核盘菌新型rna病毒研究

《核盘菌新型rna病毒研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

HUAZHONGAGRICULTURALUNIVERSITY博士学位论文PhDDISSERTATION核盘菌新型RNA病毒研究RESEARCHONNOVELRNAVIRUSESOFSCLEROTINIASCLEROTIORUM研究生：刘立江CANDIDATE:LIULIJIANG导师：姜道宏教授SUPERVISOR:PROFESSORJIANGDAOHONG专业：植物病理学MAJOR:PLANTPATHOLOGY研究方向：分子植物病理学FIELD:MOLECULARPLANTPATHOLOGY中国武汉WUHAN,CHINA二O—五年六月JUNE,2015 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书$如需保密，解密时间年月日独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此迸行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名：令^五$上时_:>1亡年6月"7円学位论文使用授权书本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意肀中农业大学可以用不同方式在不同媒体上|发表、传播学位论文的全部或部分内容。学位论文作者签名：女)立$上导师签名 分类号密级华中农业大学博士学位论文核盘菌新型RNA病毒研究ResearchonnovelmycovirusesofSclerotiniasclerotiorum博士研究生:刘立江学号:2011301010046指导教师:姜道宏教授指导小组:姜道宏教授付艳苹教授程家森副教授谢甲涛副教授陈桃讲师专业：植物病理学研究方向：分子植物病理学获得学位名称：农学博士获得学位时间：2015年6月华中农业大学植物科学与技术学院二○一五年六月 核盘菌新型RNA病毒研究目录摘要......................................................................................................................................iAbstract...............................................................................................................................iv缩略语表..........................................................................................................................viii第一章前言.........................................................................................................................11.1核盘菌危害与防治策略........................................................................................11.1.1核盘菌与致病机理.....................................................................................11.1.2核盘菌防治策略.........................................................................................21.2真菌病毒多样性...................................................................................................31.2.1病毒与真菌病毒.........................................................................................31.2.2真菌病毒的发现..........................................................................................41.2.3高通量测序与真菌病毒资源的发掘.........................................................51.3真菌病毒应用.......................................................................................................51.3.1真菌病毒在医学上的应用.........................................................................51.3.2真菌病毒在生物防治上的应用.................................................................51.3.3真菌病毒在生物防治上的优势.................................................................61.3.4近年来发现的具有弱毒特性的真菌病毒.................................................61.4真菌病毒与病毒的进化.......................................................................................71.4.1真菌病毒与其它生物中病毒的关系.........................................................71.4.2真菌病毒与生物间的基因水平转移.........................................................71.5真菌病毒与寄主互作研究...................................................................................81.6核盘菌中真菌病毒研究概况...............................................................................91.7真菌病毒利用的困难与策略..............................................................................101.7.1真菌病毒的寄主范围...............................................................................101.7.2营养体不亲和与真菌病毒传播...............................................................101.7.3真菌病毒体外传播和传播介体...............................................................111.8研究目的与意义.................................................................................................11第二章核盘菌菌株分离与筛选.......................................................................................132.1引言......................................................................................................................132.2试验材料.............................................................................................................132.3试验方法.............................................................................................................172.3.1核盘菌菌株分离.......................................................................................172.3.2致病力测定................................................................................................17I 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文2.3.3菌落形态观察............................................................................................172.3.4DNA提取...................................................................................................172.3.5dsRNA提取................................................................................................172.3.6核酸电泳....................................................................................................172.3.7核盘菌DNA病毒SsHADV-1检测.........................................................172.3.8用DNaseI处理dsRNA样品...................................................................182.4结果与分析..........................................................................................................182.4.1分离得到的菌株表型................................................................................182.4.2致病力测定................................................................................................202.4.3DNA电泳检测...........................................................................................212.4.4真菌DNA病毒SsHADV-1检测.............................................................212.4.5dsRNA电泳检测........................................................................................222.4.6异常菌株信息汇总....................................................................................222.5讨论.......................................................................................................................24第三章单股负义链RNA病毒SsNSRV-1分子特性及生物学特性研究......................263.1引言.......................................................................................................................263.2试验材料..............................................................................................................263.3试验方法..............................................................................................................273.3.1生物学特性.................................................................................................273.3.1.1菌株分离...........................................................................................273.3.1.2致病力、生长速度及菌落形态观察..............................................273.3.1.3菌丝形态观察..................................................................................273.3.1.4菌丝鲜重测定及产酸量测定..........................................................273.3.2SsNSRV-1全长cDNA克隆......................................................................273.3.2.1dsRNA提取......................................................................................273.3.2.2总RNA提取...................................................................................273.3.2.3SsNSRV-1序列克隆.........................................................................273.3.2.4SsNSRV-1序列末端克隆.................................................................293.3.2.5SsNSRV-1缺陷型RNAs克隆.........................................................313.3.3SsNSRV-1基因的表达模式.......................................................................323.3.3.1含有Poly(A)的RNA分离与富集................................................323.3.3.2基因的3’RACE................................................................................323.3.3.3基因的5’RACE................................................................................333.3.4SsNSRV-1病毒粒子特性...........................................................................34II 核盘菌新型RNA病毒研究3.3.4.1病毒粒子提取..................................................................................343.3.4.2病毒粒子观察..................................................................................353.3.4.3PEG介导的SsNSRV-1病毒粒子转染...........................................353.3.4.4SsNSRV-1结构蛋白SDS-PAGE电泳...........................................353.3.4.5SsNSRV-1结构蛋白PMF-MS鉴定...............................................363.3.5SsNSRV-1的Northernblot分析...............................................................373.3.6序列分析和系统发育分析所用到的生物信息学软件...........................383.3.7菌丝超薄切片制备和电镜观察...............................................................393.3.8SsNSRV-1自然分布检测..........................................................................393.4结果与分析.........................................................................................................393.4.1核盘菌菌株AH98生物学特性................................................................393.4.2核盘菌菌株AH98dsRNA提取...............................................................413.4.3SsNSRV-1基因组结构和特点..................................................................413.4.3.1SsNSRV-1末端克隆........................................................................413.4.3.2SsNSRV-1基因组结构及特点........................................................423.4.3.3SsNSRV-1与Mononegaviruses基因组结构比较.........................443.4.3.4SsNSRV-1与Lprotein-like序列结构比较....................................453.4.4SsNSRV-1基因的Northernblot分析......................................................473.4.5SsNSRV-1基因表达模式..........................................................................483.4.6SsNSRV-1转录调控信号.........................................................................533.4.7SsNSRV-1病毒粒子的结构和形态特性..................................................543.4.8SsNSRV-1的系统发育分析......................................................................633.4.9SsNSRV-1的生物学特性..........................................................................653.4.10SsNSRV-1的分布....................................................................................663.4.11SsNSRV-1的转录组分析........................................................................673.5讨论......................................................................................................................723.5.1真菌负义链RNA病毒.............................................................................723.5.2SsNSRV-1病毒粒子形态及核衣壳特性..................................................723.5.3SsNSRV-1基因组结构特性及基因功能特性..........................................733.5.4SsNSRV-1分类地位思考..........................................................................743.5.5SsNSRV-1弱毒特性及生防潜力..............................................................743.5.6转录组分析SsNSRV-1对核盘菌的影响................................................743.5.7SsNSRV-1的应用及展望..........................................................................77第四章双节段dsRNA病毒SsBRV1分子特性及生物学特性研究..............................78III 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文4.1引言.......................................................................................................................784.2材料与方法..........................................................................................................794.2.1试验材料....................................................................................................794.2.2生物学特性................................................................................................794.2.3核盘菌的原生质体再生............................................................................794.2.4dsRNA提取................................................................................................794.2.5SsBRV1全长cDNA的克隆......................................................................794.2.5.1随机引物克隆..................................................................................794.2.5.2末端克隆..........................................................................................794.2.5.3PCR产物测序..................................................................................794.2.6SsBRV1病毒粒子特性..............................................................................794.2.7dsRNA的Northernblot分析...................................................................804.2.8序列分析和系统发育分析所用到的生物信息学软件............................804.2.9SsBSRV1探针制备、RT-PCR检测所用引物..........................................804.2.10核盘菌子囊孢子诱导..............................................................................804.3结果与分析..........................................................................................................814.3.1菌株SCH941生物学特性.........................................................................814.3.2SsBRV1的基因结构及特性......................................................................824.3.3SsBRV1的病毒粒子及结构......................................................................884.3.4SsBRV1的系统发育分析..........................................................................954.3.5SsBRV1的生物学特性..............................................................................974.3.6SsBRV1基因组结构比较..........................................................................994.3.7SsBRV1在子囊孢子后代带毒率检测......................................................994.4讨论.....................................................................................................................102第五章呼肠孤病毒SsReV1的分子特性及生物学特性研究...........................................1045.1引言.....................................................................................................................1045.2材料与方法........................................................................................................1045.2.1试验材料..................................................................................................1045.2.2生物学特性..............................................................................................1045.2.3核盘菌的原生质体再生..........................................................................1045.2.4dsRNA提取..............................................................................................1055.2.5SsReV1全长cDNA的克隆....................................................................1055.2.6SsBRV1病毒粒子特性............................................................................1055.2.7dsRNA的Northernblot分析.................................................................105IV 