棉花线粒体耐盐相关基因rps12、ccmc、nad的克隆及其表达分析

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1、密级:论文编号:中囯农他科学院卞立论文棉花线粒体耐盐相关基因rps/么的克隆及其表达分析CloningandExpressionAnalysisofSalt-toleranceRelatedrpsl2^ccmC,nad3GenesinCottonMitochondria硕士研宄生：张天豹指导教师：叶武威研究员申请学位类别：农学硕士专业领域：悄辦4质资源学研宄方向：基理培养单位：中国农並科学院棉花研究所中国农业科学院研宄生院提交日期：2015年6月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDisserta

2、tionCloningandExpressionAnalysisofSalt-toleranceRelatedrps12,ccmC,nad3GenesinCottonMitochondriaM.S.Candidate:ZhangTianbaoSupervisor:ProfessorYeWuweiMajor:CropGermplasmResourceSpecialty:GeneDiscoveryandFunctionAnalysisJune2015III摘要棉花是一种耐盐性较强的作物，在盐碱地的开发利用方面具有重要价值。研究棉花的耐盐性，发掘优异耐盐基因，

3、提高耐盐水平，显得尤为重要。植物的耐盐性与线粒体有着重要联系，本研究在0.4%的盐量胁迫法处理下，通过实时荧光定量PCR从陆地棉中9409筛选到三个耐盐相关的线粒体基因rps12、ccmC、nad3；克隆并对其进行了生物信息学分析；利用荧光表达载体分析其亚细胞定位；构建了过表达载体，花序侵染法转化拟南芥和基因枪活体转化方法转化棉花用来验证其功能。主要研究结果如下：1实时荧光定量PCR分析结果表明，盐胁迫后rps12、ccmC、nad3基因的相对表达量均是先升高，至6h时表达量最高，之后又逐渐降低，表明三个基因受到盐胁迫的诱导表达；发现rps12、ccmC

4、、nad3基因在棉花根、茎、叶和花中均有表达，但是不同基因稍有差别，其中ccmC基因在根中的表达量最高，在茎和叶中的表达量较少；而rps12基因、nad3基因均是在叶和花中的表达量较高，在根中的表达量最少，说明三个基因在棉花中具有组织表达差异性。2基因rps12的ORF全长为372bp，编码123个氨基酸，蛋白分子量约为14.102kD，等电点为11.11；ccmC基因的ORF全长为753bp，编码250个氨基酸，蛋白分子量约为27.756kD，等电点约为9.66；基因nad3的ORF全长为357bp，编码118个氨基酸，蛋白分子量约为13.675kD，

5、等电点约为4.58；三个蛋白由α螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成，均不存在信号肽；进化树分析表明，均与种子植物中的蛋白亲缘关系更近。3构建了原核表达载体pET28a-rps12，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌株，经过IPTG诱导，pET28a-rps12在大肠杆菌BL21中表达出了16.397kD的融合蛋白。4成功构建了荧光表达载体pBI121-rps12::GFP、pBI121-ccmC::GFP、pBI121-nad3::GFP，利用基因枪转化技术转入洋葱内表皮细胞，激光共聚焦显微镜观察，发现ccmC蛋白定位在细胞核以及细胞质中，rps1

6、2蛋白和nad3蛋白定位在细胞膜和核膜。5构建了过表达载体pBI121-rps12、pBI121-ccmC、pBI121-nad3，利用花序侵染法转入拟南芥，分子检测表明得到了转基因拟南芥，通过种子发芽和成株期耐盐性实验，发现转基因拟南芥的耐盐性高于野生型拟南芥，这些基因可能在植物耐盐过程中发挥一定的作用；利用基因枪活体转化技术转化棉花，对棉花耐盐新种质的创制和进一步棉花耐盐分子机制研究打下了基础。关键词：棉花，线粒体，耐盐性，基因克隆，表达分析IIIAbstractCottonisakindofcropswithstrongsaltresistance

7、,whichisofimportantvalueindevelopmentandutilizationofsaline-alkaliland.Itisimportanttoexploreexcellentsalt-tolerantgenesandimprovethelevelofsalt-toleranceoncotton.Themitochondriaisplayinganessentialroleinsalt-toleranceofplants.Basedon0.4%saltstressmethod,weobtainedthreesalt-toler

8、ancerelatedgeneccmC,rps12andnad3frommito