池蝶蚌表皮生长因子受体底物15(eps15)基因的分子特征及表达分析

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1、分类号：密级：UDC：学号：405604512023南昌大学硕士研究生学位论文池蝶蚌表皮生长因子受体底物15(Eps15)基因的分子特征及表达分析MoleculecharacteristicsandexpressionanalysisofEpidermalGrowthFactorReceptorSubstrate15genefromfreshwaterpearlmussel,Hyriopsisschlegelii刘国凤培养单位（院、系）：生命科学学院生物科学系指导教师姓名、职称：洪一江教授申请学位的学科门类：理学学科专业名

2、称：水生生物学论文答辩日期：2015年5月答辩委员会主席：____________评阅人：________________________2015年5月31日一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）:签字曰期：>^

3、年6月爹円二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关

4、权益。学位论文作者签名（手写）:导师签名（手写）:签字円期：>)/1年〈月2日签字円期：>4年（月巧R论文题目禮抱fefe—诚达徽姓名，'侃学号^论文级别博士□硕士s/院/系/所¥命坪丨f爷靖/专业,1丨v

5、v联系电话Email通信地址(邮编)：备净:Q公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开）摘要摘要本研究利用实验室已有的池蝶蚌（Hyriopsisschlegelii）转录组数据中表皮生长因子受体底物15（Eps15）基因的部分序列，设计池蝶蚌Eps15基因(Hs-Eps15)基因的特异性引物，并以池蝶蚌性

6、腺组织cDNA为模板进行PCR扩增。将扩增产物克隆到pMD19-T载体中，然后转进大肠杆菌DH5α，经测序获得Hs-Eps15基因的部分中间片段，继而通过PCR和3’-RACEPCR最终克隆出Eps15基因序列，其cDNA全长3382bp，包括923bp的3'-UTR，具有24bp长的polyA尾巴及加尾信号AATAA，开放阅读框(Openreadingframe，ORF)为2454bp，编码817个氨基酸。对Hs-Eps15蛋白结构域分析得知，N端部分主要由三个EH(Eps15homology)结构域组成，无信号肽，而C

7、端部分最显著的特征是存在多次DPF(谷氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸)重复序列；利用相关生物学软件分析得到其分子量约为88.67kDa，理论等电点为4.88；二级结构预测中显示无规则卷曲和α-螺旋最多，分别占41.74%和41.49%，延伸链占9.55，β-折叠最少。采用MEGA4.0软件邻位相连法（NJ）建立系统进化树分析同源性表明，在众多物种中，池蝶蚌的Eps15基因与太平洋牡蛎（Crassostreagigas）的同源性最高（约64%）。通过荧光定量PCR技术检测分析Hs-Eps15基因在池蝶蚌不同组织中mRNA的表达情况。

8、结果表明：该基因在池蝶蚌心脏、卵巢、精巢、肠、肝胰腺、肾脏、鳃、闭壳肌、外套膜、斧足和血液11个组织中均有表达，其中在精巢中表达量最高，在卵巢中次之，而在心脏、鳃和血液中表达量较低，其中心脏中最低。由此推测池蝶蚌中以Eps15为底物的EGFR通路会影响精子的产生和发育，也会作为池蝶蚌卵巢局部重要的调节因子，影响卵泡生长发育及成熟。根据已得到的Hs-Eps15基因的全长cDNA序列，经NCBI中比对获知序列N端有3个EH结构域，选取这段完整且具有代表性结构域的序列，并对此设计TM-E扩增该完整结构域的引物，pEASY1-Hs

9、-Eps15重组表达质粒，然后转进E.coilBL21(DE3)表达感受态细胞中，经IPTG诱导蛋白表达，得到了分子量约为32.6kDa的融合蛋白。采用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化表达产物，SDS-PAGE检测显示获得了纯净的融合蛋白，Bradford法测定蛋白浓度及含量，测定结果显示蛋白浓度符合制备