核盘菌新型RNA病毒研究5.2.8序列分析和系统发育分析所用到的生物信息学软件.........................1055.2.9SsReV1RT-PCR检测和Northernblot所用引物..................................1055.3结果与分析.......................................................................................................1065.3.1菌株SCH941及其相关菌株的生物学特性.........................................1065.3.2SsReV1基因组结构和特性....................................................................1075.3.3SsReV1病毒粒子结构和特性................................................................1155.3.4SsReV1的进化分析................................................................................1205.3.5SsReV1的生物学特性............................................................................1225.4讨论....................................................................................................................1235.4.1SsReV1基因组结构和特点比较............................................................1235.4.2SsReV1蛋白功能分析............................................................................1255.4.3SsReV1的分类地位................................................................................1265.4.4菌株SCH941中dsRNA与菌株表型的关系探讨...............................1265.4.5SsReV1的ORF6-1和ORF7可能存在水平基因转移.........................127第六章双节段dsRNA病毒SsBRV3分子特性与生物学特性研究............................1296.1材料与方法.......................................................................................................1296.1.1试验材料.................................................................................................1296.1.2生物学特性.............................................................................................1296.1.3核盘菌的原生质体再生.........................................................................1296.1.4dsRNA提取.............................................................................................1296.1.5SsBRV3全长cDNA的克隆...................................................................1296.1.6SsBRV3全长cDNA的克隆...................................................................1296.2结果与分析........................................................................................................1296.2.1菌株HN138生物学特性.......................................................................1296.2.2SsBRV3基因组结构................................................................................1306.2.3SsBRV3与BpRV1的生物特性比较......................................................1316.2.4SsBRV3与BpRV1氨基酸比较..............................................................1326.3讨论...................................................................................................................134第七章核盘菌真菌病毒多样性与宏病毒组学.............................................................1357.1引言....................................................................................................................1357.2试验材料与方法...............................................................................................1357.2.1试验材料..................................................................................................1357.2.2总RNA提取............................................................................................1357.2.3转录组测序、分析..................................................................................135V 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文7.2.4所需要的数据库.......................................................................................1367.3试验结果............................................................................................................1367.3.1比对统计样品..........................................................................................1367.3.2样品分析的过程.......................................................................................1367.3.3序列鉴定结果...........................................................................................1377.4讨论....................................................................................................................139第八章结论与展望..........................................................................................................1408.1全文结论与创新点.............................................................................................1408.1.1全文结论..................................................................................................1408.1.2创新点......................................................................................................1418.2思考与展望........................................................................................................1418.2.1样品收集与病毒发掘...............................................................................1418.2.2真菌中RNA病毒与DNA病毒的发现.................................................1428.2.3真菌病毒传播...........................................................................................1428.2.4单股负义链RNA病毒SsNSRV-1.........................................................1428.2.5双节段dsRNA病毒SsBRV1与卫星RNA...........................................1428.2.6病毒混合侵染与病毒互作.......................................................................1438.2.7病毒宏基因组学在发掘真菌病毒中的应用..........................................143参考文献..........................................................................................................................144攻读博士学位期间发表的学术论文..............................................................................165致谢..................................................................................................................................167VI 核盘菌新型RNA病毒研究摘要核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary）是世界范围的重要植物病原真菌，具有广泛的寄主范围和地理分布。真菌病毒普遍存在于真菌中，能够引起弱毒特性的真菌病毒在生物防治上具有重要的应用潜力。核盘菌的真菌病毒具有丰富的种类和多样性，发掘核盘菌的真菌病毒资源，有利于研究病毒与寄主互作、病毒分类及进化，同时为菌核病的生物防治提供新的思路和资源。本研究分离了1967份从湖南省和安徽省采集来的核盘菌菌核，从中筛选出菌落表型异常的菌株共38株，其中湖南省有29株，安徽省9株，根据菌落表型可以分为4种类型：培养过程中菌落表型恢复正常的有7株；菌落正常，但不产生菌核的菌株有9株；菌落异常，不产生菌核的菌株有13株；菌落异常，产少量菌核的菌株有9株。提取这些菌株的dsRNA和DNA发现，这些异常的菌株中除基因组DNA外，有多条dsRNA或DNA片段，同时PCR检测发现多个菌株含有核盘菌DNA病毒SsHADV-1，说明SsHADV-1在自然界中广泛分布。在离体油菜叶片上进行致病力测定，结果表明28个菌株致病力下降或完全丧失致病力。从分离自安徽省肥东县的菌株AH98中发现了2个病毒，一个是核盘菌弱毒病毒SsHV1，另一个为新的单股负义链RNA病毒，命名为核盘菌单股负义链RNA病毒1（Sclerotiniasclerotiorumnegative-strandedRNAvirus1,SsNSRV-1）。SsNSRV-1基因组为10002nt（GenBank登录号：KJ186782），基因组上线性分布有6个非重叠的ORF（ORFI-VI）。ORFV编码病毒的L蛋白，含有单股负义链RNA病毒（Mononegaviruses）保守的RdRp结构域Mononeg_RNA_pol(pfam00946)，而其它基因与NCBI数据库中序列均没有显著相似性。基因间隔区具有保守的序列(A/U)(U/A/C)UAUU(U/A)AA(U/G)AAAACUUAGG(A/U)(G/U)，是Mononegaviruses普遍存在的“Gene-junctionsequences”，其中“AAAACUUAGG”是上游基因的转录终止信号，“UAUUUAAUAAAACU”是下游基因的转录起始信号。5’RACE、3’RACE以及Northernblot分析发现，6个基因均可单独进行转录。在纯化的病毒粒子以及菌丝切片中均观察到了具有膜状结构的病毒粒子，呈线形，与Filoviridae中的病毒粒子形态相似，直径25-50nm，长度约1000nm。SsNSRV-1的核衣壳呈螺旋状结构，构象变化较大，结构致密时，直径约22nm，长度约200-2000nm。SsNSRV-1的核衣壳蛋白可能具有两种形式，一个大小为43KDa（p43），另一个大小为41KDa（p41），且均由ORFII编码。通过Northernblot分析证明了病毒粒子中的SsNSRV-1基因组RNA，并且发现了缺陷型RNA的存在。通过克隆得到了这些缺陷型RNA的序列，序列分析表明SsNSRV-1病毒粒子中的缺陷型RNA有多种不同的类型，主要是3’端的ORFI、ORFII发生了不同程度的缺失，5’端也有少量的缺失。系统发育分析表明，i 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文SsNSRV-1属于单股负义链RNA病毒目（Mononegavirales），与Bornaviruses和Nyamiviruses亲缘关系较近，然而在基因组结构上有很大差异，因此，SsNSRV-1在进化上可能代表一个独立的进化世系。SsNSRV-1的病毒粒子在PEG介导的作用下能够侵染核盘菌的原生体，并且能够引起核盘菌产生弱毒症状，包括生长速度减慢、菌落形态异常、丧失致病力、不能产生菌核、菌丝尖端生长发生严重扭曲等。SsNSRV-1在自然界中分布广泛，这是首次在真菌界中发现的单股负义链RNA病毒，证明自然界中存在真菌负义链RNA病毒。从分离自四川省荥经县的菌株SCH941中发现了2个新的dsRNA病毒，一个是双节段dsRNA病毒，命名为核盘菌双节段RNA病毒1（Sclerotiniasclerotiorumbotybirnavirus1,SsBRV1），另一个dsRNA病毒是呼肠孤病毒，命名为核盘菌呼肠孤病毒1（Sclerotiniasclerotiorumreovirus1,SsReV1）。SsBRV1基因组具有2条dsRNA片段，即dsRNA1和dsRNA2，全长分别为6457bp（GenBank登录号：KP774592）和5965bp（GenBank登录号：KP774593）。dsRNA1含有一个大的开放阅读框（ORF1,nt568-6343），推定蛋白含有1925个氨基酸，含有一个RdRp保守结构域（RdRp_4,Pfam02123）；dsRNA2也只含有一个大的开放阅读框（ORF2,nt577-5848），推定蛋白含有1757个氨基酸，该蛋白功能未知。dsRNA1与dsRNA2具有保守的末端序列。SsBRV1含有一条卫星RNA，全长为1647bp（GenBank登录号：KP774594），在序列上与dsRNA1、dsRNA2均没有显著的相似性，同时也没有发现具有潜在功能的ORF，功能未知。ORF2的nt2650-2953含有一个生长素受体结合功能域（hormonereceptorbindingdomain,GHBP,Pfam12772）。ORF1的氨基酸区域aa348-807与ORF2的氨基酸区域aa135-621之间具有显著的相似性。SsBRV1病毒粒子呈球形，直径38nm左右，含有dsRNA1、dsRNA2以及卫星RNA。SsBRV1病毒粒子含有3个结构蛋白p120、p100和p80，分子量大小为120KDa、100KDa和80KDa，分别由ORF2和ORF1编码。在PEG介导的作用下，病毒粒子可以侵染核盘菌的原生质体，但是卫星RNA可以丢失。生物学特性比较发现，SsBRV1对核盘菌的影响与卫星RNA有关，卫星RNA能够引起核盘菌的弱毒特性，而卫星RNA丢失后，SsBRV1对核盘菌的生物学特性没有显著的影响。系统发育分析发现，SsBRV1与灰霉双节段dsRNA病毒BpRV1有最近的亲缘关系，同时与单组分的全病毒UmV-H1以及未分类的dsRNA病毒SpFV1和CiTV1也有较近的亲缘关系。在分类上，SsBRV1可能属于Wu等2013年建议成立的Botybirnaviridae。SsReV1基因含有11条dsRNA片段（S1-S11），Northernblot分析证明了这些dsRNA片段的存在，基因组大小为28055bp，GC含量为42.6%，基因组序列还未提交到NCBI数据库中。S1-S11的末端序列含有保守的序列“5’-GAGWUKK-------UGCAGUC-3’”，W表示U或A，K表示U或G，其中标有下划线的核苷酸是严格保守的。除S6和S11外，ii 核盘菌新型RNA病毒研究其它dsRNA片段均只含有1个ORF，分别命名为ORF1-ORF11，编码的蛋白分别命名为VP1-VP11。VP1是病毒的RdRp，VP2可能是病毒的甲基转移酶，VP8可能是病毒的激酶和螺旋酶，其它蛋白的功能还未知。VP6-1和VP7分别含有保守的功能域DSRM功能域（Double-strandedRNAbindingmotif,pfam00035）和Atg14功能域（UVradiationresistanceproteinandautophagy-relatedsubunit14,pfam10186），并且分别与细菌的RNaseIII和真菌的一个保守的假定蛋白具有显著的相似性。SsReV1的病毒粒子呈球形，直径在65nm左右，病毒粒子表面没有明显的刺突状结构，含有6个蛋白组分，根据分子量大小分别命名为p165、p145、p65、p63、p57、p30。肽段指纹图谱（PMF-MS）鉴定表明p165即VP1，p145即VP2，p57即VP9，而p65、p63、p30分别由ORF5、ORF8和ORF9编码。SsReV1的病毒粒子在PEG介导的作用下，能够侵染核盘菌的原生质体，生物学特性比较发现，SsReV1表现为隐性侵染，对核盘菌的生物学特性没有显著的影响。系统发育分析表明，SsReV1并不属于已经成立的真菌呼肠孤病毒属（Mycoreovirus），而与侵染哺乳动物的Coltiviruses具有更近的亲缘关系。在分离自湖南省的菌株HN138中发现了核盘菌DNA病毒SsHADV-1和一个双节段dsRNA病毒，命名为核盘菌双节段dsRNA病毒3（Sclerotiniasclerotiorumbotybirnavirus3,SsBRV3）。SsBRV3基因组含有2条dsRNA片段，即dsRNA1和dsRNA2，大小分别为6213bp和5878bp，序列尚未提交到NCBI数据库中，与灰霉双节段dsRNA病毒BpRV1在核酸水平分别具有92%和97%的相似性，氨基酸水平上分别有97%和99%的相似性，因此SsBRV3与BpRV1为同一个病毒的不同株系。SsBRV3对核盘菌和灰霉的生物学特性均没有显著的影响，而BpRV1能够引起灰霉寄主产生严重的衰退症状。氨基酸差异比较发现，SsBRV3与BpRV1的ORF1有53个氨基酸的差异，其中23个氨基酸化学性质发生改变，且在948位发生了一个脯氨酸的缺失；ORF2氨基酸差异较少，共有15个氨基酸差异，其中4个氨基酸化学性质发生了改变，这些氨基酸位点的差异可能导致SsBRV3和BpRV1生物学特性差异。菌株HN138具有大量的气生菌丝，不产生菌核，与SsHADV-1侵染的核盘菌表型有显著的区别，因此SsBRV3与SsHADV-1可能具有互作关系。首次利用宏病毒组学（Metavirome）来发掘核盘菌的病毒资源。从50个核盘菌菌株中共发现了36个病毒基因组类似的序列，24种+ssRNA病毒，8种dsRNA病毒，4种DNA病毒，其中包括SsHADV-1，同时还有108条未知信息的序列。因此，宏病毒组学在发掘真菌病毒资源方面是一个强大的工具，同时揭示了核盘菌真菌病毒具有丰富的种类和多样性。关键词：核盘菌；真菌病毒；-ssRNA病毒；dsRNA病毒；弱毒现象；系统发育分析；宏病毒组学iii 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文AbstractThefungusSclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBaryisanimportantplantpathogenworldwide,withabroadrangeofhostsandnaturaldistribution.Mycovirusesorfungalvirusesarewidelypresentinfungi,andhypovirulence-associatedmycovirusesarepotentialtobeexploitedasbiologicalcontrolagents.TherearemanyanddiversemycovirusesinthefungusS.sclerotiorum.Mycovirusesdiscoveryfromthisfunguscontributestolookinsightintotheinteractionsbetweenmycovirusesandfungi,virusclassificationandevolution,andprovidesusefultoolsforthebiologicalcontrolofsclerotialdisease.Wehaveisolated1967strainsofS.sclerotiorumcollectedfromHunanprovinceandAnhuiprovince，andobtained38strainswithanabnormalcolonymorphology,ofwhichtherewere29strainsfromHunanprovinceand9strainsfromAnhuiprovince.Basedonthecolonymorphology,wehaveclassifiedthesestrainsinto4types.TypeI,7strainshadanabnormalcolonymorphologybutrestoredanormalcolonymorphologyduringsubculturedonPDA.TypeII,9strainshadanormalcolonymorphologywithoutsclerotium.TypeIII,13strainshadanabnormalcolonymorphologywithoutsclerotium.TypeIV,9strainshaveanabnormalcolonymorphologywithafewsclerotia.Agarosegel-electrophoresedanalysisofdsRNAandDNAisolatedfromthesestrainsshowedthatthereweremultipledsRNAorextrachromosomalDNAsegments.PCRdetectionfortheSclerotiniasclerotiorumassociated-hypovirulentDNAvirus1(SsHADV-1)revealedthatSsHADV-1waspresentinafewstrainsandthus,waswidelyspreadinthenaturalenvironment.Virulencetestonthedetachedleavesofrapeseedshowedthat28strainswerehypovirulent.TwoviruseswereidentifiedfromstrainAH98whichwascollectedfromFeidongcounty,Anhuiprovince.OnewastheSclerotiniasclerotiorumhypovirulentvirus1(SsHV1)andtheotherwasanovelnegative-strandedRNA(-ssRNA)virusnamedasSclerotiniasclerotiorumnegative-strandedRNAvirus1(SsNSRV-1).Thefull-lengthofSsNSRV-1genomewas10002nt(GenBankaccession,KJ186782)with6non-overlappedgenes(ORFI-VI)whichwerelinearlyarrangedinthegenome.ORFVencodedalargeprotein(Lprotein)with1934aminoacidsandcomprisedaconservedmononegaviralRdRpdomainMononeg_RNA_pol(pfam00946)whichwascloselyrelatedtomononegaviruses,whileotherORFsdidn’thaveasignificantsequencesimilaritywithanysequenceintheNCBIdatabase.Conservedsequences(A/U)(U/A/C)UAUU(U/A)AA(U/G)AAAACUUAGG(A/U)(G/U)wereidentifiedamongiv 核盘菌新型RNA病毒研究eachORF,whichisthe“Gene-junctionsequences”ofSsNSRV-1.Thesequence“AAAACUUAGG”wasthetranscriptionalstopsignaloftheupstreamORFand“UAUUUAAUAAAACU”wasthetranscriptionalstartsignalofthedownstreamORF.