPK蛋白的表达。结果：①采用改良的胰酶二步灌流法可获得大量的肝纤维化大鼠肝细胞，细胞活率＞90%，细胞产量为（1-3）×107，能够满足实验要求；②原代提取的肝纤维化肝细胞培养48h后呈大片岛状连接，生长状态良好，可给予干预；③给予干预后，与对照组相比，低浓度H2S(50µmol/L)明显

8、促进肝纤维化大鼠肝细胞增殖，差异有统计学意义(P<0.05)，对肝纤维化大鼠肝细胞凋亡无影响(P>0.05)；SB203580可抑制肝纤维化大鼠肝细胞的增殖，伴随药物浓度的升高细