梅毒螺旋体粘附素tp0751重组菌影制备与免疫活性的初步研究

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3、朗四海，教授，硕导，南华大学答辩委；员会主席，教授，，南貨建华博导华大学委１：员失舉明，硕导，南华大学，教授２委：员杨秋林，副教授，硕导，南华大学委３；员赵飞聽，教授，硕导，南华大学委员４为双今，副Ｉ教授，硕导，南华大学：Ｉ５４；２１５２日０年月日答辩期梅毒螺旋体粘附素Tp0751重组菌影制备与免疫活性的初步研究摘要：[目的]构建重组梅毒螺旋体(Tp)黏附素Tp0751的大肠埃希菌菌影(EBG)(rTp0751-EBG)，检测其免疫活性，为深入探讨其在抗Tp感染中的潜在免疫保护作用奠定基础。[方法](1)EBG的制

4、备与鉴定：将含有噬菌体PHiX174裂解基因E的质粒pHH43转化入E.coliDH5α，温控诱导使其形成BG并计算裂解效率，琼脂糖DNA电泳和透射电镜(TEM)鉴定。(2)膜锚定载体的构建与表达：PCR扩增膜锚定基因E'(含linker)，与pET28a-Tp0751构建膜锚定载体pET28a-E'-Tp0751，转化E.coliBL21诱导表达，WB鉴定E'-Tp0751的表达。(3)rTp0751-EBG表达质粒的构建：将含裂解基因盒E-box的pHH43与pET-32a质粒酶切、连接，构建重组质粒pET32a-E-box，再将其pET28a-

5、E'-Tp0751构建重组表达质粒pET-28a-E'-Tp0751-E-box。(4)rTp0751-EBG表达与鉴定：将pET28a-E'-Tp0751-E-box转化E.coliBL21，28℃诱导表达Tp0751，升温至42℃热诱导裂解，计算裂解率。WB鉴定Tp0751的表达；TEM鉴定BG。(5)动物免疫：分别用rTp0751-EBG肌注、rTp0751-EBG鼻滴、rTp0751肌注(加弗氏佐剂)、EBG肌注及PBS肌注途径免疫C57BL/6小鼠3次。每次免疫前及末I次免疫后第10d收集血清和生殖道灌洗液，末次免疫后第10d制备小鼠脾细胞

6、。(6)rTp0751-EBG免疫活性测定：用间接ELISA法检测血清特异性抗体IgG抗体及生殖道灌洗液中sIgA抗体水平，CCK-8法检测rTp0751刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，间接ELISA检测IFN-γ表达水平。[结果](1)EBG制备与鉴定：42℃下pHH43上E基因被激活导致E.coli裂解形成BG，裂解率可达98.13%；琼脂糖凝胶电泳未观察到DNA条带，TEM显示绝大部分细菌都裂解成空泡状并保持细菌基本形态。(2)膜锚定载体的构建与表达：PCR扩增出大小约为180bp左右的片段，与膜锚定基因E'一致；SDS-PAGE显示一分子量约28KD

7、a的可溶性蛋白，WB显示该蛋白仅与Tp感染兔血清反应。(3)rTp0751-EBG表达质粒的构建、表达与鉴定：酶切及测序结果表明含有目的基因Tp0751和裂解基因盒E-box的重组质粒构建成功。经28℃诱导表达一分子量约28KDa大小的明显条带，WB显示其仅与Tp感染兔血清反应。在42℃诱导重组BG的OD600值开始下降，裂解率为96.37%。TEM鉴定结果与EBG结果类似。(4)rTp0751-EBG诱导系统和黏膜体液免疫应答水平：rTp0751-EBG肌注组、rTp0751-EBG鼻滴组和rTp0751肌注组小鼠血清特异性IgG水平随免疫次数增加

8、而增加，第4周达到最大值，抗体效价均高于1︰25600，明显高于PBS和EBG肌注对照组(P<0.01)，但