“Gene-junctionsequences”arewidelypresentinmononegavirusesandistheuniquepropertyofMononegaviruses.5’RACE,3’RACEandNorthernblotanalysisrevealedthatallthesixORFscanbetranscribedindependently.SsNSRV-1mayhaveenvelopedvirionswhichwereobservedbothinthepurifiedvirionpreparationsandultrathinhyphalsections.Thenucleocapsidsarelong,flexible,helical,andare22nmindiameterand200–2,000nminlength.SDS/PAGEshowedthatthenucleocapsidpossiblycontainedtwonucleoproteinswithdifferentmolecularmasses,43kDa(p43)and41kDa(p41)bothofwhichweretranslatedfromORFII.NorthernblotanalysisconfirmedSsNSRV-1genomereleasedfromthevirionsandindicatedthepresenceofdefectiveRNA.WehaveclonedthesequencesofthedefectiveRNAsandtheresultsshowedthatthereweredifferentsequence-deletedtypesinORFIandORFIIwhileashortsequencewasdeletedinthe5’termini.PhylogeneticanalysisbasedonRdRpshowedthatSsNSRV-1isamemberofMononegaviralesandclusteredwithvirusesofNyamiviridaeandBornaviridae.SsNSRV-1wasdifferentfromNyamivirusesandBornavirusesingenomeorganizationandmayrepresentanewevolutionarylineage.PurifiedSsNSRV-1virionscansuccessfullytransfecttheprotoplastsofS.sclerotiorumandleadtodebilitatingsymptomsinthefungalhostcharacterizedbylowergrowthrate,abnormalcolonymorphology,lesspathogenicityandcurledhyphaltips.Moreover,SsNSRV-1iswidelydistributedinthenaturalenvirionment,thuswehavefirstlyfounda-ssRNAvirusthatcaninfectthefungalhostanddemonstratedthatthefungal-ssRNAviruswaspresentinthenaturalenvironment.TwonoveldsRNAviruseswereidentifiedfromstrainSCH941whichwascollectedfromYingjingcounty,Sichuanprovince.OnewasabipartitedsRNAvirusnamedasSclerotiniasclerotiorumbotybirnavirus1(SsBRV1)andtheotherisanovelreovirusnamedasSclerotiniasclerotiorumreovirus1(SsReV1).ThegenomeSsBRV1comprisedtwodsRNAsegments(dsRNA1anddsRNA2),withsizesof6457bp（GenBankaccession,KP774592）and5965bp(GenBankaccession,KP774593),respectively.OnelargeORFwasfoundindsRNA1,whichencodedaproteinwith1925aminoacidsandcontainedaconservedRdRpdomain(RdRp_4,Pfam02123).OnelargeORFwasalsofoundindsRNA2,whichencodedaproteinwith1757aminoacidwhosefunctionwasunclear.Asatellite-likeRNA(SatlRNA)wasalsofoundwith1647bpinsize(GenBankaccession,KP774594)anddidn’thaveanysignificantsenquencesimilaritywithdsRNA1orv 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文dsRNA2.Ahormonereceptorbindingdomain(GHBP,Pfam12772)wasidentifiedinORF2(nt2650-2953).TherewasaregionbetweenORF1andORF2whichsharedasignificantsequencesimilaritywithEvalue4e-10.SsBRV1hadsphericalvirionswith38nmindiameter,andthreedsRNAsegmentscorrespondingtodsRNA1,dsRNA2andSatlRNAofSsBRV1.Threestructuralproteinswereidentifiedwithmassesof120KDa(p120),100KDa(p100)and80KDa(p80)whichweretranslatedfromORF2andORF1,respectively.VirionsofSsBRV1cansuccessfullytransfecttheprotoplastsofS.sclerotiorumwithPEG-mediatedmethodwhileSatlRNAcanbeeliminatedinsometransfectants.SsBRV1carryingSatlRNAcansignificantlyreducethegrowthandvirulenceofS.sclerotiorumwhilehadlittleeffectonthecolonymorphology.SsBRV1lostSatlRNAhadnoobviouseffectsonthebiologicalpropertiesofS.sclerotiorum.PhylogeneticanalysisrevealedthatSsBRV1hadacloserelationshipwithbipartitedsRNAvirusBpRV1andmonopartitedsRNAvirusesUmV-H1,SpFV1andCiTV1.SsBRV1maybelongtothevirusfamilyBotybirnaviridaeproposedbyWuetal.2013.ThegenomeofSsReV1encompassed11dsRNAsegments(S1-S11)whichwasconfirmedbyNorthernblotanalysis.Thefull-lengthgenomeofSsReV1was28055bpwith42.6%GCcontentandhadyetnotbeensubmittedintheNCBIdatabase.Conserved5’-terminalsequences“5’-GAGWUKK-3’”and3’-terminalsequences“5’-UGCAGUC-3’”werefoundineachdsRNAsegmentandthenucleotidesunderlinedwasstrictlyconserved(W,UorA;K,UorG).TherewasonlyoneORFineachdsRNAsegmentexceptdsRNA6anddsRNA11inwhichthereweretwoORFs.CorrespondingtodsRNA1-dsRNA11,theORFswerenamedasORF1-ORF11whoseproteinsweresubsequentlynamedVP1-VP11.ProteinVP1waspredictedtobetheRdRpofSsReV1responsibleforvirusreplicationandmaintenance.VP2waslikelytobeviralmethyltransferase,andVP8waslikelytobeviralkinaseandhelicase,whiletherolesofotherviralproteinswereunkown.TherewasaconservedDouble-strandedRNAbindingmotif(DSRM,pfam00035)inVP6-1whichsharedasignificantsequencesimilaritywiththeRNaseIIIofmanybacteria.TherewasalsoaconservedUVradiationresistanceproteinandautophagy-relatedsubunit14(Atg14,pfam10186)inVP7whichsharedasignificantsequencesimilaritywithaconservedhypotheticalproteinwidelyspreadinfungi.SsReV1hadsphericalvirionswith65nmindiameterwhichhadnoobviousprotuberantstructuresonthesurface.SsReV1virionshad6proteincomponentsnamedasp165,p145,p65,p63,p57andp30correspondingtothemolecularweightoftheseproteins.Polypeptidesmassfinger-Massspectrum(PMF-MS)analysisshowedthattheproteinsp165,p145andp57wereVP1,VP2andVP9encodedbyORF1,ORF2andvi 核盘菌新型RNA病毒研究ORF9,respectively.Theotherproteinsp65,p63andp30wereencodedbyORF5,ORF8andORF9,respectively.SsReV1virionscansuccessfullytransfecttheprotoplastsofS.sclerotiorumwithPEG-mediatedmethod.SsReV1infectionwascrypticandhadnoobviouseffectsonthebiologicalpropertiesofthefungalhost.PhylogeneticanalysisbasedontheRdRpsequencerevealedthatSsReV1wasnotamemberofMycoreovirusandmorecloselyrelatedtoanimalvirusesColtiviruses.PotentialinteractionsmaybepresentbetweenSsBRV1andSsReV1.TwoviruseswereidentifiedfromstrainHN138whichwascollectedfromAnxiangcounty,Hunanprovince.OnewastheDNAvirusSsHADV-1andtheotherwasadsRNAvirusnamedasSclerotiniasclerotiorumbotybirnavirus3(SsBRV3).SsBRV3genomealsoencompassedtwodsRNAsegments,dsRNA1anddsRNA2withsizesof6213bpand5878bp,respectively.ThegenomesequenceofSsBRV3hasyetnotbeensubmittedtotheNCBIdatabase.BetweenSsBRV3andBpRV1，therewere92%and97%sequencesimilarityatnucleotidelevel,and97%and99%sequencesimilarityataminoacidlevel.Therefore,SsBRV3andBpRV1shouldbedifferentstrainsofthesamevirus.SsBRV3hadnoobviouseffectsonthebiologicalpropertiesofS.sclerotiorumandBotrytiscinerea,whileBpRV1conferreddebilitatingsymptomstoitsfungalhost.BetweentheORF1-encodedpolypeptidesofSsBRV3andBpRV1,therewere53differentaminoacids,ofwhich23aminoacidswerechangedinchemicalproperties.TherewasaprolinedeletedintheORF1-encodedpolypeptideofSsBRV3.BetweentheORF2-encodedpolypeptidesofSsBRV3andBpRV1,therewere15differentaminoacids,ofwhich4aminoacidswerechangedinchemicalproperties.StrainHN138hadmoreaerialmyceliaandlostsclerotialproductivitywhichweredistinctfromthatofSsHADV-1-infectedstrains.Therefore,potentialinteractionsmaybepresentbetweenSsBRV3andSsHADV-1.Wehavefirstlyusedmetavirometodiscovervirusesfrom50strainsofS.sclerotiorumandobtained36viruses-likesequencesincluding24+ssRNAviruses,8dsRNAviruses,4DNAvirusesincludingSsHADV-1whiletherewereanother108sequenceswithnoinformation.Therefore,MetaviromeisapowerfultooltodiscoverfungalvirusesandrevealsthattherearemanyanddiversemycovirusesinthefungusS.sclerotiorum.Keywords:Sclerotiniasclerotiorum;mycoviruses;-ssRNAviruses;dsRNAviruses;hypovirulence;phylogeneticanalysis;Metaviromevii 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文缩略语表Abbreviations缩略词英文全称中文全称aaaminoacid氨基酸bpbasepair碱基对BLASTBasiclocalalignmentsearchtool局部比对检索工具BSAAlbuminBovine牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNACPCoatprotein外壳蛋白DEPCDiethypyrocarbonate焦炭酸二乙酯ddH2ODeionizedwater去离子水dsRNADoublestrandedRNA双链RNADMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜EBEthidiumbromide溴化乙锭GenBankGeneticsequencedatabase遗传序列数据库mRNAMessengerRNA信使RNANCBINationalCenterforBiotechnologyInformation国家生物技术信息中心NPnucleocapsids核衣壳ORFOpenreadingframe开放阅读框PAGEPolyacylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PEGpolyethyleneglycol聚乙二醇PDAPotatodextroseagar马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDBPotatodextrosebroth马铃薯葡萄糖液体培养基PCDprogrammedcelldeath细胞程序性死亡RACERapidamplificationofcDNAendscDNA末端快速扩增RNAiRNA-interfereRNA干扰ROSReactiveOxygenSpecies活性氧类RT-PCRReversetranscriptRCR逆转录PCRSDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠UTRuntranslatedregion非翻译区+ssRNApositive-strandedsingleRNA正单链RNA-ssRNAnegative-strandedsingleRNA负单链RNAviii 核盘菌新型RNA病毒研究第一章前言1.1核盘菌危害与防治策略1.1.1核盘菌与致病机理核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum(Lib)deBary）是一种世界性的真菌病害，寄主范围广泛，可达400多种植物，主要危害十字花科（Cruciferae）、豆科（Fabaceae）、茄科（Solanaceae）等多种经济作物，引起的病害为作物菌核病（Boltonetal.,2006）。核盘菌是死体营养型（necrotrophic）同宗配合（homothallic）的植物病原真菌。核盘菌的生活史包括子囊孢子、菌丝和菌核三种形态，不产生无性孢子，偶尔在菌丝或子囊盘上也会产生一些小孢子（Kohn,1979;张重梅等，2011），但是这些小孢子不能够萌发，在核盘菌生活史中的意义还不明确。菌核是核盘菌的休眠体，在病害的循环中发挥着重要的作用，可以在土壤中存活8年以上（Adamsetal.,1979），在条件适宜的时候可以产生子囊盘以及子囊孢子，是菌核病的主要初侵染源（Schwartzetal.,1978;Abawietal.,1979;Steadman,1979），菌核还可以直接产生菌丝侵染和危害植物（Tourneau,1979;Bardinretal.,2001）。核盘菌的致病机理主要包括以下几个方面：（1）细胞壁降解酶（cellwall–degradingenzyme,CWDE）：植物细胞壁对病原物是一个重要的障碍，在抵抗病原物侵入时发挥着重要的作用（Hematyetal.,2009;Underwood,2012）。为了克服这个障碍，植物病原真菌必须产生能够降解纤维素、半纤维素、果胶等细胞壁成分的酶类-细胞壁降解酶，这些酶类主要包括纤维素酶（Cellulases）、半纤维素酶（Hemicellulose）、果胶酶（Pectinase）等（Kubiceketal.,2014）。核盘菌中的细胞壁降解酶主要有果胶酶类多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase）21个，聚半乳糖醛酸裂解酶（Polygalacturonatelyases）4个；纤维素酶25个；β糖苷酶（β-Glycosidases）16个；木聚糖酶（Xylanase）5个（Hancock,1966;Lumsden,1969;Riouetal.,1991;Amselemetal.,2011;Kubiceketal.,2014）；（2）次生代谢产物：核盘菌的次生代谢产物中，研究最多就是草酸（Oxalicacid），草酸能够通过多种方式促进核盘菌成功2侵染，包括提供酸性环境、螯合Ca+、激活细胞壁降解酶的活性、调控活性氧（ROS）参与的信号途径、还能够作为效应子（effector）诱导细胞凋亡（Duttonetal.,1996;Cessnaetal.,2000;Williamsetal.,2013）；（3）致病相关基因：Zhu等2013年报道类似于整联蛋白核盘菌基因SSITL具有类似于effector的作用，能够增强核盘菌的致病力同时抑制植物的早期抗病反应；Xiao等2014年报道，核盘菌的分泌蛋白Ss-Caf12+含有一个结合Ca的EF-hand功能域，该基因破坏后不能形成侵染垫，同时也不能1 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文够在离体的油菜叶片上产生病斑，但是相对于野生型能够积累更多的草酸；Liang等2015年研究了核盘菌的两个草酸脱羧酶基因Ss-odc1和Ss-odc2，Ss-odc1敲出突变体对核盘菌的生长速度、菌落形态及致病力没有显著影响，而Ss-odc2敲出突变体核盘菌的草酸积累量显著下降，同时不能形成附着胞，丧失致病力；Liberti等2013年报道，核盘菌的过氧化物酶体肉毒碱乙酰转移酶（peroxisomalcarnitineacetyltransferase）敲出突变体能够影响菌核、子囊盘以及附着胞的发育，同时还影响菌落形态以及草酸的积累量等；Guyon等2014年利用生物信息学的方法在植物中鉴定出了486个核盘菌分泌蛋白基因，其中的多数基因功能未知，同时根据effector的特点筛选出了78个可能具有effector功能的基因，因此核盘菌中有众多的基因参与并在致病过程中发挥了重要作用。1.1.2核盘菌防治策略核盘菌寄生范围很广，由核盘菌引起的菌核病严重威胁着我国的油菜、大豆、向日葵等重要油料农作物的生产和安全，同时对番茄、莴苣、胡萝卜等蔬菜也造成严重的损失。在我国的长江流域，核盘菌主要危害油菜，并且随着施肥水平的提高、耕作方式粗放管理以及气候等因素，油菜菌核病在长江流域有逐年加重的趋势，每年在长江流域菌核病的发病面积在400万公顷以上，产量损失5%-25%，直接经济损失数亿元（易红娟等，2008），因此菌核病的防治对我国的作物生产和经济发展具有重要的意义。核盘菌的防治策略主要有以下几种方式：（1）筛选具有抗核盘菌的基因资源：Neukermans等2015年发现能够响应H2O2的蛋白ARACIN1和ARACIN2具有抗多种真菌的能力，包括灰霉（Botrytiscinerea）、黑斑病菌（Alternariabrassicicola）、镰刀菌（Fusariumgraminearum）、以及核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）等，在拟南芥中表达ARACIN1可以抵抗灰霉（B.cinerea）、黑斑病菌（A.brassicicola）的侵染；Wang等2012年发现，油菜中的水杨酸（salicylicacid,SA)和茉莉酸（jasmonicacid,JA)在核盘菌的侵染过程中含量大量增加，施加外源的SA和甲基化的SA能够显著增强植物对病原物的抗性，因此，SA和JA信号通路在抵抗核盘菌的过程中起着正调控的作用；Wang等2014年发现在油菜中超量表达转录因子BnWRKY33能够增加对核盘菌的抗性；Zhang等2013年发现拟南芥中类似于受体蛋白的蛋白30（receptor-likeprotein30,RLP30）能够响应MAMP激发的信号通路，表现出对核盘菌显著的抗性；Fan等2013年将具有广谱细菌和真菌抗性的脂质转移蛋白（Lipidtransferprotein）转入到油菜中发现，T1后代的转基因植株与抗病性有关的指标明显上升，包括丙二醛（malondialdehyde）的含量下降、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase）的含量上升以及过氧化物酶（peroxidase）含量上升等；Wu等2013年在油菜中定位到了具有抗病性的QTL，并且指出与拟南芥IGMT5同源的油菜基因BnaC.IGMT5很可2 核盘菌新型RNA病毒研究能就是具有抗性的QTL的主要基因，但是这些抗性基因的实际应用还有待进一步开发和利用。（2）利用化学农药杀菌剂目前仍是菌核病防治的主要手段，对防治油菜、大豆和一些蔬菜的菌核病起到了很大的作用（Baileyetal.,2000;Leeetal.,2012;Barriereetal.,2014）。但是随着化学杀菌剂尤其是多菌灵的大量施用，导致田间的菌核病产生了不同程度的抗药性（王真等2010）；周锋等2014年发现陕西省和黑龙江省的核盘菌菌株对化学药剂菌核净也产生了不同程度的抗药性，并且有些菌株达到了高抗的水平。这些抗性菌株的产生对作物生产、药剂生产以及生态环境构成了严重的威胁，同时农药残留问题已经对环境、人类健康以及田间的生态系统产生了严重的危害。（3）农业措施在防治油菜菌核病方面也发挥着重要的作用，包括清理病残体、水旱轮作、适当晚播、合理密植以及加强田间管理等（高雪等，2009；余夕辉等，2008；邵先强等，2008）。但是农业措施也存在一些问题，比如清理病残体、加强田间管理会增加劳动成本，对已经发病的农作物没有作用并且不能消除菌核病的根源。（4）生物防治，即利用有益微生物控制和防治核盘菌。菌核病的生物防治主要包括三种方式，一是利用重寄生真菌如盾壳霉（Coniothyriumminitans）、木霉（Trichodermaspp.）等（Budgeetal.,2001;Lietal.,2006;Abdullahetal.,2008;杨龙，2009；Zengetal.,2012）；二是利用拮抗微生物如芽孢杆菌、假单胞菌等（Behnametal.,2007;Alvarezetal.,2012;Elkahouietal.,2014）；三是利用真菌病毒的弱毒特性（Heinigeretal.,1994;Xieetal.,2006;Chibaetal.,2009;Wuetal.,2012;Yuetal.,2013）。生物防治具有安全、持久、无污染且不产生抗药性等优势，并且有利于生态环境和人类健康，但是在应用中也存在很多问题，比如效果不稳定、易受环境影响、储存不方便、作用过程较慢等，还需要进一步的探索和研究（李凯等，2012）。1.2真菌病毒多样性1.2.1病毒与真菌病毒在过去10年，环境基因组学主要发现的生物实体就是种类众多、数量巨大的病毒(Edwardsetal.,2005;Suttle,2005,2007;Rohweretal.,2009)。病毒定义为能够在细胞中进行复制和繁殖的分子寄生物，它广泛存在于各种环境中，包括空气、土壤、海洋、粪便等，同样也广泛存在于各种生物中，包括人、动物、植物、昆虫、真菌、细菌等。长期以来，病毒就背负着很坏的“名声”，人们一直对病毒的认识往往带有严重的“偏见”。实际上，病毒只是细胞内能够自我复制和繁殖的分子寄生物，是地球上一种普通的生物实体，很多病毒与其寄主是互利共生的，甚至是有利的（Roossinck,2011）。最有代表性的一个例子就是弯孢耐热病毒（Curvulariathermal-tolerancevirus,CThTV），该病毒是一植物内生真菌弯孢真菌3 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文（Curvulariaprotuberata）的病毒，感染了CThTV的真菌，能够赋予植物耐高温的特性，植物可以在超过50℃的环境下生长（Marquezetal.,2007）。真菌病毒最初是在双孢蘑菇（Agaricusbisporus）中发现并加以描述的，也是作为一种病害而引起人们的关注（Hollings,1962）。但是这些能够对植物病原真菌产生“病害”的真菌病毒，对人类却是有益的，能够作为生防因子防治和控制作物的真菌病害（Nuss,2005）。真菌病毒（Fungalvirus或Mycovirus）是指与真菌有关的，能够在真菌体内进行复制和繁殖的一类病毒。真菌作为生物分类的一大系统之一，而真菌病毒却长期得不到应该有的关注和地位。尽管真菌病毒发现比较晚，但是真菌病毒也有着比较古老的起源（Liuetal.,2009;Chibaetal.,2011;Ghabrialetal.,2015）。1.2.2真菌病毒的发现真菌病毒在真菌中广泛存在，到目前为止，在蘑菇、医药真菌、植物病原真菌、植物内生真菌中均发现了真菌病毒的存在，在NCBI数据库中，登陆注册的真菌病毒超过250种。根据基因组的性质，真菌病毒可以分为线性dsRNA（double-stranded）病毒，线性的+ssRNA（positive-strandedRNA）正单链RNA病毒，以及单链环状DNA病毒。dsRNA病毒包括7个病毒科，即Totiviridae、Endornaviridae、Partitiviridae、Megabirnaviridae、Quadriviridae、Chrysoviridae、Reoviridae；+ssRNA病毒包括6个病毒科Alphaflexiviridae、Barnaviridae、Gammaflexiviridae、Endornaviridae、Hypoviridae和Narnaviridae（Ghabrialetal.,2015）。另外还有大量尚未分类的真菌病毒报道，比较有代表性的如灰霉双节段dsRNA病毒BpRV1，镰刀菌RNA病毒FgV4，以及稻曲菌单节段病毒UvNV-1。BpRV1病毒基因组具有2条dsRNA片段，但是基因组远大于双分病毒，而亲缘关系上与单组分的dsRNA病毒具有较近的亲缘关系（Wuetal.,2012）；FgV4基因组具有2条dsRNA片段，基因组大小与双分病毒接近，但是dsRNA2上有2个ORF，也没有病毒粒子（Yuetal.,2009）；UvNV-1基因组只有一个dsRNA片段，但是与双分病毒有较近的亲缘关系（Zhangetal.,2014）。随着真菌数量的增多，将有更多的真菌病毒在分子特性和进化地位表现出独特的特性。但是目前关于负单链RNA（-ssRNA）病毒、线性dsDNA（double-strandedDNA）病毒在真菌中还没有发现。Kondo等2013年在草币斑病菌（Sclerotiniahomoeocarpa）的EST数据中找到了与-ssRNA病毒具有显著相似的序列，具有与单股负义链RNA病毒类似的基因组结构和特性，并且指出这些序列可能来源于真菌负义链RNA病毒，提出了真菌负义链RNA病毒存在的证据。4 核盘菌新型RNA病毒研究1.2.3宏病毒组学与真菌病毒资源的发掘宏病毒组学（Metavirome）是一个非常强大的工具，应用到生物领域的各个方面，最初这一方法就是用来分析病毒的群体和结构。病毒具有自己的特点，它不像其它生物一样含有保守的序列或功能域，病毒在基因组序列和蛋白水平上具有广泛的多样性。早在2006年，Angly等就用宏病毒组学分析海洋中的病毒，Labonte等2013年重新分析海洋中的病毒群体，发现病毒具有高度丰富的多样性，并且还发现了很多的未知序列。深度测序也用于检测和挖掘植物中的病毒（Rwahnihetal.,2009;Roossinck,2012;StobbeandRoossinck,2014）。利用宏病毒组学在真菌中发掘病毒资源目前还比较少，Feldman等2012年在植物内生真菌中利用深度测序发现种类丰富的真菌病毒。因此，宏病毒组学在病毒资源发掘方面具有强大的优势。1.3真菌病毒应用1.3.1真菌病毒在医学上的应用最初真菌病毒是作为双孢菇的一种黑死病引起人们关注的（SindenandHauser,1950;Hollings,1962）。随后在青霉菌中发现真菌病毒的dsRNA能够诱导产生干扰素，引起了真菌病毒在经济和医学上的重要的应用（EllisandKleinschmit,1967;Kleinschmitetal.,1964;Lampsonetal.,1967），进一步研究表明该病毒的病毒粒子和dsRNA均能够在动物中有效地诱导干扰素的产生（Bucketal.,1971）。酵母、黑粉菌中的一些真菌病毒能够编码毒性蛋白（killerprotein），能够有效抑制周围生物的生长（Bevanetal.,1973;Schmittetal.,1994;Wickneretal.,2013）。1.3.2真菌病毒在生物防治上的应用板栗疫病（Chestnutblight）在1904年开始在北美大规模的流行，在欧洲开始于1930年，给板栗树带来了巨大的危害。板栗疫病在欧洲流行的15年里，在意大利发现了能够康复的板栗树，在60年代从康复的病斑上分离得到了具有弱毒特性的板栗疫菌（Cryphonectriaparasitica）菌株（Grenteetal.,1965）。随后研究人员证明，板栗疫菌的弱毒特性与细胞质因子密切相关，并且能够通过菌丝融合传播这一弱毒特性（Grenteetal.,1969）。这一发现奠定了生物防治策略的基础，野外大规模的生物防治项目开始实施，并取得了显著的成效（Heinigeretal.,1994）。后续实验表明这些菌株的弱毒特性与dsRNA有密切关系，并且弱毒特性可以随着dsRNA的转移而转移（Anagnostakisetal.,1979）。在1991年，弱毒菌株EP713中的dsRNA病毒的基因组被克隆和公布，命名为Cryphonectriaparasiticahypovirus1（CHV1-EP713），5 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文由此成立了真菌病毒第一个病毒科-弱毒病毒科Hypoviridae（Shapiraetal.,1991）。CHV1作为生防因子在控制板栗疫病上的成功应用，吸引着大批的科研工作者不断地寻找具有弱毒特性的真菌病毒来控制植物病害，板栗疫菌与CHV1也为研究真菌病毒与寄主互作提供了模型和系统（Daweetal.,2001;Milgroometal.,2004;Nuss,2005）。1.3.3真菌病毒在生物防治上的优势弱毒病毒一旦侵染强毒力的真菌菌株，能够很快地抑制病斑的扩展，减少植物的损失，而且携带病毒的弱毒菌株一旦进入田间系统，能够持久有效地定殖在田间，并且可以传播，防效具有可持续性（Xieetal.,2014）。弱毒菌株定殖在植物上不会对植物造成危害或造成轻微伤害的同时作为致病相关的分子模式（pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs）或effector激发植物的防卫反应，增强植物的抗病性。同时，可以减少化学农药的大量施用，降低成本，避免植物病原物抗药性的产生，有利于田间的生态平衡，保护环境。1.3.4近年来发现的具有弱毒特性的真菌病毒具有弱毒特性的真菌病毒资源对于防治和控制植物病害具有重要的意义和价值。最近5年，在多种植物病原真菌中发现了多个具有弱毒特性的真菌病毒。在核盘菌中报道的具有弱毒特性的真菌病毒有核盘菌DNA病毒SsHADV-1、核盘菌弱毒病毒SsHV1和SsHV2、核盘菌双分病毒SsPV1以及核盘菌线粒体病毒SsMV1-4（Yuetal.,2010,2013;Xieetal.,2011;Huetal.,2014;Xiaoetal.,2014;Xieetal.,2012;Khalifaetal.,2013,2014;Xuetal.,2015）。灰霉中具有弱毒特性的病毒有灰霉双节段dsRNA病毒BpRV1、灰霉线粒体病毒SsMV1（Wuetal.,2010,2012）。镰刀菌中尽管发现了多种真菌病毒，但是能够产生弱毒特性的只有镰刀菌RNA病毒FgV1（Choetal.,2013）和镰刀菌弱毒RNA病毒FgHV2（Lietal.,2015）。在果树病原真菌葡萄座腔菌中发现了两个dsRNA病毒，即产黄青霉病毒BdCV1和BdPV1混合侵染能够引起葡萄座腔菌产生弱毒症状（Wangetal.,2014）。在其它病原真菌如纹枯菌（Rhizoctoniasolani）、稻瘟菌（Magnaportheoryzae）、黑粉菌（Ustilaginoideavirens）、烟草赤星病菌（Alternarialongipes）等重要的植物病原真菌中，尽管也有大量的真菌病毒报道，但是多数只侧重于病毒序列的报道，对其生物学特性研究并不多（Zhengetal.,2013;Zhangetal.,2014a,2014b;Marvellietal.,2014;Linetal.,2015）。6 核盘菌新型RNA病毒研究1.4真菌病毒与病毒的进化1.4.1真菌病毒与其它生物中病毒的关系典型的真菌病毒为dsRNA病毒，包括全病毒（Totiviruses）、双分病毒（Partitiviruses）、产黄青霉病毒（Chrsoviruses），这些病毒多数只在真菌中发现和报道，在其它生物中很少报道。随着真菌病毒数量的增多，真菌病毒的种类也越来越多，有些真菌病毒与其它物种中的病毒具有更近的亲缘关系，而与典型的真菌病毒亲缘关系却很远。真菌呼肠孤病毒MyRV-1、MyRV-3与哺乳动物和人的病毒具有很近的亲缘关系（Hillmanetal.,2004;Osakietal.,2002）。而利用电子克隆的方法，在植物和动物的EST数据库中找到大量的与真菌病毒全病毒、双分病毒、产黄青霉病毒等具有显著相似的病毒序列（Liuetal.,2012）。真菌中的单链RNA病毒具有更复杂和广泛的亲缘关系，灰霉病毒BVF、BVX以及SsDRV与植物病毒的甲型线性病毒（Alphaflexiviruses）和丙型线性病毒（Gammaflexiviruses）具有很近的亲缘关系。弱毒病毒与植物的马铃薯Y病毒科具有很近的亲缘关系（Kooninetal.,1991）。核盘菌RNA病毒SsRV-L与人类的戊型肝炎病毒、植物的长线形病毒（Closteroviruses）、甜菜坏死黄脉病毒属（Benyviruses）、烟草花叶病毒属（Tobamoviruses）以及侵染昆虫的ω四体病毒属（Omegatetraviruses）具有较近的亲缘关系，SsRV-L的发现表明脊椎动物、植物、昆虫以及真菌的病毒可能具有共同的起源（Liuetal.,2009）。真菌DNA病毒SsHADV-1的复制酶与双生病毒具有较近的亲缘关系，但是外壳蛋白与环境微生物中得到的序列具有较高的相似性，SsHADV-1的发现为双生病毒的进化和起源提供了新的线索（Yuetal.,2010;Krupovicetal.,2013;Saccardoetal.,2011）。因此，真菌病毒与其它生物中的病毒具有广泛的亲缘关系，表明真菌病毒具有古老的进化和起源，并且真菌病毒的起源具有多样性，随着时间的推移表现出了种类的多样性，但是还保留着进化留下的痕迹。1.4.2真菌病毒与生物间的基因水平转移真菌双分病毒SsPV-S的发现为探讨真菌病毒与生物间的基因水平转移拉开了序幕。SsPV-S的外壳蛋白与拟南芥中的生长激素亮氨酸抗性蛋白（IAA-leucine-resistantprotein2,ILR2）具有显著的相似性，真菌全病毒和双分病毒的RdRp的同源序列广泛存在于植物、节肢动物、真菌、线虫以及原生动物等多种真核生物的基因组中（Liuetal.,2010）；Chiba等2011年发现植物的基因组中存在多个真菌双分病毒基因的同源物，因此真菌病毒与多种生物间存在着遗传信息的交7 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文流，促进了病毒和整个生物界的进化。值得注意的是，尽管真菌中没有发现负义链RNA（-ssRNA）病毒，但是Kondo等2012年在豌豆白粉菌（Erysiphepisi）的基因组中发现了类似于-ssRNA病毒的序列，并且在草币斑病菌（Sclerotiniahomoeocarpa）的EST数据中找到了与-ssRNA病毒具有显著相似的序列，因此真菌负义链RNA可能存在，并且与真菌间也存在水平基因转移。1.5真菌病毒与寄主互作研究弱毒病毒CHV1不仅在生物防治上取得了成功，也为研究弱毒病毒与寄主互作提供了一个比较好的系统，在这方面的研究已取得了重要的进展。CHV1基因组有12.7Kb，含有2个大的ORF，ORFA和ORFB，ORFA编码一个多聚蛋白p69，通过具有蛋白酶活性的p29剪切产生p29和p40（Choietal.,1991a,1991b），ORFB同样含有一个蛋白酶p48，能够对ORFB编码产生的多肽进行加工（Shapiraetal.,1991）。siRNA（smallinterferingRNA,19-25bp）介导的基因沉默RNAi在众多真核生物中发挥着重要作用，包括生长发育、转基因、抗病毒以及转座子的调控等方面。在模式真菌粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）中存在2个RNAi的信号通路，一个信号通路调控真菌的营养生长，另一个信号通路调控真菌的减数分裂（Cogonietal.,1999a,1999b）。在板栗疫病菌（C.parasitica）同样有2个与siRNA产生有关的DCL（Dicer-like）基因DCL1和DCL2，DCL2在板栗疫病菌的抗病毒方面具有重要的作用，敲除突变体△dcl-2对CHV1和真菌呼肠孤病毒更敏感（Segersetal.,2007;Sunetal.,2008），首次表明真菌的RNAi系统与抗病毒有关。CHV1的蛋白酶p29能够诱导板栗疫病菌产生弱毒特性（Choietal.,1992;Cravenetal.,1993;Suzukietal.,1999），还能够作为RNA沉默抑制子（RNAsuppressor）抑制寄主的RNA沉默，增强病毒的复制和积累量（Suzukietal.,2003），p29是第一个鉴定的病毒起源的RNA沉默抑制子。而CHV1的p48不仅具有蛋白酶活性，而且还抑制板栗疫病菌的孢子形成及色素沉积（Dengetal.,2008）。在病毒与寄主互作方面，板栗疫病菌中受病2+毒影响的基因也进行了初步的鉴定，包括编码Mg转运蛋白的Nam-1基因、转录因子Cpste12基因以及多个含有Kex2加工信号的分泌蛋白，这些基因在病毒侵染时均表现出显著的下调（Choietal.,1992;Dengetal.,2008;Jacobetal.,2006），另外，在CHV1侵染时，MAPK信号途径的磷酸化状态会发生改变，因此MAPK在病毒与寄主的互作中也起着重要的作用（Turinaetal.,2007）。在核盘菌（S.sclerotiorum）与真菌病毒互作系统中，当SsDRV侵染核盘菌时，150个基因表达水平显著下降，这些基因涉及到核盘菌的多种生物过程。其中一个与整联蛋白相似的蛋白SSITL，在SsDRV侵染核盘菌是受到显著的下调，沉默该基因，核盘菌的致病力及生长速度显著下降（Zhuetal.,2013）。在紫纹羽病菌（Rosellinia8 核盘菌新型RNA病毒研究necatrix）与真菌病毒互作系统中，呼肠孤病毒MyRV-3的VP10能够作为沉默抑制子抑制寄主的抗病毒机制（Yaegashietal.,2013）。首次在整体水平上鉴定真菌与病毒的互作是在镰刀菌（F.graminearum）中，通过分析弱毒病毒FgV1侵染与未侵染菌株的转录组发现，有1775个镰刀菌的基因受到FgV1的显著影响，包括蛋白合成相关的基因，cAMP信号基因，以及转录因子等，并且在FgV1侵染时，真菌的防卫相关的基因在病毒侵染早期受到显著的下调，膜相关的转运蛋白相关基因也受到显著的下调，而胁迫相关的基因受到显著的上调（Choetal.,2012）。因此，在真菌病毒与寄主互作过程中，病毒能够影响真菌的多个方面，具体的机理还需要进一步的探索和研究。1.6核盘菌中真菌病毒研究概况核盘菌中首次报道dsRNA与弱毒特性有关是在弱毒菌株91中，然而这一dsRNA片段由于条件的限制没有得到全长基因组序列（Boland,1992）。核盘菌中的真菌病毒具有丰富的多样性，包括多种+ssRNA病毒、dsRNA病毒以及DNA病毒，分布在双分病毒科（Partitiviridae）、弱毒病毒科（Hypoviridae）、裸露RNA病毒科（Narnaviridae）、甲型线形病毒科（Alphaflexiviridae），还有一些未分类的病毒（Liuetal.,2012;Xiaoetal.,2014;Xieatel.,2011;Khalifaetal.,2014;Xieetal.,2012;Khalifaetal.,2013;Xuetal.,2015;Xieetal.,2006;Yuetal.,2010;Huetal.,2014;Liuetal.,2009）。核盘菌弱毒相关病毒（Sclerotiniasclerotiorumdebilitation-associatedRNAvirus,SsDRV）是甲型线形病毒科（Alphaflexiviridae）的成员，是核盘菌弱毒病毒属（Sclerodarnavirus）的代表种。而核盘菌RNA病毒L（SclerotiniasclerotiorumRNAvirusL,SsRV-L）与人类的戊型肝炎病毒（hepatitisEvirus）具有较近的亲缘关系，揭示了真菌病毒与人类病毒之间的进化关系。核盘菌弱毒病毒SsHV1是首次在板栗疫病菌外发现的弱毒病毒，能够使核盘菌产生严重的衰退症状。核盘菌双分病毒SsPV-S对核盘菌的表型没有显著的影响，但是SsPV-S的外壳蛋白（coatprotein）与拟南芥的吲哚乙酸-亮氨酸-抗性蛋白（indole-3-aceticacid-leucine-resistantprotein2）具有显著的相似性，首次证明了真菌病毒与植物之间具有基因水平转移。核盘菌弱毒病毒DNA病毒SsHADV-1是在真菌界中首次发现的DNA病毒，填补了真菌病毒分类上的一项空白，并且该病毒能够引起核盘菌严重的衰退症状，在生物防治上具有潜在的应用价值（Yuetal.,2010,2013）。9 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文1.7真菌病毒利用的困难与策略1.7.1真菌病毒的寄主范围多数重要的人、动物以及植物的病毒，具有比较广泛的寄主范围，能够在传播介体中进行有效地复制和繁殖，但是对传播介体昆虫没有显著的影响，进而可以有效地传播病毒。真菌病毒的寄主范围很小，仅仅能够侵染在同一物种的不同个体或营养亲和型相同的个体（Ghabrialetal.,2009）。例如，具有弱毒特性的核盘菌DNA病毒SsHADV-1，仅仅能够侵染核盘菌属的不同种，比如小核盘菌（Sclerotiniaminor）和雪腐核盘菌（Sclerotinianivalis），然而却不能侵染核盘菌的近缘物种灰霉（B.cinerea）（Yuetal.,2010,2013）。但是线粒体病毒似乎具有比较广泛的寄主范围，灰霉（B.cinerea）线粒体病毒BcMV1与榆枯萎菌（O.novoulmi）的线粒体病毒OnuMV3b在核酸序列上具有95%的相似性（Wuetal.,2010）；草币斑病菌（S.homoeocarpa）中发现的一个线粒体病毒已经鉴定为榆枯萎菌OnuMV3a（Dengetal.,2003），然而这些不同物种发现的这些线粒体病毒可能与线粒体遗传物质的高度保守性有关。在室内条件下，我们可以利用转染技术为真菌病毒创造新的寄主，例如，利用反向遗传学的方法，板栗疫病菌的CHV1的全长cDNA能够侵染不同属的苹果黑腐病菌（V.ceratosperma）（Sasakietal.,2002）；紫纹羽病菌中具有病毒粒子结构的真菌病毒RnPV1、RnPV2、RnMRV1在PEG介导的作用下，能够侵染板栗疫病菌、苹果黑腐病菌以及炭疽菌（Glomerellacingulata）（Chibaetal.,2013;McFaddenetal.,1983;Salaipethetal.,2013）；镰刀菌中的病毒FgV1能够侵染板栗疫病菌以及镰刀菌中不同的种（Leeetal.,2012）。这些方法对于拓展真菌病毒的寄主范围和利用真菌病毒是一种重要的实践和探索。1.7.2营养体不亲和与真菌病毒传播真菌病毒的垂直传播主要是通过无性孢子，而真菌的有性孢子往往不携带病毒或带毒率很低（McFaddenetal.,1983;Tuomivirtaetal.,2009），真菌病毒的水平传播主要是通过菌丝融合。营养体不亲和性的菌株菌丝接触时会诱导细胞的程序性坏死（PCD），因此营养体不亲和严重限制了真菌病毒的有效传播。Ikeda等2013年发现含有Zn的化合物能够减弱紫纹羽病菌的营养不亲和性反应，提高真菌病毒的水平传播效率。Choi等2012年通过比较基因组学的方法在板栗疫病菌中鉴定了7个与营养体不亲和有关的基因（vic1-7），这些基因具有多态性，敲除vic2、vic6、vic7均能提高CHV1的传播效率。Hutchison等2005年在粗糙脉孢霉中发现活性氧ROS、磷脂10 核盘菌新型RNA病毒研究2+酰肌醇、Ca信号通路均与营养体不亲和有关。因此，可以通过沉默或敲除与营养体不亲和性有关的基因，降低不同营养体不亲和群体之间的不亲和反应，来提高真菌病毒水平传播效率。但是Brusini等2013年发现，CHV1在不同营养体亲和型的菌株之间传播效率与环境有关，田间的传播效率远高于室内的传播效率。Yaegashi等2013年发现在田间条件下，不携带病毒的菌株能够从营养体不亲和的带毒菌株中获得N10dsRNA元件，具体的原因还不清楚，Xie等2014提出了一个解释，认为在田间环境下，板栗疫病菌周围的植物和微生物的防卫反应会减弱板栗疫病菌的营养不亲和性反应，同时也会影响板栗疫病菌抵抗病毒侵染的能力。另外，病毒的特性也会影响病毒在不同营养体亲和型的菌株之间传播，高毒力的CHV1比低毒力的CHV1具有更强的传播能力（Bryneretal.,2012）。SsHADV-1的病毒粒子能够直接侵染没有伤口的核盘菌菌株（Yuetal.,2013）。因此，还需要进一步发掘具有高毒力的真菌病毒资源，能够增强病毒的传播效率，增大应用的潜力和价值。1.7.3真菌病毒体外传播和传播介体传统意义上认为，真菌病毒没有体外传播途径。但是随着真菌病毒的报道，真菌病毒在数量和种类上具有丰富的多样性，而传统的理论很难解释这一现象。Urayama等2010年发现MoCV1的病毒粒子可以释放到发酵液中，用含有MoCV1病毒粒子的发酵液来培养不携带病毒的稻瘟菌菌株时，MoCV1能够侵染不携带病毒的稻瘟菌菌株。SsHADV-1的病毒粒子在PDA培养基上能够主动侵染健康的菌丝，甚至在植物叶片上也能够侵染核盘菌（Yuetal.,2013）。尽管具体的机制还有不清楚，但是我们可以发现，真菌病毒的水平传播不仅仅只有菌丝融合这一方式。Xie等2014年发现取食真菌的昆虫可能能够作为介体传播SsHADV-1，引发了人们对真菌病毒传播介体的探索和尝试，但是考虑到真菌这一低等真核生物的特殊性，真菌病毒的传播介体可能与经典的昆虫传播病毒的方式有很大的区别。1.8研究目的与意义研究目的：本研究以植物病原真菌核盘菌为研究对象，通过大量分离和筛选来自湖南省和安徽省核盘菌菌核，从中寻找真菌病毒资源，试图解决以下几个问题：（1）探讨核盘菌真菌病毒的多样性；（2）探讨核盘菌与真菌病毒的互作；（3）探讨真菌病毒的进化关系和起源；（4）筛选具有生防潜力的真菌病毒，为利用真菌病毒来控制核盘菌引起的菌核病提11 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文供生防资源。研究意义：（1）本研究发现核盘菌中具有丰富的真菌病毒资源，包括+ssRNA病毒、-ssRNA病毒、dsRNA病毒以及DNA病毒，极大地丰富了真菌病毒的多样性，有利于真菌病毒的分类和进化研究，促进了病毒学的发展；（2）本研究通过筛选具有弱毒特性的菌株，为利用真菌病毒作为生防因子控制核盘菌提供了病毒资源。（3）本研究为探讨真菌RNA病毒与寄主互作提供了材料和模型。12 核盘菌新型RNA病毒研究第二章核盘菌菌株分离与筛选2.1引言真菌病毒在真菌界中广泛存在，已知大部分真菌病毒是一种潜伏侵染，对寄主真菌的表型没有显著的影响（GhabrialandSuzuki,2009）。能够减弱植物病原真菌致病力的病毒是比较少的，而且是很有意义的。由植物病原真菌所引起的病害不仅显著影响着整个生态系统，而且给作物生产造成严重的经济损失。利用真菌病毒控制真菌病害，即以病原物控制病原物的策略，能够消除大量化学农药的应用引起的抗药性风险以及所带来的生态危害，而且对于有效控制病害也是一种大胆的尝试和探索。例如，用弱毒病毒CHV1控制板栗疫菌在欧洲取得了显著的防效，为利用真菌病毒控制真菌病害提供了一个成功的案例（Nuss,1992）。早在1992年，Boland就报道核盘菌的弱毒特性与dsRNA有关，并且这种弱毒特性可以通过对峙培养进行传播（Boland,1992）。Boland在2004年发现核盘菌的真菌病毒Mitovirus、Hypovirus以及一个卫星RNA（satelliteRNA）引起了核盘菌的弱毒特性（Boland,2004）。2006年Xie在核盘菌中报道了一个正单链RNA（+ssRNA）病毒SsDRV引起的核盘菌衰退症状和弱毒特性（Xieetal.,2006）。由此可见，核盘菌中的真菌病毒同样具有普遍性和多样性，寻找和挖掘具有弱毒特性的病毒资源，对于防治和控制由核盘菌引起的作物菌核病具有重要的应用价值。本章内容正是基于以上基础，从湖南省和安徽省采集了约2000份核盘菌菌核样品，在室内条件下进行菌株的分离、培养、形态观察以及致病力测定，从中筛选菌落形态异常、生长缓慢、致病力下降的菌株。分别提取各个菌株的dsRNA和DNA，从中寻找可能含有真菌病毒的菌株，筛选出具有生物防治潜力的病毒资源。2.2试验材料试验所用的核盘菌菌核分别于2009年采集自湖南省和安徽省，其中湖南省总计菌核样品数量为1023份，采集地点主要集中于常德市、岳阳市、益阳市三个地区（表2.1）；安徽省总计菌核数量为944份，分别采集自巢湖市、芜湖市、合肥市、滁州市、六安市、蚌埠市、安庆市等7个地区（表2.2）。13 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文表2.1湖南省菌核样品采集地点和数量Table2.1ThecollectionsitesandnumbersofsclerotiasamplesfromHunanprovince采集地点菌核数量统计安乡县162鼎城区48汉寿县27津市47澧县47临澧县63常德市502石门县47桃源县26武陵区20西洞庭13云溪区2华容县40君山区32临湘市36汨罗市15平江县19岳阳市屈原管理区6285湘阴县36岳阳楼区8岳阳县65云溪区22资阳区6大通湖区24赫山区38南县39益阳市236桃江县40沅江市68资阳区27共计102314 核盘菌新型RNA病毒研究图2.1湖南省菌核样品的地理位置分布湖南省菌核样品采集地点Fig.2.1ThegeographicdistributionsofsclerotiasamplescollectedfromHunanprovinceThecollectionsitesofsclerotiasamplesinthemapofHunanprovince15 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文表2.2安徽省菌核样品采集地点和数量Table2.1ThecollectionsitesandnumbersofsclerotiasamplesfromAnhuiprovince采集地点菌核数量统计巢湖市无为县8080芜湖市繁昌县8383肥东县141合肥市长丰县29277合肥市107蚌埠市怀远县9090安庆市桐城市189280枞阳县91六安市寿县8989滁州市天长市4545共计944图2.2安徽省菌核样品的地理位置分布安徽省菌核样品采集地点Fig.2.2ThegeographicdistributionsofsclerotiasamplescollectedfromAnhuiprovinceThecollectionsitesofsclerotiasamplesinthemapofAnhuiprovince16 核盘菌新型RNA病毒研究2.3试验方法2.3.1核盘菌菌株分离具体方法参见于晓（2013）博士学位论文。2.3.2致病力测定具体方法参见于晓（2013）博士论文，略有改动。供试菌株在PDA培养基上进行培养活化后，用酒精灯烧过的直径5mm的打孔器打取菌落的边缘，接种于新鲜的无损伤的油菜叶片，有菌丝的一面接触油菜叶片，设3-5个重复，在20℃培养室中进行培养，48-72h后观察油菜叶片发病情况，统计病斑大小，采用十字交叉法测量病斑的直径。2.3.3菌落形态观察在直径6cm的培养皿中加入10ml的PDA，待PDA冷却凝固后，用酒精灯烧过的直径5mm的打孔器打取经活化的供试菌株的菌落边缘，接种到PDA上，设3-5个重复，20℃培养，7-10d后观察菌落形态。2.3.4DNA提取DNA提取采用CTAB法，具体方法参见于晓（2013）博士学位论文。2.3.5dsRNA提取dsRNA提取采用纤维素粉提取法，具体方法参见刘慧泉（2011）博士学位论文。2.3.6核酸电泳用1%的琼脂糖凝胶在0.05×TBE电泳缓冲液中进行电泳，于0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色后，成像观察。2.3.7核盘菌DNA病毒SsHADV-1检测所用的引物为，LIR-RF65：5-CCAGGGACGGGGACACTT-3，LIR-FP83：5-CCCAGAGACTCAAAGGGACAAC-3，引物的浓度为10pmol/μl，预期大小为2160bp。将提取的DNA样品用ddH2O稀释50-100倍，取1μl作为模板。PCR所用的体系为25μl，10×PCRbuffer2.5μl（TaKaRa），dNTP（10mmoleach）0.5μl，引17 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文物LIR-RF65（10pmol/μl）1μl，引物LIR-FP83（10pmol/μl）1μl，TaqDNA聚合酶2U（宝生物，大连），ddH2O补充至25μl。退火温度58℃，循环数30个。2.3.8用DNaseI处理dsRNA样品试验所需要的酶：DNaseI（5U/μl,TaKaRa）；RNA抑制剂RRI（5U/μl,TaKaRa）反应体系，10μl：10×DNaseIbuffer1μl，DNaseI0.2μl，RRI0.2μl，dsRNAsolution5μl，DEPC-treatedwater3.6μl。37℃水浴30min，加入1.5μl10×loadingbuffer，进行琼脂糖凝胶电泳。2.4结果与分析2.4.1分离得到的菌株表型从两个省份采集来的菌核中共分离异常菌株38株，其中湖南省的有29株，安徽省的有9株。从菌落形态的表型可以分为以下几种类型（菌株Ep-1PNA367作为对照）：（I）在培养过程中恢复正常表型的菌株有7株，见图2.3；图2.3第一类菌落形态（20℃，10d）Fig.2.3Colonymorphologyofthefirsttypestrains(20℃,10d)18 核盘菌新型RNA病毒研究（II）菌落正常，但不产生菌核的菌株有9株，见图2.4；图2.4第二类菌落形态（20℃，10d）Fig.2.4Colonymorphologyofthesecondtypestrains(20℃,10d)（III）菌落异常，不产生菌核的菌株有13株，见图2.5；图2.5第三类菌落形态（20℃，10d）Fig.2.5Colonymorphologyofthethirdtypestrains(20℃,10d)19 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文（IV）菌落异常，产少量菌核的菌株有9株，见图2.6。图2.6第四类菌落形态（20℃，10d）Fig.2.6Colonymorphologyoftheforthtypestrains(20℃,10d)2.4.2致病力测定对其中的28个菌株进行了致病力测定，结果表明，3株菌株AH836、AH503、AH26尽管能够产生明显病斑，但是相对于对照菌株Ep-1PNA367，病斑显著减小（图2.7）；25个菌株不能够产生明显的病斑，几乎完全失去了致病力，表现出了显著的弱毒特性（图2.7）。图2.7致病力测定采用离体油菜叶片（20℃，3d）Fig.2.7Virulencetestondetachedleavesofrapeseed(20℃,3d)20 核盘菌新型RNA病毒研究2.4.3DNA电泳检测通过CTAB法提取以上菌株的DNA，发现多数菌株除含有基因组DNA外，还含有多余的DNA片段，推测片段大小为1-9Kbp不等，可能为DNA病毒。可能含有DNA病毒的菌株有HN339-1、HN238-1、HN444、HN370-3、HN439-1、HN210-2、HN83-1、HN433、HN339-5，共计11个菌株，全部来自湖南省。图2.8DNA琼脂糖凝胶电泳凝胶浓度为1%，EB染色；M，λDNA/HindIII分子量标记（TaKaRa）Fig.2.8TheDNAsampleswereseparatedon1%agarosegelandstainedwithethidiumbromide.LaneM,λDNAmarkerdigestedwithHindIII（TaKaRa）2.4.4真菌DNA病毒SsHADV-1检测为了检测可能含有DNA病毒的菌株中是否含有SsHADV-1，用特异性引物进行PCR扩增，同时用Ep-1PNA367和含有SsHADV-1的菌株DT-8分别作为阴性对照和阳性对照，发现多数菌株均能得到特异性的SsHADV-1的PCR扩增片段，其中包括安徽省的菌株4株，分别是AH139、AH493、AH503、AH836，湖南省的菌株8株，分别是HN83-1、HN238-1、HN439-1、HN370-3、HN210-2、HN433、HN112-2、HN444。因此核盘菌DNA病毒SsHADV-1在湖南省和安徽省分布很广泛。图2.9SsHADV-1PCR检测-ck，阴性对照菌株为Ep-1PNA367；+ck，阳性对照菌株为DT-8；M，DNA分子标量DL5000Fig.2.9PCRdetectionforSsHADV-1StrainEp-1PNA367wasusedasthenegativecontrol;strainDT-8wasusedasthepositivecontrol;M,theDNAmarkerDL5000(TaKaRa)21 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文2.4.5dsRNA电泳检测提取异常菌株的dsRNA进行电泳，发现多数菌株除含有基因组DNA外，还有额外的核酸片段，DNaseI消化后电泳发现，菌株HN3、HN138、HN724含有一条大小约7Kbp的dsRNA片段，很可能是RNA病毒，另外据此推定HN286-1、HN465也含有类似大小的dsRNA片段。因此，菌株HN3、HN138、HN286-1、HN465、HN724可能含有RNA病毒，同时DNaseI处理试验表明，菌株HN138和HN465还可能含有DNA病毒。图2.10dsRNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为1%，EB染色；M为λDNA/HindIII分子量标记Fig.2.10ThedsRNApreparationswereseparatedon1%agarosegelandstainedwithethidiumbromide.LaneM,λDNAmarkerdigestedwithHindIII(TaKaRa).A，dsRNA提取样品直接进行电泳；B，dsRNA样品经过DNaseI消化后进行电泳A,dsRNApreparationswithnotreatment;B,dsRNApreparationsdigestedwithDNaseI2.4.6异常菌株信息汇总其中可能含有DNA病毒的菌株有HN83-1、HN138、HN210-2、HN238-1、HN370-3、HN433、HN439-1、HN444、HN465，共计9个菌株；可能含有RNA病毒的菌株有AH724、HN3、HN138、HN286-1、HN465，共计5个菌株；既含有DNA病毒又含有RNA病毒的菌株有HN138、HN465；含有SsHADV-1的菌株有AH139、AH493、AH503、AH836、HN83-1、HN210-2、HN238-1、HN370-3、HN433、HN439、HN444，共计11个菌株。22 核盘菌新型RNA病毒研究表2.3异常菌株信息汇总Table2.3Theinformationofabnormalstrains编号是否含有DNA是否含有是否含有致病力采集地点病毒RNA病毒SsHADV-1AH6不详不详不详无安徽省巢湖市AH26不详不详不详弱安徽省合肥市AH28不详不详不详不详安徽省合肥市AH56不详不详不详不详安徽省巢湖市AH98不详不详不详无安徽省肥东县AH139不详不详是不详安徽省肥东县AH493不详不详是弱安徽省芜湖市AH503不详不详是弱安徽省芜湖市AH724不详是不详无安徽省桐城市AH836不详不详是弱安徽省合肥市HN3不详是不详无湖南省岳阳市资阳区HN83-1是不详是无湖南省湘阴县HN105-2不详不详不详无湖南省岳阳市岳阳县HN109-2不详不详不详弱湖南省岳阳市岳阳县HN118-1不详不详不详不详湖南省岳阳市华容县HN119-2不详不详不详不详湖南省岳阳市湘阴县HN138是是不详无湖南省常德市安乡县HN144-3不详不详不详无湖南省常德市安乡县HN210-2是不详是无湖南省常德市澧县HN212-2不详不详不详不详湖南省常德市澧县HN238-1是不详是无湖南省益阳市南县HN269-1不详不详不详无湖南省益阳市南县HN286-1不详是不详弱湖南省常德市临澧县HN299-2不详不详不详不详湖南省常德市安乡县HN314不详不详不详无湖南省常德市临澧县HN315不详不详不详无湖南省常德市临澧县HN339-2不详不详不详无湖南省常德市武陵区HN339-5不详不详不详无湖南省常德市武陵区HN359不详不详不详不详湖南省益阳市大通湖区HN353-2不详不详不详弱湖南省常德市鼎城区HN370-3是不详是无湖南省湖南省汉寿县HN433是不详是无湖南省益阳市沅江市HN439-1是不详是不详湖南省益阳市沅江市HN444是不详是无湖南省益阳市沅江市HN465是是不详不详湖南省常德市安乡县HN473-1不详不详不详不详湖南省益阳市南县HN474-1不详不详不详不详湖南省常德市石门县HN474-3不详不详不详弱湖南省常德市石门县23 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文菌落表型异常，但是没有提取到DNA或RNA病毒的菌株有AH6、AH26、AH28、AH56、AH98、HN105-2、HN109-2、HN118-1、HN119-2、HN144-3、HN212-2、HN269-1、HN299-2、HN314、HN315、HN339-2、HN339-5、HN353-2、HN359、HN473-1、HN474-1、HN474-3，共计22个菌株。已经测定致病力的菌株，其致病力均减弱或完全丧失，表现出典型的弱毒特性。2.5讨论从分离结果来看，湖南省分离得到表型异常的菌株共29株，占分离总数（1023）的2.8%，安徽省分离得到表型异常的菌株有9株，占分离总数（944）的0.9%，而且菌落的表型具有丰富的多样性。这些表型异常的菌株中，湖南省菌株中含有DNA或dsRNA片段的有13个，安徽省菌株中有5个，因此湖南省的核盘菌菌株带毒率比安徽省要高，而且病毒资源更丰富。这也可能是真菌DNA病毒SsHADV-1首先在湖南省分离得到的菌株中发现的原因。另外，还有多数菌株（22株）既没有发现DNA片段，也没有发现dsRNA片段，但是表现出典型的衰退症状和弱毒特性。推测可能的原因：一是这些菌株本身在复制和繁殖过程中出现错误，或受到环境因素的影响出现了遗传缺陷，但是这种可能性很小，因为这些菌株占所有菌株（1967株）的1.1%，在自然条件下，真核生物中这么高的遗传变异不可能存在；二是病毒的复制和积累量可能比较少，因此在DNA或dsRNA提取过程中用常规的方法检测不到，特别是单链RNA病毒，因为单链RNA病毒在整个生命阶段多数以单链RNA形式存在，只有在复制的过程中才会出现dsRNA，即复制形态的dsRNA，用普通的dsRNA提取方法可能很难得到足够多的dsRNA；三是一些病毒可能具有比较大的基因组，比如巨型DNA病毒，这些病毒的DNA很可能与寄主的DNA混在一起，用常规的琼脂糖凝胶电泳无法分离，因此也就观察不到这些病毒的存在。在分离得到的菌株中发现多数异常的菌株含有1条以上的DNA片段（图2.8,2.10），这些DNA片段很可能就是DNA病毒。根据之前已经发现的核盘菌DNA病毒SsHADV-1的序列，PCR检测发现这些菌株中确实含有SsHADV-1（图2.9），因此SsHADV-1在湖南省和安徽省分布很广泛。SsHADV-1是单链环状DNA病毒，可能具有超螺旋、环状或线性三种形式，同时还含有缺陷型DNA（Yuetal.,2010），由于三种形式迁移率不同，因此可能会出现3种以上的带型。但是根据DNA提取电泳结果发现，这些含有DNA片段的菌株经常观察到一条5Kbp左右的DNA片段（图2.8，2.10），这一片段在SsHADV-1的相关文章中很少出现，这一DNA片段是超螺旋构象的SsHADV-1基因组还是未知的DNA病毒，尚缺乏足够的证据。根24 核盘菌新型RNA病毒研究据分离试验结果推测，核盘菌中应该不止SsHADV-1这一种DNA病毒，还需要将来不断的挖掘和探索。如上所述，多数真菌病毒的侵染是一种隐性侵染，并不引起寄主表型的改变。因此根据菌落表型的筛选标准势必会遗漏很多对核盘菌影响不明显的病毒，尽管这些病毒可能没有很大的生物防治价值，但是对于病毒的复制、分类和进化，甚至整个病毒学的发展具有重要的意义。例如，Liu等2009年首次报道了真菌病毒SsRV-L与脊椎动物的戊型肝炎病毒具有较近的亲缘关系，表明真菌病毒具有古老的起源；真菌病毒SsMV-L能够与亲缘关系非常疏远的dsRNA病毒类群间发生基因水平转移事件，有助于揭示dsRNA病毒宏观进化的分子机制（Liuetal.,2012）；而对SsPV-S的研究发现真菌病毒还可能与植物发生基因水平转移（Liuetal.,2011）；Chiba等2013年报道了双分病毒RnPV2的一缺陷型RNA能够干扰RnPV2的复制和积累，进而引起寄主表型的变化，但是RnPV2对其自然寄主表型没有明显影响（Chibaetal.2013）。25 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文第三章单股负义链RNA病毒SsNSRV-1分子特性及生物学特性研究3.1引言真菌病毒根据核酸性质可以分为RNA病毒和DNA病毒（Yuetal.,2010），RNA病毒主要包括dsRNA病毒和正单链RNA（+ssRNA）病毒，而负单链RNA（-ssRNA）病毒在真菌中还没有报道。Kondo等2013年利用电子克隆在真菌中找到-ssRNA存在的证据，而且在SclerotiniahomoeocarpaRNA-Seq的数据库中发现可能现存的-ssRNA病毒。但是，关于-ssRNA病毒在真菌中是否真实存在及其相关的特性还是未知的。本章内容在前期研究基础上，筛选到了一株表型异常、不产菌核且致病力丧失的弱毒菌株AH98，序列克隆和分析发现该菌株感染了核盘菌弱毒病毒1（SsHV1）和一个新的-ssRNA病毒，命名为Sclerotiniasclerotiorumnegative-strandedRNAvirus1(SsNSRV-1)，它与单股负义链RNA病毒目（Mononegvirales）成员有较近的亲缘关系。单股负义链RNA病毒（Mononegaviruses）具有单节段的负义链RNA基因组，大小为8.9-19Kb。有病毒粒子结构，且病毒粒子具有包膜结构，形态多变。目前包括5个科，即博尔纳病毒科（Bornaviridae）、线状病毒科（Filoviridae）、副粘液病毒科（Paramyxoviridae）、弹状病毒科（Rhabdoviridae）和新成立的Nyamiviridae。该病毒目的成员多数感染人和脊椎动物，包括埃博拉病毒（Ebolavirus）、狂犬病病毒（Rabiesvirus）、麻疹病毒（Measlesvirus）等高致死率的病毒，少数的单股负义链RNA病毒也能够侵染植物和线虫（Jacksonetal.,2005;Bekaletal.,2011）。本章就SsNSRV-1的分子特性、生物学特性、病毒粒子结构与形态、进化地位和转录分析等方面展开相关的研究与分析。3.2试验材料相关菌株采集地点采集时间AH98安徽省肥东县梁园镇2009Ep-1PN黑龙江省佳木斯市（弱毒）1996Ep-1PNA367Ep-1PN的子囊孢子后代（强毒）HB659湖北省武穴市2010HB03-06湖北省黄冈市2010XZS52江西省樟树市2011JXYX7江西省永修县2011SX10-924陕西省汉阴市2009HLJ-048黑龙江省五常市201026 核盘菌新型RNA病毒研究3.3试验方法3.3.1生物学特性3.3.1.1菌株分离核盘菌菌株分离参见于晓（2013）博士学位论文。3.3.1.2致病力、生长速度及菌落形态观察致病力测定参见2.3.2。生长速度测定参见于晓（2013）博士学位论文。菌落形态观察：菌株活化，培养与生长速度测定的方法相同。3.3.1.3菌丝形态观察菌株活化参见生长速度测定，将活化好的菌株用直径0.5cm的打孔器打取菌丝块，接种在PDA平板上（每皿10ml），20℃恒温条件下培养2d，直接在光学显微镜下进行菌丝尖端形态的观察，选取10个以上的位置进行拍照记录，然后统计比较菌丝尖端形态的差异。3.3.1.4菌丝鲜重测定及产酸量测定将相关菌株活化后，用直径0.5cm的打孔器打取菌丝块，置于装有100mlPDB的三角瓶中培养，每瓶接种5个菌丝块，设5个重复，20℃恒温条件下震荡培养6d，通过离心收集菌丝体，称重，通过pH测定仪来测定上清液的pH值，以此来对比各菌株产酸量的差异。3.3.2SsNSRV-1全长cDNA克隆3.3.2.1dsRNA提取dsRNA提取参见刘慧泉（2011）博士学位论文。3.3.2.2总RNA提取总RNA的提取参见肖雪琼（2013）博士学位论文。3.3.2.3SsNSRV-1序列克隆对于未知的dsRNA片段，用随机引物法克隆得到部分序列，然后经过RT-PCR克27 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文隆已知序列之间的未知序列，具体过程如下：（1）提取的dsRNA样品经过DNaseI处理后，用DEPC处理的ddH2O定容至600μl，用等体积的氯仿进行抽提，取500μl上清液，加入5μl的核酸助沉剂（Bioteke），50μl3M的NaAc（pH5.2），1000μl的无水乙醇，-20℃沉淀30min以上，重新离心收集沉淀。（2）随机引物克隆需要的引物RACE3RT：5’-CGATCGATCATGATGCAATGCNNNNNN-3’RACE3：5’-CGATCGATCATGATGCAATGC-3’（3）第一链cDNA合成，体系25μl：dsRNA，200ng；RACE3RT(30pmol/μl)，2μl；DMSO，2μl；DEPC处理的水定容至16.5μl，95℃，3min，立即冰浴5min；然后加入5×Reactionbuffer，5μl；dNTP(10mmoleach，TaKaRa)，2μl；RRI(40U/μl,TaKaRa)，0.5μl；M-MLVReverseTranscriptase(200U/μl)，1μl；25℃，10min；42℃，50min；50℃，10min；65℃，5min。（4）第二链cDNA合成在第一链cDNA合成的基础上，加入1MNaOH，2.5μl，70℃，20min；再加入1MHCl，2.5μl，1MTris-HCl(pH7.5)，2.5μl，65℃，30min；后再加入DNA回收试剂盒（Axygen）中bufferA，100μl，BufferB，50μl，按照回收试剂盒说明书进行回收纯化，最后加入40μlEluent进行溶解。（5）PCR扩增反应体系30μl：10×Reactionbuffer(TaKaRa)，3μl；dNTP(2.5mmoleach)，1μl；RACE3(10pmol/μl)，2μl；ThesecondcDNA，2μl；TaqDNApolymerase(5U/μl)，0.5μl；ddH2O，21.5μl。PCR程序：72℃，5min；95℃，3min；28 核盘菌新型RNA病毒研究95℃，30sec；58℃，30sec；72℃，90sec；30个循环；72℃，10min；16℃，2min。（6）DNA回收、连接、转化与测序PCR产物电泳：PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，电压和时间视具体情况而定，一般6V/cm，30min-60min，在紫外灯下将目标片段切下来。DNA回收：将切好的胶块称重，按1:3的比例（g/ml）加入bufferA，72℃将胶块完全溶解，然后就进行DNA回收，具体回收过程见回收试剂盒说明书（Axygen）。DNA连接：检测回收DNA的浓度，进行连接反应，连接反应体系如下：10×T4DNAligasebuffer，1μl；T4DNAligase(350U/μl)，1μl；pMD19-Tvector(TaKaRa)，0.5μl；PCRproduct，7.5μl，16℃水浴1-10h。大肠杆菌感受态制备：将保存的大肠杆菌菌株Top10进行划线培养，挑取单菌落于20ml液体LB中在37℃摇床中进行震荡培养10-12h，按照1:15-30的比例进行扩大培养，一般2-3h，离心收集菌体，按照大肠杆菌制备试剂盒（TaKaRa）说明书进行感受态的制备。DNA连接产物的热击转化：将大肠杆菌感受态置于冰上进行溶解，加入到连接产物中，冰浴30min，再42℃，50sec热击后，立即置于冰上2min，加入400μl的SOC于37℃进行震荡培养1h，将菌液均匀涂于加入具有氨苄抗青霉素性的固体LB培养基上，37℃，10-15h。大肠杆菌单菌落挑取及验证：将培养好的单菌落用灭菌的牙签挑取，置于装有500μl液体LB（氨苄抗性）的1.5ml离心管中，于37℃进行震荡培养10h后，进行PCR检测，选取插入DNA片段在500bp以上的阳性克隆进行测序。DNA测序交由天一辉远公司完成。3.3.2.4SsNSRV-1序列末端克隆SsNSRV-1的dsRNA形式积累量很少，故该病毒的末端序列克隆采用了单链RNA的末端克隆，具体方法如下：（1）SsNSRV-1病毒粒子RNA（vRNA）提取：(SsNSRV-1病毒粒子提取参见3.3.4)①将提取的病毒粒子溶液用等体积的Tris-饱和酚（pH8.0），剧烈震荡，静置3min；4℃，12000rpm离心10min；②取上清，加入等体积的氯仿，剧烈震荡，静置3min；4℃，12000rpm离心10min；③取上清，加入5μl核酸助沉剂，0.1倍体积的3MNaAc（pH5.2），2倍体积的无29 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文水乙醇，-20℃沉淀30min；④4℃，12000rpm离心15min；⑤弃上清，加入1ml70%（V/V）的乙醇，将沉淀弹起，4℃，12000rpm离心3min；重复以上步骤；⑥弃上清，瞬时离心，用枪头吸取上清液，37℃，5min；⑦加入适量的DEPC处理的ddH2O，-20℃保存备用。（2）vRNA性质的验证（即证明vRNA是dsRNA还是ssRNA）SsNSRV-1的vRNA和总RNA各取1μg和3μg，用10U的SI核酸酶进行处理，处理后的样品进行cDNA的合成，分别用SsNSRV-1特异性的引物进行PCR扩增，电泳检测PCR结果。（3）克隆末端所需要的引物接头：PC3-T7loop，5’-p-GGATCCCGGGAATTCGGTAATACGACTCACTATATTTTTATAGTGAGTCGTATTA-OH-3’（注意：该接头5’-端需磷酸化）（1OD260相当于33μg）；PCR引物：PC2，5’-CCGAATTCCCGGGATCC-3’(该引物含有EcoRI、SmaI/XmaI和BamHI酶切位点，可通过酶切连接其它载体)（Potgieteretal.,2009）；以及病毒序列的特异性引物在已知序列的5’和3’端分别设计两条巢氏引物引物。（4）加接头连接反应：RNAs，至少200ng；PC3-T7loop（30pmol/μl），1μl；用ddH2O补至15μl，70℃，5min，立即冰浴，5min；依次加入，10×T4RNAbuffer，5μl；PEG6000（W/V），25μl；0.1%BSA，3μl；RRI（40U/μl），1μl；T4RNAligase（40U/μl，TaKaRa），1μl；4-16℃连接16-24h。（5）加完接头后的vRNA处理：连接产物用ddH2O补充至600μl，用等体积的氯仿进行抽提；4℃，12000rpm离心10min；取上清，加入5μl核酸助沉剂，0.1倍体积的3MNaAc（pH5.2），2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min；4℃，12000rpm离心15min；弃上清，加入1ml70%（V/V）的乙醇，将沉淀弹起，4℃，12000rpm离心3min；30 核盘菌新型RNA病毒研究重复以上步骤；弃上清，瞬时离心，用枪头吸取上清液，37℃，5min；加入适量的DEPC处理过的ddH2O，溶解沉淀。（6）反转录加完接头的vRNA6mer随机引物（30pmol/μl），1μl；DEPC处理的ddH2O补至16.5μl，70℃5min，立即冰浴，5min；依次加入，5×Reactionbuffer，5μl；dNTP(10mmoleach，TaKaRa)，2μl；RRI(40U/μl,TaKaRa)，0.5μl；M-MuLVReverseTranscriptase(200U/μl，Promega)，1μl；25℃，10min；42℃，50min；50℃，10min；65℃，5min。取1μl合成好的cDNA作为PCR的底物，用病毒的特异性引物与PC2进行PCR反应，最好用LATaq酶（TaKaRa），可以提高PCR的效率，剩余的cDNA保存于-20℃备用。3.3.2.5SsNSRV-1缺陷型RNAs克隆（1）病毒粒子提取和vRNA制备同3.3.2.4；（2）SsNSRV-13’末端进行poly(A)修饰，反应体系如下：vRNA，17.5μl；10×poly(A)buffer，5μl；MnCl2（25mM），5μl；DTT（10mM），5μl；0.1%BSA，10μl；ATP（10mM），5μl；Poly(A)polymerase（TaKaRa），2.5μl；RRI（40U/μl），1μl，37℃水浴1h。（3）poly（A）标记后的vRNA处理poly（A）标记后的vRNA要进行纯化，同3.3.2.4加完接头的vRNA处理；（4）poly（A）修饰的vRNA进行环化poly（A）修饰的vRNA在T4RNA连接酶的作用下进行环化，具体环化的过程参见3.3.2.4加接头反应，不需要加引物PC3-T7loop；31 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文（5）环化的vRNA纯化以及cDNA合成参见3.3.2.4（5）和（6）；（6）PCR需要用巢氏PCR扩增病毒的末端序列，至少需要扩增两轮反应。3.3.3SsNSRV-1基因的表达模式3.3.3.1含有Poly(A)的RNA分离与富集为了提高克隆SsNSRV-1每个基因5’和3’RACE的效率，需要将含有poly（A）的RNA进行纯化和富集，本研究使用了poly（A）RNA纯化试剂盒DynabeadsmRNADIRECTKit（LifeTechnologies）和磁力架（LifeTechnologies），具体过程如下：①取50μg总RNA样品补RNase-free水至100µl；②充分混匀Dynabeadsoligo(dT)beads，然后取200µl到1.5ml离心管中，置于磁力架上，静置1min，用枪头小心吸取丢弃上清液（注意尽量不要吸到磁珠）；③加入200µlBindingBuffer充分涡旋混匀，瞬时离心，在磁力架上，静置1min，用枪头小心吸取丢弃上清液（注意尽量不要吸到磁珠）；④重复步骤③1次；⑤再加入100µlBindingBuffer，充分涡旋混匀，然后把步骤1中准备好的样品加入到上述Dynabeadsoligo(dT)beads中，充分涡旋混匀3–5min，65℃孵育5min，孵育结束后立刻置于冰上2min（Bindingbuffer与RNA在体积1:1时磁珠吸附效率最高）；⑥室温孵育5min，瞬时离心，在磁力架上静置1min，用枪头小心吸取丢弃上清液（注意尽量不要吸到磁珠）；⑦加入200µlWashingBuffer，涡旋混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置1min，用枪头小心吸取丢弃上清液（注意尽量不要吸到磁珠）；⑧重复步骤⑦1次；⑨加入20µl10mMTris-HCl，涡旋混匀，80℃孵育2min；⑩瞬时离心，置于磁力架上，静置1min，用枪头小心转移上清液到一个干净的1.5ml离心管中（注意尽量不要吸到磁珠）。3.3.3.2基因的3’RACE基因的3’RACE参见Bekaletal.,2011，略有改动。（1）引物：CDSIII-1:TAGAGACCGAGGCGGCCGACATGTTTTGTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTVNCDSIII-2:GACCGAGGCGGCCGACATG32 核盘菌新型RNA病毒研究CDSIII-3:CGAGGCGGCCGACATGTTT（2）具体过程：①反转录：Poly（A）RNA，200ng；CDSIII-1（30pmol），1μl；DEPC-treatedddH2O补至13.5μl，70℃，3min，立即冰浴3-5min，加入5×MMLVbuffer，4μl；dNTP（10mMeach），1μl；RRI，0.5μl；M-MuLVReverseTranscriptase(200U/μl，Promega)，1μl；42℃，50min；50℃，10min；65℃，10min终止反应。②PCR扩增基因的3’末端为保证3’末端序列的准确性，需要进行2轮PCR扩增：第一轮：取1μl合成好的cDNA进行PCR反应，所用引物为CDSIII-2/GSP1（Genespecificprimer1，基因特异性引物）；第二轮：将第一轮的PCR产物稀释20倍，取1μl用于该轮反应，所用引物为CDSⅢ-3/GSP2；将扩增得到的DNA片段进行回收纯化、连接、测序。3.3.3.3基因的5’RACE基因的5’RACE参见Scottoetal.,2006，略有改动。（1）引物：CDSIII-1:TAGAGACCGAGGCGGCCGACATGTTTTGTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTVNCDSIII-2:GACCGAGGCGGCCGACATGCDSIII-3:CGAGGCGGCCGACATGTTT（2）具体过程：①反转录：Poly(A)，RNA200ng；GSP1(10pmol)，1μl；DEPC-treatedddH2O补至13.5μl，70℃，3min，立即冰浴3-5min，加入5×MMLVbuffer，4μl；dNTP（10mMeach），1μl；RRI，0.5μl；33 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文M-MuLVReverseTranscriptase(200U/μl，Promega)，1μl；42℃，50min；50℃，10min；65℃，10min终止反应。②降解互补链中的RNA向上体系中加入10×RNaseHbuffer2.2μl，RNaseH（5U/μl，ThermoScientific）0.2μl；37℃，30min，用DNA回收试剂盒（Axygen）进行纯化，加18.5μl水溶解。③cDNA末端标记，在第一链cDNA的末端进行poly（A）修饰：第一链cDNA，18.5μl；5×Tdtbuffer，6μl；dATP(20mM)，2μl；Tdt(14U/ul，TaKaRa)，0.5μl；0.1%BSA，3ul；37℃，30min；65℃，10min，加入120μlddH2O。④dsDNA合成（第一轮PCR）：10×LAbuffer，2μl；dNTP，0.5μl；GSP1，1μl；CDSIII-1（10pmol），1μl；第一链cDNA，1μl；LATaq（5U/μl，TaKaRa），0.5μl；ddH2O补至20μl。PCR程序：95℃，1.5min；95℃，30sec；58℃，30sec；72℃，2min；循环数，30；72℃，5min；16℃，2min。第二轮PCR：将第一轮的PCR产物稀释20倍，用CDSIII-2/GSP2引物扩增；第三轮PCR：将第二轮的PCR产物稀释30-50倍，用CDSIII-3/GSP3引物扩增。3.3.4SsNSRV-1病毒粒子特性3.3.4.1病毒粒子提取参考于晓（2013）博士学位论文，略有改动：①活化携带病毒的菌株，挑取菌丝块置于PDB中，20℃，进行静置培养6-8d；②挑取菌丝用蒸馏水清洗3次，取菌丝约30g左右，按照4ml/g的比例加入0.1M34 核盘菌新型RNA病毒研究的磷酸钠缓冲液（pH7.4）（缓冲液要提前放到4℃冰箱进行预冷）；③用匀浆机将菌丝打碎，倒入三角瓶中置于冰上，加入0.5%（V/V）巯基乙醇；④高速离心，12096g，30min；取上清，超速离心，110000g，4℃，1h；弃上清，收集沉淀，加入1ml0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.4），将沉淀悬浮，置于冰上；转入到1.5ml的灭菌EP管中，4℃离心10min，去除杂质，取上清，即为病毒粒子粗提液；⑤配蔗糖梯度溶液，蔗糖溶液的浓度分别是20%、25%、30%、35%、40%（W/V），共5个浓度梯度，用剪去尖端的1ml枪头从高浓度开始一滴一滴沿壁加入到12ml超速专用离心管，操作一定要缓慢，保持浓度之间的平衡，形成梯度（2ml/梯度），放置4℃冰箱备用；⑥取500μl病毒粒子粗提液轻轻加到蔗糖梯度溶液的表面，称重配平好后，50000g，4℃，3h；⑦离心完毕后，小心收集每一层蔗糖梯度溶液（约2ml），进行脱糖；⑧脱糖完毕后，加入300µl0.1M磷酸钠缓冲液，收集沉淀，即为病毒粒子提取液，可用于病毒粒子观察，结构蛋白分析。3.3.4.2病毒粒子观察将收集到的每个蔗糖梯度的病毒粒子溶液，用0.1M磷酸钠溶液稀释5倍，吸附于铜网上，2%(W/V)PTA（pH7.4）进行负染，透射电子显微镜（ModelTecnaiG220，中科院病毒所）观察病毒粒子形态。3.3.4.3PEG介导的SsNSRV-1病毒粒子转染（1）核盘菌原生质体制备参见肖雪琼（2013）博士学位论文；（2）PEG介导的病毒粒子转染原生质体参见于晓（2013）博士学位论文；（3）转染子的验证：提取转染子的总RNA，用6mer随机引物合成cDNA，再用病毒特异性引物进行PCR扩增。3.3.4.4SsNSRV-1结构蛋白SDS-PAGE电泳①所用试剂：A液丙烯酰胺储存液：30%（W/V）丙烯酰胺，0.8%（W/V）双丙烯酰胺；B液4×分离胶缓冲液：Tris-HCl（pH8.8），1.5M；SDS，0.4%（W/V）；4℃保存备用35 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文C液4×堆积胶缓冲液：Tris-HCl（pH6.8），0.5M；SDS，0.4%（W/V）；10%过硫酸铵（W/V）SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris碱25mM，甘氨酸192mM，SDS0.4%（W/V）；染色液，考马斯亮蓝R250：考马斯亮蓝R2501g，甲醇450ml，ddH2O450ml，冰醋酸100ml脱色液：甲醇100ml，冰醋酸100ml，ddH2O800ml②9%分离胶的制备（10ml）A液3ml，B液2.5ml，ddH2O4.5ml，10%过硫酸铵50μl，TEMED5μl，混匀，取8ml加入制胶模具中，然后在分离胶的表面加入1ml正丁醇，置于37℃烘箱，30min。③浓缩胶的制备（4ml）将分离胶上层的正丁醇倒掉，用ddH2O清洗2次，配制浓缩胶A液0.67ml；C液1.0ml；ddH2O2.3ml；10%过硫酸铵30μl；TEMED5μl，混匀，取2ml加到分离胶的上面，插入梳子，室温静置20min，准备蛋白样品。④蛋白样品制备：取纯化后的病毒粒子溶液30μl，加入4×loadingbuffer10μl，置于沸水中煮5min，瞬时离心。⑤电泳将制备好的凝胶置于电泳缓冲液中，轻轻拔除梳子，加入制备好的蛋白样品，盖上盖子进行电泳，开始设置电压为80V，当蛋白样品充分浓缩后（约15min），将电压调至100V，根据预期蛋白的大小设定好时间。⑥蛋白染色将电泳好的凝胶置于考马斯亮蓝R250中，染色30min。⑦蛋白脱色将染色好的凝胶从染色液中取出，先用蒸馏水洗两次，加入脱色液，轻轻震荡，每2-3h换一次脱色液，待蛋白条带明显时（约8h），成像记录。3.3.4.5SsNSRV-1结构蛋白PMF-MS鉴定（1）蛋白质胶条鉴定的实验流程：样品蛋白的提取、SDS-PAGE电泳、蛋白质胶内酶解、肽段提取和液相串联质谱(liquidchromatographycoupledwithtandemmassspectrometry，LC-MS/MS)分析。36 核盘菌新型RNA病毒研究（2）胶条具体鉴定的过程和生物信息分析由华大科技股份有限公司完成。（注：由于本研究鉴定的蛋白都是未知的蛋白，没有可供参考的数据库，因此肽段比对的数据库为自建数据库，即将病毒基因组预测的所有可能的蛋白序列建立一个数据库用来分析鉴定的肽段的信息）。3.3.5SsNSRV-1Northernblot分析（1）SsNSRV-1vRNA及相应的总RNA制备分别参见3.3.2.4和肖雪琼（2013）博士学位论文。（2）甲醛琼脂糖凝胶电泳参考分子克隆实验指南（第三版）（萨姆布鲁等，2002）略有改动：电泳缓冲液配制：10×MOPS(200ml)MOPS(MW，209.3)，0.2M(8.37g)；CH3COONa-3H2O(MW，136.08)，20mM(0.55g)；EDTANa2-2H2O(MW，372.2)，10mM(0.75g)；pH调至7.0，200ml需加5MNaOH约3.8ml。甲醛琼脂糖凝胶制备及电泳：①将所用的器具提前用0.1MNaOH处理过夜或高压灭菌1h；②量取87ml的DEPC处理过的蒸馏水，称取1.3g的琼脂糖，加热至琼脂糖完全溶解，室温放置，待冷却至50℃左右，加入10ml的10×MOPS，3ml37%的甲醛溶液，混匀，倒入制胶模具中，室温放置40min（通风厨内制备）；③上样样品制备，体系30μl：Loadingbuffer，3μl;EB(200ng/μl)，1μl;10×MOPS，3μl;甲醛，3μl；甲酰胺，15μl；RNA，5μl（30μg左右）；DEPC处理的ddH2O补充至30μl，70℃水浴5min，立即冰浴5min。④上样及电泳将10×MOPS用DEPC处理的ddH2O稀释10倍，上样前先将凝胶置于100V电压下预电泳10min，此时加电泳缓冲液至胶面为止（不要没过胶孔），然后点样，点样完毕后先用100V电压电泳10min，等样品跑出胶孔后，将电压增至150V，37 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文再电泳40min；⑤成像记录，观察电泳情况，如果28S、18SrRNA条带清晰，则准备转膜，如果模糊不清，说明RNA降解比较严重，弃之。（2）转膜参考分子克隆实验指南（第三版）（萨姆布鲁等，2002）略有改动：①将胶边缘裁剪完后，测量胶的长度和宽度，再一次成像记录；②将胶至于DEPC处理的蒸馏水浸泡30min，中间换水2-3次，除去甲醛；③将胶至于0.05MNaOH溶液中，20min；④将胶用DEPC处理的蒸馏水洗3遍，置于20×SSC中和15min；⑤搭盐桥（参照分子克隆实验指南（第三版）（萨姆布鲁等，2002））；⑥在20×SSC中转膜20h左右；⑦转膜过程完成后，将尼龙膜正面和反面均置于紫外交联仪（CX-2000UVCrossliker）2中进行紫外交联（Energy700×100μJ/cm；Time，5min），尼龙膜用保鲜膜封好，常温保存备用。（3）杂交和成像：杂交过程和成像参见杂交试剂盒说明（GEHealthcare）3.3.6序列分析和系统发育分析所用到的生物信息学软件（1）序列编辑和ORF预测使用DNAMAN5.0。（2）序列同源性搜索使用在线软件Blast程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。（3）氨基酸序列比对用在线蛋白多重比对软件Constraint-basedMultipleProteinAlignmentTool(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/)。（4）蛋白的等电点和分子量计算使用在线软件ProteinCalculator3.3（http://protcalc.sourceforge.net/）；磷酸化位点和糖基化位点预测使用在线软件NetPhos2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和NetCGlyc1.0server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCGlyc/)。（5）蛋白进化模型使用在线软件ProtTest2.4(Abascaletal.,2005)(http://darwin.uvigo.es/software/prottest_server.html)。（6）系统发育树采用最大似然法，用软件PhyML3.0（Guindonetal.,2010）生成。（7）系统发育树用MEGA5.0（Tamuraetal.,2011）进行视图化和编辑。38 核盘菌新型RNA病毒研究3.3.7菌丝超薄切片制备和电镜观察（1）相关菌株培养时间分别为2d、3d、4d、5d和6d。（2）菌丝超薄切片制备参见肖雪琼（2013）博士学位论文。（3）电镜观察将样品用2%(W/V)PTA（pH7.4）进行负染，用透射电子显微镜（ModelTecnaiG220，中科院病毒所）观察菌丝内部结构及病毒粒子形态。3.3.8SsNSRV-1自然分布检测分别收集从黑龙江省、江西省、湖北省、安徽省和陕西省分离的核盘菌菌株共50株，提取这些菌株的总RNA，用6mer随机引物进行cDNA合成，SsNSRV-1的特异性引物进行PCR检测。3.4结果与分析3.4.1核盘菌菌株AH98生物学特性核盘菌菌株AH98于2009年采自安徽省肥东县梁园镇，和强毒力的菌株Ep-1PNA367相比，该菌株表现出明显的弱毒特性。菌落表型比较发现，AH98有明显的扇变，有较多的白色气生菌丝产生，不产生菌核（图3.1A）；生长速度比较发现，AH98的生长速度约为0.7cm/d，显著低于强毒菌株Ep-1PNA367的生长速度（约为2.3cm/d），并且AH98的误差线明显比Ep-1PNA367的大（图3.1D），说明AH98的生长速度是不均匀的，即有时生长快一些，有时生长慢一些，因此形成了“轮纹状”的菌落形态（图3.1A），同时AH98的菌丝鲜重显著低于Ep-1PNA367（图3.1E）说明菌株AH98的生物学产量明显减少；致病力比较发现，在室内条件下，菌株AH98在离体的油菜叶片上几乎不发病，丧失了致病力（图3.1C），而在产酸能力上，菌株AH98发酵液的pH值显著低于Ep-1PNA367，说明AH98能够产生较多的酸性物质（图3.1F）；菌丝显微观察发现，菌株AH98的菌丝尖端明显比Ep-1PNA367细（图3.1B），尽管AH98和Ep-1PNA367菌丝内部均含有很多泡状结构（可能是液泡），但是AH98菌丝内部的泡状结构明显比Ep-1PNA367大（图3.1G）。39 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文图3.1菌株AH98的生物学特性Fig.3.1ThebiologicalpropertiesofstrainAH98A，PDA培养基上菌落形态（20℃，10d）；B，菌丝尖端形态观察；C，致病力测性采用离体油菜叶片；D，生长速度测定（5个样本重复，显著水平p<0.05）；E，菌丝鲜重测定（5个样本重复，显著水平p<0.05）；F，产酸能力测定（5个样本重复，显著水平p<0.05）；G，菌丝内部显微观察。A,ThecolonialmorphologyonPDA(20℃,10d);B,Microscopicobservationofhyphaltipmorphology;C,Virulencetestondetachedleavesofrapeseed;D,Growthratetest;E,Mycelialfreshweighttest;F,ThepHvaluetest;G,Microscopicobservationofthehyphalcell;ErrorbarsindicatetheSDfromfivesamplemeans.MeansfollowedbythedifferentlettersonthetopofeachcolumnaresignificantlydifferentattheP<0.05levelofconfidenceaccordingtoDuncan’smultiplerangetest.40 核盘菌新型RNA病毒研究3.4.2核盘菌菌株AH98dsRNA提取提取菌株AH98菌丝中的dsRNA，通过琼脂糖凝胶电泳发现有多条核酸片段（图3.2，泳道2），核酸酶DNaseI和SI处理后，至少还有6条dsRNA片段存在（图3.2泳道1，3），其中9.4Kbp左右的dsRNA片段有2条，3Kbp左右的dsRNA片段有1条，小于2Kbp的dsRNA片段有3条，根据大小分别命名为dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3、dsRNA4、dsRNA5和dsRNA6。测序分析发现，该菌株含有核盘菌弱毒病毒SsHV1（Xieetal.,2011），负义链RNA病毒SsNSRV-1，SsHV-1的卫星RNA和一些未知的序列。估计片段大小，推定dsRNA1和dsRNA2可能是SsHV1和SsNSRV-1，但是具体对应的是哪条dsRNA片段还缺少足够的证据，dsRNA3可能是SsHV1的卫星RNA，剩余的dsRNA没有得到相应的信息。图3.2分离自菌株AH98菌丝中的dsRNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为1%，EB染色，DNA分子标量为λDNA/HindIII。Fig.3.21%agarosegelanalysisofdsRNAsfromAH98mycelial;thenucleotideswerestainedwithethidiumbromide;theDNAmarkerwasλDNAdigestedbyHindIII.泳道1，DNaseI处理过的dsRNA；泳道2，未经核酸酶处理的dsRNA；泳道3，经DNaseI和SI处理的dsRNA。Lane1,dsRNApreparationstreatedwithDNaseI;Lane2,dsRNApreparationswithnotreatmentbynuclease;Lane3,dsRNApreparationstreatedbyDNaseIandSI.3.4.3SsNSRV-1基因组结构和特点3.4.3.1SsNSRV-1末端克隆分别提取菌株AH98和SsNSRV-1侵染的菌株Ep-1PNA367（简写为A367-PT2）中SsNSRV-1的病毒粒子，再从中提取病毒粒子的基因组RNA（vRNA），采用两种方法克隆SsNSRV-1的末端序列，一种方法是通过poly（A）聚合酶的作用在SsNSRV-1的vRNA3’端进行poly（A）修饰，用T4RNA连接酶环化，再用随机引物合成cDNA，SsNSRV-1的特异性引物进行扩增，可以同时得到病毒的5’和3’的末端序列，PCR结果见图3.3A；另一种方法是在T4RNA连接酶的作用下，分别在SsNSRV-1vRNA的5’和3’末端加上接头PC3-T7loop，用随机引物合成cDNA，病毒的特异性引物与PC2分别扩增SsNSRV-1的末端序列，PCR扩增结果见图3.3B。41 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文通过两种方法均得到了SsNSRV-1的末端序列，说明SsNSRV-1的vRNA的末端没有特殊的修饰，这种方法也适用于其它单链RNA病毒的末端克隆。图3.3SsNSRV-1末端克隆结果，1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，DNA分子标量为DL2000Fig.3.3TheendsequencesofSsNSRV-1genomewereamplifiedbyPCRandanalyzedon1%agarosegel.TheDNAmarkerisDL2000(TaKaRa).A，通过环化的方法克隆得到的SsNSRV-1末端序列，进行了两轮PCR反应，特异性的PCR片段用箭头标出；B，加接头的方法克隆得到的SsNSRV-1的末端序列，特异性的PCR片段用箭头标出，相关引物见表3.3。A,TheendsequencesofSsNSRV-1genomewereamplifiedbythemethodofself-circulatingthe5’and3’endofSsNSRV-1vRNA.TworoundsPCRwasconducted;B,TheendsequencesofSsNSRV-1wereamplifiedbythemethodofligatingaDNAprimertothe5’and3’endofSsNSRV-1vRNA.ThespecificDNAfragmentswereshownbyarrows.TheprimerswerelistedinTable3.3.3.4.3.2SsNSRV-1基因组结构及特点SsNSRV-1基因组全长为10002nt（GenBank登录号：KJ186782），5’端没有帽子结构，3’端也没有polyA序列，GC含量较低，为38.8%，5’-UTR相对较长为274nt，3’-UTR相对较短为102nt，基因组的5’和3’末端序列没有明显的互补性。推定含有6个ORF（ORFsI-VI），其中ORFV（nt3377-9179）最大，简称L基因（largegene），含有5802个碱基，ORFIV（nt3095-3281）最小，为186nt（图3.4A）。这6个ORF之间没有重叠，且线性排列在基因组上（图3.4A），但是基因间隔区比较小，大小在45个碱基到123个碱基之间，基因间隔区含有保守的序列3-(A/U)(U/A/C)UAUU(U/A)AA(U/G)AAAACUUAGG(A/U)(G/U)-5′，其中标记下划线的序列完全相同。这个保守的序列可能是SsNSRV-1的gene-junction序列，含有上游基因的终止信号同时含有下游基因的起始信号，这种特性在单股负义链RNA病毒（Mononegaviruses）中普遍存在（Pringleetal.,1997）。42 核盘菌新型RNA病毒研究ORFV推定编码1934个氨基酸的的蛋白，分子量为221.5KDa，简称L蛋白（largeprotein），等电点为8.83，含有多个潜在的糖基化和磷酸化位点（表3.1）。Blastp同源搜索发现，L蛋白的N端含有Mononegaviruses聚合酶保守的结构域Mononeg_RNA_pol(pfam00946,1.75e-86)，与单股负义链RNA病毒Nyamiviruses和Bornaviruses具有极显著的相似性（Evalue≤1e-10），因此SsNSRV-1可能是单股负义链RNA病毒目（Mononegavirales）的一个新成员，L基因编码病毒的RdRP，维持病毒的复制和繁殖。ORFII后被证明编码病毒的N蛋白（Nucleoprotein）（图3.9G，表3.4），但ORFⅡ和其它的ORFs在数据库中均没有发现具有显著相似的序列，蛋白特性分析发现ORFI-VI均编码酸性蛋白（等电点<7.0），其中ORFIV编码的蛋白等电点只有3.67，而ORFVI编码的蛋白呈碱性（等电点为9.3），同时这些蛋白均含有多个潜在的糖基化位点和磷酸化位点（表3.1），目前功能还不清楚。图3.4SsNSRV-1基因组结构及特点Fig.3.4ThegenomeorganizationandcharacteristicsofSsNSRV-1A，SsNSRV-1基因组大小和结构，ORFI在+1阅读框中，ORFII-VI在+2阅读框中；矩形方框表示ORF，依次为ORFI-VI，ORFII编码SsNSRV-1的Nucleoprotein（标记为N蛋白），ORFV编码SsNSRV-1的L蛋白（标记为L蛋白），每个ORF的起始和终止位置均已标示；在每个基因的内部设计了相应的探针PI-VI，用来进行Northernblot分析；B，基因间隔区的序列多重比对，序列方向3’-5’，颜色的深浅标表示序列的保守程度，颜色越深序列越保守。A,Genomesizeandorganization.ORFsII–VIareinthe+2readingframe,whereasORFIisinthe+1readingframe.AconserveddomainintheLproteinisshown.BoxesonthegenomeindicatethepositionandsizeofeachORF,whicharelabeledwithRomannumerals,exceptfortwoORFs,NandL,whichencodethenucleoprotein(N)andRNAdependentRNApolymerase(RdRp)protein(L);B,ComparisonofputativegenejunctionregionsbetweentheORFsinSsNSRV-1.Alignmentoftheputativegene-junctionsequencesisshownina3’-to-5’orientation.Conservedsequencesarehighlightedinpurple.Differentshadesindicatethelevelsofconservedsequence,andthedarkestcolorshadeshowsthemostconservedsequence.43 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文表3.1SsNSRV-1ORFs特性分析Table3.1CalculatedandpredictedpropertiesofSsNSRV-1ORFsORFLengthSizeMassNo.ofglycosylationsitesNo.ofphosphorylationsitespI*(nt)(aa)(kDa)N-linkedO-linkedSerThrTyrI72624226.45.85113631II112537541.85.17271264III80726930.16.67381004IV1866273.6703220V(L)58021934221.58.831143802525VI50416819.49.3267533.4.3.3SsNSRV-1与Mononegaviruses基因组结构比较单股负义链RNA病毒目（Mononegvirales）目前包括5个科，即博尔纳病毒科（Bornaviridae）、线状病毒科（Filoviridae）、副粘液病毒科（Paramyxoviridae）、弹状病毒科（Rhabdoviridae）和新成立的Nyamiviridae，基因组大小在8.9Kb-19.1Kb。基因组最小的病毒是Bornaviruses（8.9Kb左右），而基因组最大的病毒是线状病毒Filoviruses（18Kb-19.1Kb）。这些现存的Mononegaviruses都含有相似的基因模式（N-P-G-M-L），即第一个基因编码病毒的N蛋白（Nucleoprotein），最后一个基因编码病毒的L蛋白（Largeprotein），中间包括磷酸化蛋白P（Phosphoprotein）、糖蛋白G（Glycoproteins）以及基质蛋白M（Matrixprotein），并且这些基因多数不重叠（Pringleetal.,1997）。在副粘液病毒科中，基质蛋白M和糖蛋白G之间还可能存在融合基因F（Fusionprotein）。比较基因组发现，SsNSRV-1基因组大小为10002Kb，仅比Bornaviruses基因组稍大。预测有6个基因，其中ORFII编码病毒的N蛋白，而ORFI功能未知，并且在L蛋白后，还有另外一个基因ORFVI，该基因在现存的Mononegaviruses中是不存在的。因此SsNSRV-1在基因组结构上与现存的Mononegaviruses有较大的差别，说明在低等的真核生物真菌中，真菌负义链RNA病毒有其比较独特的结构特点。44 核盘菌新型RNA病毒研究图3.5SsNSRV-1与Mononegaviruses基因组结构比较Fig.3.5GenomecomparisonofSsNSRV-1andselectedmononegaviruses选取病毒的名字见表3.5，所选取的病毒基因组结构及分类均已标注，所有病毒的基因排列均为3’-5’，带箭头的方框表示基因的大小和方向，功能已知的基因用相应的字母进行标示：N，核衣壳蛋白（Nucleoprotein）G，糖蛋白（Glycoprotein）；P，磷酸化蛋白（Phosphoprotein）；M，基质蛋白（Matrixprotein）；L，巨型蛋白（Largeprotein）；F，融合蛋白，仅存在于副粘液病毒科中，功能未知的基因未用字母标示。AbbreviationofvirusnameisshowninTable3.5.Genomemapsandvirusfamilywerepresentedin3’-to-5’foreachselectedviruses.Arrowheadboxesindicateviralgenesandtheirdirections.Thegeneswhosefunctionwereknownarelabeledwithletters(i.e.,N,nucleoproteins;G,Glycoproteins;P,phosphoprotein;M,matrixprotein;L,RdRPgenes;F,fusionproteinwhichwasonlyindentifiedinpneumovirusesandparamxoviruses),andthegeneswhosefunctionwereuncleararewithoutletters.3.4.3.4SsNSRV-1与Lprotein-like序列结构比较Kondo等2013年报道了真菌负义链RNA病毒存在的证据，并且从两个独立的Sclerotiniahomoeocarpa转录组（transcriptomeshotgunassembly，TSA）数据库中分别得到了四条TSA序列，序列号为JU091017、JU091016、JW826636和JW828891，其中JU091017和JU091016序列完全相同，命名为ShTSA1，序列JW826636和JW828891分别命名为ShTSA2和ShTSA3。ShTSA1大小为9775nt，有4个ORF45 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文（ORFI-IV）；ShTSA2大小8605nt，有4个ORF（ORFI-IV）；ShTSA3大小为8052nt，有3个ORF（ORFI-III）（图3.6A）。其中ShTSA1-3均含有一个“longORF”（L-likeORF）与Nyamaninivirus的L蛋白具有极显著的相似性，推定为现存的真菌负义链RNA病毒。通过基因结构比较发现，ShTSA1-3的L-likeORF的大小和位置均与SsNSRV-1的L基因类似，同时序列比对表明L-likeORF与SsNSRV-1的L基因存在极显著的相似性（≤1e-10）（图3.6B），在功能上可能是病毒的RdRp，维持病毒的复制和繁殖。在L-likeORF后面都存在一个ORF，与SsNSRV-1的ORFVI对应，而这个ORF在已发现的Mononegavirues中都不存在（图3.5），因此这个“多余的”ORF可能是真菌单股负义链RNA病毒所特有的，同时相似性分析发现他们之间均没有显著的相似性，在NCBI数据库中也没有发现显著相似的序列，具体功能还不清楚。ShTSA1-3L-likeORF前面的ORF对应SsNSRV-1的ORFIV，但是这些ORF明显大于SsNSRV-1的ORFIV，且它们之间没有显著的相似性，暗示可能有完全不同的功能。序列比对表明，ShTSA2的ORFII和ShTSA3的ORFI与SsNSRV-1的N蛋白具有极显著的相似性（图3.6B），需要说明的是ShTSA3只是部分序列，在ORFI前面很可能还存在其它的ORF，进一步表明真菌单股负义链RNA病毒的N蛋白在基因组的位置与已知的Mononegaviruses不同，且不是由第一个基因编码的，因此真菌单股负义链RNA病毒有着特殊的基因组结构。图3.6SsNSRV-1与真菌数据库中Lprotein-like序列基因结构和相似性比较Fig.3.6ComparisonoftheORFsorganizationofthethreefungal-ssRNAvirus-likesequences(ShTSA1to3)withSsNSRV-1.A，SsNSRV-1与ShTSALs基因结构和大小，带箭头的方框表示ORF大小和方向，//表示部分序列；B，ShTSALs的ORF与SsNSRV-1的N、L蛋白相似性比对，具有显著相似性的evalue46 核盘菌新型RNA病毒研究值已经标示，不具有相似性的用“-”标示。A,ORFsorganization;B,ComparisonoftheLproteinandNproteinofSsNSRV-1withtheputativeproteinsencodedbyfungal-ssRNAvirus-likesequences.TheEvaluebetweentheputativeproteinsoffungal-ssRNAvirus-likesequencesLprotein-likesequencesandLorNproteinofSsNSRV-1isshownwhenthereissignificantsimilarity.3.4.4SsNSRV-1基因的Northernblot分析提取无毒菌株Ep-1PNA367和携带SsNSRV-1菌株Ep-1PNA367-PT2的总RNA（菌丝培养4d），用Northernblot的方法验证SsNSRV-1各个基因的表达情况。结果表明，用基因内部特异性的探针可以特异性地检测到相应基因表达的信号（图3.7），说明SsNSRV-1的ORFI-VI确实都存在，而且都表达，并且这些基因都是有功能的。同时我们还发现，不同探针杂交结果均显示有同一个大小的信号（约10Kb）（图3.7），推测是SsNSRV-1的基因组RNA。从杂交的结果来看，ORFI-VI杂交得到的片段大小分别是1.5Kb、1.7Kb、1.7Kb、7Kb、7Kb和7Kb，与预测的基因大小不同（表3.1），可能是相应的mRNA有较为复杂的二级结构，影响RNA的迁移速率，也可能是SsNSRV-1的ORFI-VI有特殊的转录模式。Mononegaviruses转录有多种模式，并且转录从3’-5’具有极性效应，靠近3’端的基因表达活性高，而靠近5’端的基因表达活性相对较低，在Bornavirus（BDV）中，根据基因组在不同位置设计了5个探针进行Northernblot分析，每个探针均检测到多个杂交信号，推测BDV的RNA转录有多种方式，包括多个基因一起转录、转录内部起始和终止、转录剪接等多种表达方式（Brieseetal.,1994）。图3.7Northernblot分析SsNSRV-1ORFI-VI基因的表达Fig.3.7NorthernblotanalysisofSsNSRV-1ORFI-VIA367-PT2，SsNSRV-1侵染的菌株Ep-1PNA367；A367，强毒菌株Ep-1PNA367，阴性对照；Marker，RL10000（TaKaRa），相应的探针由λDNA制备；探针PI-VI根据每个ORF内部的序列设计，47 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文见图3.4A，制备探针的引物见表3.3。(B)NorthernblotanalysisofSsNSRV-1ORFsI-VI.TotalRNAswereextractedfrommyceliaofEp-1PNA367(shownasA367),whichwasvirus-free;andEp-1PNA367-PT2(shownasA367-PT2),whichwastransfectedbySsNSRV-1.Internalgene-specificDNAfragmentswerePCRamplifiedandusedtomakeprobesPIthroughPVI.PrimerpairsweredesignedbasedonthesequenceofeachORF(Table3.3).DIGlabeledλDNAwasusedasaprobetodetecttheRNAweightmarkerRL10000(TaKaRa).IncomparisonwiththeSsNSRV-1-freeEp-1PNA367,allthemRNAsofSsNSRV-1ORFsI-VIwerespecificallydetectedinEp-PNA367-PT2.3.4.5SsNSRV-1基因表达模式Northernblot已经证实SsNSRV-1ORFI-VI存在且表达，但是具体每个基因是如何表达的，需要进行5’RACE和3’RACE以及测序来推定SsNSRV-1基因的表达模式。通过5’RACE克隆得到了ORFI-VI的5’末端（图3.8A），得到的PCR产物大小与预期的目标片段大小一致（引物见表3.3），经过测序得到了每个基因转录的起始位点及序列（表3.2，图3.8C），结果表明每个基因的起始位点均在基因的间隔区，且单独起始转录。通过3’RACE克隆得到了ORFI-VI的3’末端，除ORFV外，得到的PCR产物大小与预期的目标片段大小一致（引物见表3.3），经过测序得到了每个基因的转录终值位点及序列，结果表明的ORFI-VI3’RACE序列均在基因间隔区终止，且与预期的基因序列完全相同（图3.8B，C）。综合5’RACE和3’RACE结果，SsNSRV-1的ORFI-VI均可以单独转录，因此推定出了相应的转录模式（图3.8C）。但是在测得的ORFV3’RACE序列中有的还包含有ORFVI的3’末端序列（图3.8B，表3.2），因此推测SsNSRV-1的ORFV和ORFVI不仅可以单独转录，还可以一起转录形成双顺反子（图3.8C）。从SsNSRV-1基因的转录模式来看，真菌单股负义链RNA病毒的转录似乎比较简单，多数进行单独转录，这与图3.7的Northernblot的结果也是一致的。48 核盘菌新型RNA病毒研究图3.8SsNSRV-1的表达模式Fig.3.8ThetranscriptionalmapofSsNSRV-1A，ORFI-VI的5’RACE；B，ORFI-VI的3’RACE；箭头标示含有ORFV3’RACE产物的位置；C，推定的SsNSRV-1转录表达模式。A,Agarosegelelectrophoresisofthe5′RACEofORFsI–VIon1.5%agarosegel.B,Agarosegelelectrophoresisofthe3′RACEofORFsI–VIon1.5%agarosegel.Arrowsshowthepositionsthatcontainthe3′RACEproductfromORFV.TheprimersusedarelistedinTable3.3.ThepossibletranscriptmapofSsNSRV-1basedonthe5′and3′RACE.49 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文表3.2SsNSRV-1ORFI-VI的5’和3’RACE得到的序列Table3.2The5’RACEand3’RACEsequenceofSsNSRV-1ORFI-VI.Viral5’RACEsequence3’RACEsequencegeneTCGAGGCGGCCGACATGTTTTGTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTGTGAGGGAGTATTAGAAGCATTAGTTCACTCCCAAGGTCAACAAATTTCTGACTTACAAGATCAGTAATTACCTTCGTAGTTGTTCTTACTCTCTGGTACCTACCTCCAGAAATTCTATTAAATTCTGCACTCCGAGTTGAAATTCAGGCATGCCACTCGTCTGTGTCCCTTCACTTTAATTCCATAAATATCACATAAGTGATCAATATGAGCACAACTGTTGACATATAAGCAAACAACAGCTGATGCCATTAGCGCAGCTTCTGCTGATCTACGGGTAAGAAAGAGGAAGACACTTTCGAGGAACTCGAATTGATAAAAGGACTCGGAACACGAATTGTCGACGCAGTGTCCATTTATAAAGAGACTCCAGGATTAGTTGORFIGTGTCATAGAGAACGATCAGGAATTAAGAACCTCTATTGCTGCATTAACTGGCAAGCGACTGACAGCAGCTACCAATAATATATTATCCATGTATCCGGAGGAATCCTTACCTGGAAATATGAGAGAGATTCCCGTGGAACAAGACACTACAGCGTTAATAAAAACAGGTTTGAAGAAGGTAGAATTGACGAAGACTGATCAAGTATTGTTTCTCCTTCTGGTGAAATTTTAGATGAACCTATTATGCAATCTACATCTCTCTCAATGCAAAAAATCACTACTAACTCAACTTTACCTAAGGCTAAGCTTCCGAAGCATCGTCATGAAACAACTCTCCCTCAGCCCGGAATCAAGAACATTTTCCCTTCGACATCTCAGAAAGTAGATCGTCAATCTATACTCGGAACTGTAAGATTATTTAGTGCAGCTCTTTTAACAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAACAAAACATGTCGGCCGCCTCGGTTATGTTTCGTCTTACTTTTGGGGCATCTCTAAGTCCTCTCTTGCTGATTACCGAGGCGGCCGACATGTTTTGTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTGAGGAGATTCAATCAAGTATGCAAGAAAGTATCCTCAATTTTTCAGAGAATTCAGCGATCTCGATATAGTCTCATTCTTGTCTTACATCACTTCTAATCTCATTCTCGTTATTACCATGTAACGGAATATTTCGCTGCTGCCCATGCTCTCCAACGTTTTCTAGATACATCCCTGACTCTCGACGAACCATTCCAGATGTCTTTAAAGACAAGGATACCTATGGAGACTAAACGCAGAATGTATCTGAAAGTGATTTTTGGAAGTGCATACATCCCATGAATATTGAGGCTAACCGCGATCGACTCCCTACTATCGATTTGACCAGAAATTGATTGATCGTAATGATATTAATGAACTTCTCGGAGTAGCAGTTTTCGCTCTATORFIITGAATACTCGGAGATTTTTGTTAGTGCAACTGATCTTCCCGTCCGTATGTGCTTGCTCAACAGGAGTCCACTTTGGAACAATACGCAGGAGGAACTCTTAGTGTTCGCTGGAATTCAACATGCAGAGGATTCTGACGACATTGCCAAACTGGTTATCGGTAACACAGAGAAAAATTGATCGCTCTTCTCAACATCCGAGAGGCTGCTGAGGCGATGATTTCTGCAAGCGGTGTTAATTATTCTACTGCTCGATTGGCTAATGTATGAAACTGTCCCCGAGGCTCCAGCCCAATAAGTTCTATTCTCATCTCGTATGTCAAAGATACTTCAGCTGAAATCAAGAATTGGGTTATATCTCGATTTAGTCATGTCACAATTCTTGAATGAAAGATCTCTTGAATTATTTAATAAAAAAAAAAAGACCCGTCTGAAAAAAAAACAAAACATGTCGGCCGCCTCGATGTCAGACTCGGGATCAATGGGATCGGGAAATACTAACATCACTGAACCCGAGGCGGCCGACATGTTTTGTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTGCGAGGGAGTTAAACAGATGTTATCATTTTCCGAATTCGAAAGTCGCCGCCATCCGATATCATTCCTATAAATCCTTATCAGCGATATGCCTACTCTATCGAATAACTGCCAAGACCTCGTCAATCGAGATTATTTCTCTAGATCTACAAGTCAAGGTATGATTGACGCAATCATCTTGTGTAAATTGTCTAGTCCGACTGATGTTGCAGTCACACAGTCTAGCAATTTCTATCGAGAGACCAGCTTTCCAGTGGGAAAAATTTAACGTGGAGAGAAGTGCTGGACCTTCAATCAAAAGTAAATGCTACCAAATCTCATCATCGAACTTTGGAATTGGATACTAATCCACGTTATCTTTCTGAGTCTATCATCTGCGATCAAGCCORFIIIGAATAAAATAGGATTCTTTCAAAATGCTTTGATCTTGACAATGCAGGATAAAACGAGTTCATTCGGCGAGATATTTGTTCCGCTCCGACGGATAATCGAGAATATTGAACTCTCTTGGGATATCTTAGCTCAACTCTTGATCGAAACTAAGTTGAAAATTCGCATTCGTCACACTCGCTACGACATCACATGCACAGCAATTGCTGCAGCTTGCATGTGCCCTGACAAAGGATATTATCTTTCGCTGATCAAAAGCTCTCCTTTTTAATACTGCATTTCCGAATACTCTTAATTACTACATAAATGACCAGTACGTACGGTAACTCTAGTGTTAGATCAAGCTAAAACAAACATGTCGGGTTTGTATGTATTTGTCACGGATGAACAAGACAAACTGACATCTCTAACATGAATTTTCGTCACTTTGAATGATGAGTATGGACTACATATGTCAGACTCGGGAAACAACTCACCTCAGATATTATTTAACAAAAAAAAAAGAAAAAAAAACAAAACATGTCGGCCGCCTCGGTCTC50 核盘菌新型RNA病毒研究TCGAGGCGGCCGACATGTTTTGTTTTTTTTCTTTTTTTTTGGGAGAAAACCATACTCTCGTTTGTCTGCGCACTAGTTTTGCTAGAAGATCTAACTAAGAGAGTCTGTACATCGCATACGAACTTAGATTTACAATAATGGACGTTCTCGAAAATCAACCTCGGAATCGAATCTTATAGAAACCTCAAGTGAGTTTTCACTAGTTACGGAAGAAATTTGATTTTTACTCGTTTGTCTGCGCACTAGTTTTGCTAGAAGATCTAACTAAGORFIVTGGTGAATTCGAAGAAGTTGAAGTCACATCTGGTTCGAACTTAGGATAATCAGAGTCTGGGAATCGAATCTTATAGAAACCTCAAGTGAGTTTTCACTAGTTACGGAAGGTCCTAAGAAATTGTACATTAAATCTTCGAATTCACGTGTAGATAAAGAAGATGGTGAATTCGAAGAAGTTGAAGTCATATTAAGTAAAAAAAAAAGAAAGAAAAACAAAACATGTCGGCCGCCTCGTGAGAATCAAGTATCAGATGTCGTCCTCTACACCACCCAGTTAGGTTCGCTCGGGAATGGTAATTATCAGAGCATCGAGTTTAAAACAAAGAATGAGATCAATTATTCATATGCCTCCACAGAGTTAGTATCCCAATTCTGGAATGTGGAACCGAATATCTCTAGACATTTTCAATTAGATGTAACTGATACTGTTCTCTCTCTACGGTCTAGGTTAAAATCTTTATATGATGCACGACGAACAGAAGTTTCCGAAGTATATATTCACTTATGGGATATAATGCATGCAAGTTTGAATCCAATAAGTCTAACAGGTAAAGATCTTCGATGTCGGGCAATTTGTGATAATATTTTCAAGTATGATAGTTGAATGACATTTGACTTGAACTACTATTTAAAAAAAAAAGAAAAAAAACAAAACATGTCGGCCGCCTCGTCGAGGCGGCCGACATGTTTTGTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTAAGGAGATTCAACAGAGAATCAAGTATCAGATGTCGTCCTCTACACCACCCAGTTAGGTTCGCTCAAAACTTCATCATGAATTTCAGCGAAGCTTTCGAGTTCGATTCGATTCGGGAACGGGGAATGGTAATTATCAGAGCATCGAGTTTAAAACAAAGAATGAGATCAATCGTTCTGCTGCTCCGGCAGAGAAGCATCTTCGAAGTCCAATACTTTCTTCTTTGTTATTCATATGCCTCCACAGAGTTAGTATCCCAATTCTGGAATGTGGAACCATGGATAGATTGAGGTTGCTCTATAACGAAGTATTACACTACAAAGAGAAAACTGAATATCTCTAGACATTTTCAATTAGATGTAACTGATACTGTTCTCTCTCTAORFVAGATTTCCTCAAAGCAAATTCCCTTATATCAAATCGGATGTTCCACAAATAGTTACGGTCTAAGTTAAAATCTTTATATGATGCACGACGAACAGAAGTTTCCGAAAGGCAATTTGTAAGCATAATCTAATTCACTCCTATTCTGGTCTCGAACGCGTTGCGTATATATTCACTTATGGGATATAATGCATGCAAGTTTGAATCCAATAAGTAACGCCTTGGTTATTCGATTTAATAGGAACATCATCTTCGCCGTATATTGTCACGCTAACAGGTAAAGATCTTCGATGTCGGGCAATTTGTGATAATATTTTCAAGCCGGACCAATATCCTGAGCTATTTACTCGTACCTTGATATCGAGAGAAAGTCTCATATGATAGTTGAATGACATTTGACTTGAACTACTATTTAATAAAACTCAGGAAATATCCCTAGCTGAGTCATCAGAGCTTTACCGCTCGGAATTATGTGCGAGGATGCCTTCGTATAAGGAGAAGTATTTCTCAATCTGCAATCGTTTAACTACAATGGAAAGGCGAGTATTACTTGATGAATCAATCCTGCTAGATTTACGGCAAACTATCCTAAATCTGCAAATTCAGTTAAATAATCCGCAAAAAGAACTCGATGAATTTCTAATCAATCAGCTGCACCTAGCACTTACCGAGTTGATTAAATATGCAAATCCTCAATTTCAATTACCCGCGCATTTCAAAGGTAAAGAAATCAATGAAATTTTAACCATTACTACTGAGATGATATTTAATGCAGTATCTCTATTGAGGGATGCAACTGTTCGAGCTCAAACAATAATTTCGGACATTCCATCCAAACCTATCAAAAATAATCCACCCTCTAGAAATCATTTAATCAAGAATCGTACCTTGAATAACGAATCTCGGATTATATTAAAATCGAGTACTACCGAGTTGTCTCCTGAACCAAGCAGAAACCGTCCTCGAAGTTTTACGATGTCTCCATAGTAAACACTTCTGTATTTCCCGAAACACAGTTTATTTAAGAAAAAAAAAGAAAAAAAAACAAAACATGTCGGCCGCCTCGTCGAGGCGGCCGACATGTTTTGTTTTTTTTCTTTTTTTTTCTTGAGGAGGATGCCTTCCGCAAAAAGAACTCGATGAATTTCTAATCAATCAGCTGCACCTAGCACTORFVITCGTGTAAGGAGAAGTATTTCTCAATCTGCAATCGTTTAACTACAATGGAAAGGTACCGAGTTGATTAAATATGCAAATCCTCAATTTCAATTACCCGCGCATTTC51 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文CGAGTATTACTTGATGAATCAATCCTGCTAGATTTACGGCAAACTATCCTAAATCAAAGGTAAAGAAATCAATGAAATTTTAACCATTACTACTGAGATGATATTTTGCAAATTCAGTTAAATAATCCGCAAAAAGAACTCGATGAATTTCTAATCAATCAATGCAGTATCTCTATTGAGGGATGCAACTGTTCGAGCTCAAACAATAATTAGCTGCACCTAGCACTTACCGAGTTGATTAAATATGCAAATCCTCAATTTCAATTTCGGACATTCCATCCAAACCTATCAAAAATAATCCACCCTCTAGAAATCATACCCGCGCATTTCAAAGGTAAAGAAATCAATGAAATTTTAACCATTACTACTGATTAATCAAGAATCGTACCTTGAATAACGAATCTCGGATTATATGAAAATCGGATGATATTTAATGCGGTATCTTTATTGAGGGAGTACTACCGAGTTGTCTCCTGAACCAAGCAGAAACCGTCCTCGAAGTTTTACGATGTCTCCATAGTAAACACTTCTGTATTTCCCGAAACACAGTTTATTTAAGAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAACAAAACATGTCGGCCGCCTCGYellow-highlightedsequencesaretheuniversalprimerCDSIII-3;TheYellow-highlightedsequencesaretheuniversalprimer;andGreen-highlightedblue-highlightedsequencesarepoly(A)tailedthefirst-strandcDNAbyterminalNotesequencesarethegene-specificprimers.deoxynucleotidyltransferase(Tdt);andGreen-highlightedsequencesaretheThepurpleplacesshowedthestopcodonofeachgene.gene-specificprimers.Startcodons(ATG)alsoarehighlightedwithpurplecolor.52 核盘菌新型RNA病毒研究3.4.6SsNSRV-1转录调控信号通过基因的3’RACE和5’RACE分别克隆得到了SsNSRV-1ORFI-VI的3’序列和5’序列（表3.2）。序列多重比对表明，每个基因转录终止的位置均富含“AU”，除ORFIV外，转录终止序列“UAUUUAA”是严格保守的（图3.9A）。分析转录终止序列后对应的基因组序列，发现每个基因转录终止后的序列均严格保守，其中序列“AAAACUUAGG”是完全一致的，因此该序列是基因转录的终止信号（图3.9C）。此外，每个基因转录起始的位置也具有一定的规律，每个基因转录的起始位置均含有“GGAG”4个碱基，其后是一段富含“AU”的序列（ORFVI除外）（图3.9B）。分析基因转录起始位点前对应的基因组序列发现，除ORFI外，转录起始位点前的序列也是严格保守的，而且富含“AT”，其中序列“UAUUUAAUAAAACU”是完全一致的（图3.9D），是基因转录的起始信号。序列分析表明，基因转录起始和终止的信号均位于基因间隔区的保守序列（图3.9E），其中绿色方框标示的是基因的起始信号，红色方框标示的是基因的终止信号，基因的起始信号和终止信号相互“交汇”，构成了SsNSRV-1的“gene-junctionsequence”，这是Mononegaviruses普遍存在且特有的一个现象（Pringleetal.,1997）。图3.9SsNSRV-1基因的转录调控信号Fig.3.9ThesignalfortheregulationofSsNSRV-1geneexpressionA,3’RACE得到的基因3’端序列多重比对,灰色部分的序列为基因终止的位置；B，5’RACE得到的基因的5’端序列多重比对，灰色部分的序列为基因起始的位置；C，基因3’端对应的基因组序列多重比对，灰色部分序列一致，为基因转录终止的位置，红色部分为基因终止信号，序列高度一致；D，基因的5’端对应的基因组序列多重比对，灰色部分为基因转录起始的位点，绿色部分为基因转录起始信号，其中ORFI没有发现类似的终止信号，用空格表示。E，基因间隔区保53 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文守的“gene-junction”序列，基因转录起始和终止信号分别用绿色方框和红色方框标示。A,Themultiplealignmentof3’RACEsequences.Theconservedsequencelabeledwithgraycolorwastheendpositionofeachgene;B,Themultiplealignmentof5’RACEsequences.Theconservedsequencelabeledwithgraycolorwasthestartpositionofeachgene;C,Thegenomesequencescorrespondingtothe3’RACEsequences.Thesequenceslabeledwithgraycolorwereidenticalto3’RACEsequences,andtheconservedsequenceslabeledwithredcolorweretheendsignalofgeneexpression;D,Thegenomesequencescorrespondingtothe5’RACEsequences.Thesequenceslabeledwithgraycolorwereidenticalto5’RACEsequences,andtheconservedsequenceslabeledwithgreencolorwerethestartsignalofgeneexpression;E,Theconserved“gene-junction”sequencesamongeachgene.Thestartsignalandendsignalofgeneexpressionwerepointedwithgreenandredbox,respectively.3.4.7SsNSRV-1病毒粒子的结构和形态特性SsNSRV-1病毒粒子可能具有囊膜结构，呈丝状形态，类似于Ebolavirus的病毒粒子，直径25-50nm不等，长度约1000nm，表面光滑，没有观察到明显的突起状结构（图3.10A）。同时，在菌株AH98和Ep-1PNA367-PT2菌丝的超薄切片中可以观察到类似的丝状结构（图3.11），这些丝状结构长度超过5μm，直径约80nm左右，而其中的点状亚结构直径不超过30nm（图3.11A、B），在菌丝的横切面中可以观察到大量的点状亚结构，并且在这一结构的周围发现有大量的线粒体聚集（图3.11C）。在膜状结构损坏的部分可以观察到螺旋状亚结构的释放（图3.10A），这些螺旋状的结构比较稳定，在SsNSRV-1病毒粒子提纯过程中可以观察到大量的这些结构，且结构有时致密有时松散（图3.10B），这种螺旋状的结构在Mononegaviruses中普遍存在，例如Marburgvirus、rabiesvirus、Newcastlediseasevirus、simianvirus等等，推测这些螺旋状结构是病毒的核衣壳。SsNSRV-1的核衣壳是单链的、左手螺旋的杆状结构，构象变化很大，结构致密时直径为20-22nm，长度不等，大约在200-2000nm之间（图3.10B、C），在结构松散的核衣壳某些位置可以观察到表面突起的圆环状结构（图3.10C），该结构是核衣壳蛋白单体构成的多聚体（Nucleoproteinpolymer）。SsNSRV-1释放的核酸，经过DNaseI消化或不消化直接进行PCR检测，检测不到SsNSRV-1，而经过反转录后，再用PCR检测，能够检测到SsNSRV-1，说明病毒的核酸是RNA而不是DNA（图3.12A）。核酸样品经过核酸酶SI或RNaseA消化后，用RT-PCR进行检测，检测不到SsNSRV-1（图3.12B），说明病毒粒子中的核酸是单链RNA（ssRNA），同时考虑到SsNSRV-1的末端能够连接上一段引物（图3.3），说明SsNSRV-1的病毒粒子包含一条线性的单链RNA。54 核盘菌新型RNA病毒研究Northernblot分析病毒粒子释放的RNA，用ORFII制备的探针进行杂交，能够特异性地检测到一个信号，大小约为10Kb，与SsNSRV-1基因组相似（图3.10E）；而用ORFV制备的探针进行杂交，能够产生两个信号，一个片段大小约10Kb，是SsNSRV-1的基因组RNA，另一个大小约7Kb，且信号非常强，推测可能是SsNSRV-1的缺陷型RNA（dfectivevRNA,dvRNA），而且浓度远高于基因组RNA。通过在dvRNA的3’末端进行poly（A）修饰，在T4RNA连接酶的的作用下环化，克隆到了dvRNA的5’和3’末端，发现这些dvRNA的末端不止一个片段，而是有多条（图3.13A）。通过测序得到了dvRNA的序列，和SsNSRV-1基因组比较发现，这些dvRNA的3’末端有不同程度的缺失，而5’末端比较完整（图3.13B）。在得到的4条不同的dvRNA中，有3条dvRNA的ORFI完全缺失，ORFII的3’端大部分缺失，而5’端的UTR及ORFVI有部分缺失；有2条dvRNA的ORFI部分缺失，而ORFⅡ的5’端大部分缺失（图3.12B）。因此，这些不同程度缺失的dvRNA，主要是缺少了ORFI和ORFII，但是每个dvRNA的L基因都是完整的，这就解释了为什么用ORFII制备的探针只能够检测到SsNSRV-1的基因组RNA，而用ORFV制备的探针能够检测到基因组RNA和dvRNA，同时，结果还表明这些dvRNA很可能能够自主复制，具体的功能还未知。SDS-PAGE分析SsNSRV-1的核衣壳可能具有两个蛋白，大小为43KDa（p43）和41KDa（p41）（图3.10G），紫外吸收分析表明SsNSRV-1核衣壳在260nm具有最大吸收峰（图3.14A），表明SsNSRV-1的RNA是存在的，而且是暴露的，因此SsNSRV-1的核衣壳实际上是RNA-Nucleoprotein复合体（RNP），而且RNP可以直接作为反转录的模板（图3.14B）。实际上，Mononegaviruses的RNP可以直接作为病毒复制或基因转录的模板，病毒的基因组RNA永远不会也没有必要解离成游离状态的RNA（Ruigroketal.,2011）。SsNSRV-1的EVLS在提取过程中很不稳定，很难得到比较完整的具有包膜结构的病毒粒子，难以大量富集，因此不利于病毒粒子的结构蛋白以及晶体结构的解析。而SsNSRV-1的核衣壳在提取过程中，尽管构象变化很大，但是比较稳定，可以得到大量的核衣壳，从而有利于进行结构蛋白解析以及晶体结构解析。在SsNSRV-1病毒粒子提取过程中，实际上得到的绝大部分都是病毒的核衣壳，构成核衣壳的主要蛋白是N蛋白，即使在完整的病毒粒子中，N蛋白的含量都是最丰富的。蛋白电泳分析，SsNSRV-1的核衣壳蛋白可能有2个，即p43和p41（图3.10G），通过多肽指纹图谱分析（peptidemassfingerprinting，PMF），p43和p41分别产生了33个和23个多肽片段（表3.4）。其中，p43产生的33个肽段中有32个匹配到ORFII编码的蛋白序列，占ORFII编码的整个蛋白序列的67.2%；p41产生的23个肽段中有22个也匹配到ORFII编码的蛋白序列，因此SsNSRV-1的N蛋白可能有两种形式，也可能p43在病毒粒子提纯过程中发生部分降解产生p41。另外，在SsNSRV-1的病毒粒子粗提液中，还鉴55 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文定到了ORFI编码的肽段（表3.4），因此ORFI可能参与了病毒粒子结构的形成，但是该基因的功能还不清楚。同时，在鉴定p43和p41的过程中，还鉴定到了来自SsNSRV-1的L蛋白的肽段（表3.4），说明L蛋白确实是存在的。图3.10SsNSRV-1病毒粒子和核衣壳的形态和结构Fig.3.10MorphologyandstructureofSsNSRV-1particlesandnucleocapsidsA，丝状的可能含有包膜的病毒粒子以及释放的螺旋状的核衣壳；B，结构致密或松散的核衣壳；C，构成核衣壳的环状结构以及环状结构的N蛋白单体；D，SsNSRV-1病毒粒子中RNA的甲醛琼脂糖电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.2%，含有甲醛1%（V/V），Marker为RL10000。病毒粒子从菌株Ep-1PNA367-PT2中提取纯化，菌株Ep-1PNA367作为阴性对照；E，Northernblot分56 核盘菌新型RNA病毒研究析SsNSRV-1病毒粒子中的RNA，探针用来自N基因的PII，MarkerRL10000用λDNA制备的探针进行检测；F，Northernblot分析SsNSRV-1病毒粒子中的RNA，探针用来自L基因的PV；G，SDS-PAGE电泳分析SsNSRV-1的N蛋白，考马斯亮蓝R250染色，蛋白大小通过蛋白Marker进行估计。A,Filamentous,possiblyenvelopedvirions(markedbyarrowheads),andthereleasednucleocapsids.B,Purifiedtightorloosecoilsofnucleocapsids.C,RingsthatmakeupthecoilsandNPmonomers(markedbyarrowhead).D,AgarosegelelectrophoresisofviralRNAsextractedfromvirionspurifiedfromthemyceliaofstrainEp-1PNA367-PT2.Thisgelcontained1.2%agaroseand1%formaldehyde(vol/vol)andtheRNAsamplewasrunin1×MOPSbuffer(pH7.0).ThemarkerwasRL10000(TaKaRa).E,NorthernblotanalysisofRNAsisolatedfromSsNSRV-1particlesusingprobeII.ProbeIIamplifiedfromtheNgeneshowedasinglebandwithasizeof10Kb,identicaltothesizeoftheSsNSRV-1genome.F,NorthernblotanalysisofRNAsisolatedfromSsNSRV-1particlesusingprobeV.ProbeVamplifiedfromtheLgeneshowedtwobandsofsizesof10and7Kb.ThesmallerbandwasthemixtureofdefectiveRNAsofSsNSRV-1genome.G,SDS/PAGEanalysisofSsNSRV-1nucleocapsids.Samplescollectedfromsucrosegradientfractionscorrespondingto25%sucroseweresubjectedtoSDS/PAGE.ThesizesoftheCoomassieblue-stainedproteinswereestimatedbycomparisonwithproteinweightmarkers.图3.11菌丝切片中SsNSRV-1核衣壳及具包膜病毒粒子类似的结构Fig.3.11Nucleocapsidsandenvelopedvirion-likestructures(EVLSs)ofSsNRV-1inultrathinhyphalsectionsofvirus-infectedstrain57 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文A，在菌株AH98菌丝纵切面的超薄切片中观察到的完整的丝状结构的EVLS（箭头所示），细胞核和线粒体分别用N和M标示；B，A图中方框部分，可以观察到丝状结构EVLS的膜（箭头所示），其中可以观察到点状的亚结构，可能是SsNSRV-1的核衣壳；C，菌株中Ep-1PNA367-PT2菌丝横切面观察到的点状亚结构，可能是SsNSRV-1的核衣壳（NC），同时可以看到该结构周围有大量的线粒体聚集。A,ThefilamentousEVLSinthelongitudinalultralthinsectionofstrainAH98hypae(whitearrowheads).ThenucleusandmitochondriawerelabeledwithNandM;B,Themembranestructures(whitearrowheads)andthedot-likesubstructuresinthemagnifiedsectionoftheFig.3.9Abox.C,Thedot-likesubstructuresmightbethenucleocapsidsinthetranverseultralthinsectionofstainEp-1PNA367-PT2hypae.Manymitochondriaweregatheredaroudthedot-likesubstructures.EVLS,envelopedvirion-likestructures;M,mitochondrion;N,nucleus;NC,nucleocapsids.图3.12SsNSRV-1病毒粒子中核酸性质的验证Fig.3.12CharacteristicsofSsNSRV-1nucleicacidreleasedfromviralparticles病毒粒子释放的核酸样品分别用核酸酶DNaseI、SI和RNaseA进行处理，然后用PCR或RT-PCR对SsNSRV-1进行检测：A，样品经DNaseI处理后，进行PCR或RT-PCR检测，未经处理的PCR样品作为阴性对照；B，样品经过SI处理后进行RT-PCR检测，核盘菌Actin基因作为阳性对照；C，样品经RNaseA处理后进行RT-PCR检测，核盘菌Actin基因作为阳性对照。相关引物见表3.3。ThenucleicacidsamplesreleasedfromviralparticlesweretreatedwithnucleasesDNaseI,SIandRNaseA,andthensamplesweresubjectedtoPCRorRT-PCTdetectionforSsNSRV-1.PrimerpairsweredesignedbasedonthesequenceofeachORF(Table3.3).A,1%agaroseelectrophoresisofthePCRandRT-PCRproductsofsampletreatedwithDNaseI;B,PCRresultofsamplewithno58 核盘菌新型RNA病毒研究treatmentwithDNaseI;C,RT-PCRresultofsampletreatedwithSInuclease;D,RT-PCRresultofsampletreatedwithRNaseA.TheActingeneofS.sclerotiorumwasusedasthecontrol.图3.13SsNSRV-1缺陷型RNA的克隆与结构Fig.3.13SequencecloningandgenomeorganizationofthedefectiveRNAsA，RT-PCR扩增缺陷型RNA的5’和3’末端；B，缺陷型RNA的基因组结构A,RT-PCRamplificationof5′and3′terminusofdefectiveviralRNAs.B,GenomeorganizationofdefectiveviralRNAsofSsNSRV-1.AdiagramofthegenomicorganizationofSsNSRV-1isshowninthefirstline.图3.14SsNSRV-1核衣壳的特性Fig.3.14CharateristicsofSsNSRV-1nucleocapsidsA，紫外线吸收波谱图，在260nm处有最大的吸收峰表明核酸存在；B，核衣壳直接作为模板进行RT-PCR结果，（引物见表3.3），Marker为DL2000；C，TotalRNA作为模板进行RT-PCR的结果，引物及Marker同B，其中L基因用了三对引物检测。A,Anoptimumabsorptionspectrumat260nmindicatingthepresenceofnucleicacidinRNPs;B,SsNSRV-1RNPsactingasthetemplatesforcDNAsynthesisandPCRdetection;C,TotalRNAactingasthetemplatesforcDNAsynthesisandPCRdetection.59 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文Lgenewasdetectedwiththreeprimerpairs.表3.3SsNSRV-1克隆及分析相关引物Table3.3TheprimersusedforSsNSRV-1cloningandanalysisGenomicProductPrimernamePrimersequence(5'-3')Applicationlocationsize(bp)AH98-p1-FGGACTCGGAAGTGTCATAGAGAACG175-190(1)tomakeProbeI;(2)todetectthegene582expressionofORFI;(3)todetectthepropertyAH98-p1-RCGTCAATTCTACCTTCTTCAAACCTG721-747ofRNA-Nucleoproteincomplexes(RNPs)AH98-p2-FTGCCAAACTGGTTATCGGTGC1143-1164(1)tomakeProbeII;(2)todetectthegene839expressionofORFII;(3)todetectthepropertyAH98-p2-RAGAGTTCCTCCTGCGTATTGTTCC1957-1981ofviralRNAfromAH98AH98-p3-FCTATCGAATAACTGCCAAGACCTCG2174-2199(1)tomakeProbeIII;(2)toconfirmtransfectantsthatwereinfectedbySsNERV-1;721AH98-p3-RGCATGTGATGTCGTAGCGAGTGTG2870-2894(3)todetectthegeneexpressionofORFIII;(4)todetectthepropertyofRNPs98-Gene4-R:AACCAGATGTGACTTCAACTTCTTCG3244-3270(1)tomakeProbeIV;(2)todetectthegene176expressionofORFIV98-Gene4-F：TTGATTTTTACTCGTTTGTCTGCGC3122-3147AH98-p5-F1GAACGTCGTTCTGCGGCTCC3415-3435891todetectthepropertyofRNPsAH98-p5-R1AAGATTTCGTTACGGATTCTGGACC4280-4305AH98-p5-F2ATTTATGGGCGGCGATTCTGG5103-5124(1)tomakeProbeV;(2)todetectthegene873expressionofORFV;(3)todetectthepropertyAH98-p5-R2TCTGTGTTCTAAGGCATAAAGAGGGG5949-5971ofviralRNAfromAH98AH98-p5-F3ATTCTTACCACTTGCGGGAATGC6760-6783940todetectthepropertyofRNPsAH98-p5-R3TGTAAACGGATTCTCACCCACTCTC7674-7699AH98-p5-F4AAGCCAAACGACGCATCTCACC6244-6266722todetectthedistributionofSsNSRV-1AH98-p5-R4CGTCCACGGAGAACGAGCAG6945-6965AH98-P5-F5TTCAAATGGCGGGACAAGGA5552-55721051todetectthedistributionofSsNSRV-1AH98-P5-R5TCGTCCACCAGGCTTCTTTGC6581-6602AGACCACGATACGAAGATAAGAAAGAGAH98-p5-F68146-8174toconfirmtransfectantsthatwereinfectedbyA921SsNERV-1AH98-P5-R6CGGAAACTTCTGTTCGTCGTGC9044-906698-Gene6-R:CGAGGACGGTTTCTGCTTGGTTC9686-9709(1)tomakeProbeVI;(2)todetectthegene358expressionofORFVI98-Gene6-F:ATCGTTTAACTACAATGGAAAGGCG9260-9285AH98-p6-FAGGAGGATGCCTTCGTATAAAGAGAAG9218-9245682todetectthepropertyofRNPsAH98-p6-RCGTGTACCCGTAACCTTGTTCGTCT9875-990098-G1-RC5-1TGATTGCCTTAGTGCTCTCCGTT408-4314135’RACEofORFI98-G1-RC5-2CCGTTAAAAGAGCTGCACTCGAAG389-41398-G2-RC5-1:CTCGGCTTCGCTGGCATCTT1281-13013405’RACEofORFII98-G2-RC5-2CAGACGGGACATGACTAAATCGAG1257-128198-G3-RC5-1CGATCCCATTGATCCCGAGTC2561-25824145’RACEofORFIII98-G3-RC5-2CCCGAGTCTGACATATGTAGTCCAT2544-257998-Gene4-RAACCAGATGTGACTTCAACTTCTTCG3244-3270(1)5’RACEofORFIV;(2)toclonedefective165RNAs98-G4-RC5-2GACTTCAACTTCTTCGAATTCACCAT3234-326098-G5-RC5-1GTTCCCCATTTCTTAAACGCACAT3793-3817(1)5’RACEofORFV;(2)toclonedefective519RNAs98-G5-RC5-2CGCACATAATTCCGAGCGGT3780-380098-G6-RC5-1GCATCCCTCAATAAAGATACCGC9515-95383105’RACEofORFVI98-G6-RC5-2CCCTCAATAAAGATACCGCATTAAAT9508-953498-G1-RC3-1GAAGCATTAGTTCACTCCCAAGGTC459-4843273’RACEofORFI98-G1-RC3-2CAAGATCAGAATTCTGCACTCCG501-52498-G2-RC3-1GTTATGTTTCGTCTTACTTTTGGGGC1678-17043663’RACEofORFII98-G2-RC3-2GGGCATCCCTAAGTCCTCTCTTG1700-172360 核盘菌新型RNA病毒研究98-G3-RC3-1ATGTCAGACTCGGGATCAATGGG2556-25773983’RACEofORFIII98-G3-RC3-2GGGATCGGGAAATACTAACATCAC2574-259898-Gene4-F：TTGATTTTTACTCGTTTGTCTGCGC3122-31471493’RACEofORFIV98-G4-RC3-2CTCGTTTGTCTGCGCACTAGTTT3132-315598-G5-RC3-1GTCCTACGCTGGTCTTTTCTCTATGTG8780-88073673’RACEofORFV98-G5-RC3-2GAGAATCAAGTATCAGATGTCGTCCTC8812-883998-G6-RC3-1CTGCAAACTCAGTTAAATAATCCGC9337-93623703’RACEofORFVI98-G6-RC3-2CCGCAAAAAGAACTCGATGAATT9358-9381AH98-RC3-R1GGTAGCTGCTGTCAATCGCTC664-685>677toclonegenometerminiAH98-RC3-R2CTGTCAATCGCTCAACTAATCCTG653-677AH98-RC5-F1CCTCAATTTCAATTACCCGCGC9433-9455(1)toclonegenometermini;(2)toclone>441AH98-RC5-F2TTCGGACATTCCATCCAAACCT9561-9583defectiveRNAsTAGAGACCGAGGCGGCCGACATGTTTTGCDSIII-1TTTTTTTTTCTTTTTTTTTTVNCDSIII-2GACCGAGGCGGCCGACATG5’and3’RACECDSIII-3CGAGGCGGCCGACATGTTTGGATCCCGGGAATTCGGTAATACGACTCPC3-T7loopACTATATTTTTATAGTGAGTCGTATTAPC2-1CGTATTACCGAATTCCCGGGterminideterminationofgenomePC2-2CCGAATTCCCGGGATCC表3.4PMF分析SsNSRV-1病毒粒子提取液中的蛋白Table3.4PeptidemassfingerprintinganalysisofproteinsfromvirionspreparationsAminoacidsequenceObservedCalculated±PutativePositioIonsFrequencyMassMassdeltaORFnscorep43proteinALVMSSIVDK1077.571077.57-0.002ORFⅡ224-2378.6518ALVMSSIVDKDDPMVSGTQR2164.052164.05-0.0043ORFⅡ3224-24115.4616DKDTYGVNIEANR1493.711493.71-0.003ORFⅡ314-26107.328DRLPTIDLTR1198.661198.67-0.0046ORFⅡ27-3680.879DTSAEIK762.38762.380.0019ORFⅡ95-10143.182DTSAEIKNWVISR1517.791517.780.0014ORFⅡ95-10766.631DTYGVNIEANR1250.581250.59-0.005ORFⅡ16-2683.2412EAAEETVPEAPAQ1340.611340.61-0.0011ORFⅡ363-37104.8511EFSDLETEYFAAAHALQR2096.982096.98-0.0036ORFⅡ5276-2981.546EKLIALLNIR1181.751181.7580.0047ORFⅡ3353-3647.284FLDTSTK810.41810.41-0.002ORFⅡ2294-3037.374FSHVPSEDASEAELPALPNSCVPK2580.212580.22-0.0106ORFⅡ0108-1358.751INKTFNSIIR1205.691205.6810.012ORFⅡ1212-2230.671LANVFKDTSAEIK1434.761434.77-0.011ORFⅡ189-101531LPTIDLTR927.54927.54-0.0003ORFⅡ29-3655.2534LTFGASLSPLLLITK1572.941572.95-0.0052ORFⅡ251-2669.6116LVIGAMISASGVNYSTAR1808.941808.95-0.0007ORFⅡ571-88141.139MFYVMFR1008.451008.46-0.0028ORFⅡ244-2542.4916NAISQFMPSGELK1420.71420.7-0.0049ORFⅡ0183-1986.5842NWVISR773.42773.42-0.0022ORFⅡ5102-1030.3413QPSPENLDAFNLK1471.731471.73-0.0055ORFⅡ7168-18117.6851QPSPENLDAFNLKR1628.831628.820.01666ORFⅡ0168-1886.472RNAISQFMPSGELK1593.781593.780.0002ORFⅡ1182-1951.774RTIPDVFK974.55974.55-0.004ORFⅡ56.0-1324.691TFNSIIR849.47849.47-0.0015ORFⅡ215-2246.6421TFNSIIRDR1120.621120.680.0224ORFⅡ1215-2233.652TIPDVFK818.45818.450.0008ORFⅡ37.0-1340.0128TIPDVFKDK1061.571061.58-0.003ORFⅡ7.0-1535.371VFTDNSPYLSHAVLSK1776.911776.90.00097ORFⅡ196-21114.8518161 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文VIFGSAYIPIDR1349.741349.730.0011ORFⅡ307-31100.6939YPQFFR856.42856.42-0.000ORFⅡ8270-2738.328IVELTQKER1114.591114.632-0.040ORFⅤ5539-5414.12167p41proteinALVMSSIVDK1061.571061.58-0.008ORFⅡ224-2357.34493ALVMSSIVDKDDPMVSGTQR2180.032180.05-0.012ORFⅡ224-2497.35413DKDTYGVNIEANR1493.711493.71-0.005ORFⅡ14-2644.4431DRLPTIDLTR1198.661198.67-0.008ORFⅡ27-3621.9532DTYGVNIEANR1250.581250.59-0.008ORFⅡ16-2660.8837EAAEETVPEAPAQ1340.61340.61-0.008ORFⅡ363-3729.5675EFSDLETEYFAAAHALQR2096.972096.98-0.008ORFⅡ276-2966.41193EKLIALLNIR1181.741181.75-0.011ORFⅡ353-3637.07172FLDTSTK810.42810.410.004ORFⅡ294-3015.9920LIALLNIR924.61924.61-0.004ORFⅡ355-3648.51172LPTIDLTR927.53927.54-0.006ORFⅡ29-3629.1271LTFGASLSPLLLITK1572.941572.95-0.007ORFⅡ251-2685.58365MFYVMFR1024.441024.45-0.008ORFⅡ244-2519.79410NAISQFMPSGELK1436.691436.7-0.011ORFⅡ183-1966.551475NWVISR773.41773.42-0.003ORFⅡ102-1024.69687QPSPENLDAFNLK1471.721471.73-0.011ORFⅡ168-18114.41050RNAISQFMPSGELK1593.781593.780.001ORFⅡ182-1918.5815TFNSIIR849.47849.47-0.005ORFⅡ215-2228.071111TIPDVFK818.45818.45-0.002ORFⅡ7.0-1324.3579VFTDNSPYLSHAVLSK1776.891776.9-0.012ORFⅡ196-2144.1351VIFGSAYIPIDR1349.721349.73-0.009ORFⅡ307-3157.38578YPQFFR856.42856.42-0.005ORFⅡ270-2717.06335LLESLIK814.48814.52-0.035ORFⅤ509-5120.2415viruscrudepreparationsDRLPTIDLTR1198.66171198.667-0.005ORFⅡ27-3621.6913VIFGSAYIPIDR1349.72771349.7343-0.006ORFⅡ319-3040.78266NAISQFMPSGELK1420.69411420.702-0.008ORFⅡ183-1931.4825QPSPENLDAFNLK1454.69711454.7041-0.007ORFⅡ168-1858.8830LTFGASLSPLLLITK1572.94151572.9491-0.007ORFⅡ251-2659.31165VFTDNSPYLSHAVLSK1776.89621776.9046-0.008ORFⅡ196-2179.74241LVIGAMISASGVNYSTAR1808.9261808.9454-0.019ORFⅡ71-8843.2724EFSDLETEYFAAAHALQR2096.96932096.9803-0.011ORFⅡ276-29109.0633ALVMSSIVDKDDPMVSGTQR2148.04332148.0555-0.012ORFⅡ224-2473.21523FSHVPSEDASEAELPALPNSCVPK2580.19692580.2166-0.019ORFⅡ108-1314.73271QTTADAISAASADLR1489.73151489.7372-0.005ORFⅠ156-1768.9170NIFPSSAALLTESTK1577.82091577.8301-0.009ORFⅠ93-10755.5822VEIQACHSSVSLHK1593.78661593.7933-0.006ORFⅠ142-1538.08275LTAATNNILSMYPEELK1906.96471906.971-0.006ORFⅠ190-2059.011INALEALVHSQGQQISDLQDQNSA2847.42752847.4475-0.023ORFⅠ6116-143.091LR120%sugrosegradientcomponentsDRLPTIDLTR1198.6611198.667-0.006ORFⅡ27-3612.612VIFGSAYIPIDR1349.7261349.7343-0.008ORFⅡ319-3028.55136NAISQFMPSGELK1420.69311420.702-0.008ORFⅡ183-1966.14295QPSPENLDAFNLK1454.69581454.7041-0.008ORFⅡ168-1814.12440DKDTYGVNIEANR1493.70441493.711-0.006ORFⅡ14-2625.0616LTFGASLSPLLLITK1572.94141572.9491-0.007ORFⅡ251-2690.24175QPSPENLDAFNLKR1610.79751610.8053-0.007ORFⅡ168-1847.07181VFTDNSPYLSHAVLSK1776.89251776.9046-0.012ORFⅡ196-2172.36311LVIGAMISASGVNYSTAR1808.93451808.9454-0.010ORFⅡ71-8828.0459EFSDLETEYFAAAHALQR2096.9692096.9803-0.011ORFⅡ276-2946.81433ALVMSSIVDKDDPMVSGTQR2148.04012148.0555-0.015ORFⅡ224-2450.1643FSHVPSEDASEAELPALPNSCVPK2580.20232580.2166-0.014ORFⅡ108-1329.9423125%sugrosegradientcomponentsDRLPTIDLTR1198.66111198.667-0.005ORFⅡ27-362.6919VIFGSAYIPIDR1349.73081349.7343-0.003ORFⅡ319-3048.55156NAISQFMPSGELK1420.69411420.702-0.008ORFⅡ183-1954.251562 核盘菌新型RNA病毒研究QPSPENLDAFNLK1454.69741454.7041-0.006ORFⅡ168-1810.42380LTFGASLSPLLLITK1572.93911572.9491-0.01ORFⅡ251-2673.4915LVIGAMISASGVNYSTAR1808.93361808.9454-0.011ORFⅡ71-8843.1139EFSDLETEYFAAAHALQR2096.96962096.9803-0.010ORFⅡ276-2968.86273ALVMSSIVDKDDPMVSGTQR2148.03652148.0555-0.019ORFⅡ224-2447.5513FSHVPSEDASEAELPALPNSCVPK2580.19422580.2166-0.022ORFⅡ108-1313.233413.4.8SsNSRV-1的系统发育分析选取单股负义链RNA病毒目（Mononegavirales）每个科中典型的成员，用保守的RdRp序列进行多重序列比对和系统发育分析。蛋白序列多重比对表明，SsNSRV-1含有MononegavirusesRdRp中四个保守的motif（图3.15A）。系统发育分析表明，Mononegaviruses分为四个簇，其中丝状病毒科（Filoviridae）与肺病毒亚科（Pneumoviridae）聚为一簇，寄主主要是脊椎动物，副粘液病毒亚科单独形成一簇，寄主也是脊椎动物，弹状病毒科（Rhabdoviridae）形成IV簇，寄主包括脊椎动物和植物，而真菌单股负义链RNA病毒SsNSRV-1与Nyamiviridae以及博尔纳病毒科（Bornaviridae）形成III簇，寄主范围包括脊椎动物、线虫，真菌，并且I簇和II簇的亲缘关系较近，而III簇和IV簇的亲缘关系较近。因此，III簇和IV簇的寄主范围趋向多样性，而I簇和II簇的寄主目前看来还比较单一。从系统发育树来看，SsNSRV-1与Bornaviruses以及Nyamiviruses亲缘关系最近，但是从基因组结构特点上来看，SsNSRV-1与Bornaviruses和Nyamiviruses有很大的差别（图3.5）。图3.15SsNSRV-1L蛋白的多重序列比对及系统发育分析Fig3.15MutiplealignmentandphylogeneticanalysisofSsNSRV-1LproteinA,SsNSRV-1L蛋白含有Mononegaviruses四个保守的motif（motifI-VI），“*”表示氨基酸完全63 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文相同，“：”表示氨基酸保守，红色虚线表示SsNSRV-1；B，SsNSRV-1系统发育分析，SsNSRV-1在进化树中的位置用标示，Mononegaviruses可以分为I-VI四个cluster。(A)AminoacidsequencealignmentofcoreRdRpmotifsofSsNSRV-1andselectedvirusesfromMononegavirales.Theasterisksindicateidenticalaminoacidresiduesandthecolonsrepresentchemicallysimilaraminoacidresidues.Identicalandchemicallyhighlysimilaraminoacidresiduesareshadedingreen,andred,dottedhorizontallineshowsSsNSRV-1.(B)PhylogeneticanalysisofSsNSRV-1.AphylogramofthecoreRdRpmotifsofSsNSRV-1andtheselectedmononegavirusesfromFiloviridae,Pneumoviridae,Paramyxoviridae,Bornaviridae,Nyamiviridae,andRhabdoviridaefamiliesareshown.ThepositionofSsNSRV-1isindicatedwitharedstar.AbbreviationsofvirusnamesandviralproteinaccessionnumbersusedinphylogeneticanalysiswerelistedinTable3.5.BO,Bornaviridae;FI,Filoviridae;NY,Nyamiviridae;PA,Paramyxoviridae;PN,Pneumoviridae;RH,Rhabdoviridae.表3.5用来进行基因组结构比较、多重比对以及系统发育分析的MononegavirusesTable3.5Mononegairusesselectedforgenomecomparison,multiplealignmentandphylogeneticanalysisVirusFamilyGenusVirusnameAbbreviationAccessionno.FiloviridaeZaireebolavirusZeboVNP_066251.1MarburgvirusMarVYP_001531159.1PneumoviridaePneumovirusHumanrespiratorysyncytialvirusHRSVNP_056866.1PneumoniavirusofmicePVMYP_173335.1MetapneumovirusAvianmetapneumovirusAMPVYP_443845.1HumanmetapneumovirusHMPVYP_012613.1MorbillivirusCaninedistempervirusCDVNP_047207.1ParamyxoviridaeHenipavirusNipahvirusNiVNP_112028.1RubulavirusMumpsvirusMuVNP_054714.1Avianparainfluenzavirustypes4APMV4AFP89384.1TiomanvirusTioVNP_665871.1AvulavirusNewcastlediseasevirusNDVAFH08721.1UnassignedFerdeLancevirusFDLVNP_899661.1JvirusJVYP_338085.1BornaviridaeBornavirusBornadiseasevirusBDVNP_042024.2AvianbornavirusABV2ADU05398.1RhabdoviridaeNovirhabdovirusInfectioushemorraghicnecrosisvirusIHNVNP_042681.1ViralhemorrhangicsepticemiavirusVHSVNP_049550.1LyssavirusRabiesvirusRabVBAL49594.1VesiculovirusVesicularstomatitisIndianavirusVSIVNP_041716.1EphemerovirusBovineephemeralfevervirusBEFVNP_065409.1CytorhabdovirusLettucenecroticyellowsvirusLNYVYP_425092.1SoybeancystnematodemidwayScNVAEF56729.1virusNyamiviridaeNyavirusMidwayvirusMIDMVYP_002905331.1NyamaninivirusNYMVYP_002905337.1Segmentednegative-strandedRNAvirusesDichorhabdoviruOrchidfleckvirus(RNA2)OFVYP_001294929sLettucebig-veinassociatedvirusVaricosavirusLBVaVYP_002308576(RNA1)64 核盘菌新型RNA病毒研究3.4.9SsNSRV-1的生物学特性通过PEG介导的病毒粒子转染原生质体方法，SsNSRV-1成功侵染了强毒菌株Ep-1PNA367（图3.16G）。感染了SsNSRV-1的菌株Ep-1PNA367-PT2（A367-PT2）、Ep-1PNA367-PT12（A367-PT12），菌落色素减少，菌核形成受到很大影响，不产菌核或只有少量的菌核形成（图3.16A）；菌丝尖端形态观察表明，SsNSRV-1能够显著影响菌株Ep-1PNA367的生长极性，菌丝尖端发生严重的弯曲（图3.16B）；SsNSRV-1能够显著降低核盘菌的致病力，感染SsNSRV-1的核盘菌在离体的油菜叶片上丧失了致病力（图3.16C）；A367-PT2、A367-PT12的生长速度约为0.9cm/d，显著低于对照菌株Ep-1PNA367（约2.3cm/d）（图3.16D），同时，A367-PT2、A367-PT12的菌丝鲜重显著低于对照菌株Ep-1PNA367（图3.16E）。而pH值测定表明，菌株A367-PT2、A367-PT12发酵液中的pH值约为2.8，显著低于对照菌株Ep-1PNA367发酵液的pH值（约为3.9），表明菌株A367-PT2、A367-PT12仍然能够产生较多的酸性物质。65 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文图3.16SsNSRV-1生物学特性Fig.3.16ThebiologicalpropertitiesofSsNSRV-1A，PDA培养基上菌落形态（20℃，10d）；B，菌丝尖端形态观察；C，致病力测定采用离体油菜叶片；D，生长速度测定（5个样本重复，显著水平p<0.05）；E，菌丝鲜重测定（5个样本重复，显著水平p<0.05）；F，产酸能力测定（5个样本重复，显著水平p<0.05）；G，SsNSRV-1转染子的RT-PCR验证。Ep-1PNA367-PT2、-PT12简写为A367-PT2、-PT12。A,ThecolonialmorphologyonPDA(20℃,10d);B,Microscopicobservationofhyphaltipmorphology;C,Virulencetestondetachedleavesofrapeseed;D,Growthratetest;E,Mycelialfreshweighttest;F,ThepHvaluetest;G,RT-PCRdetectionforSsNSRV-1intransfectants;ErrorbarsindicatetheSDfromfivesamplemeans.MeansfollowedbythedifferentlettersonthetopofeachcolumnaresignificantlydifferentattheP<0.05levelofconfidenceaccordingtoDuncan’smultiplerangetest.StrainsEp-1PNA367-PT2、-PT12werelabeledwithA367-PT2、-PT12,respectively.3.4.10SsNSRV-1的分布收集自湖北省、安徽省、江西省、陕西省和黑龙江省采集的50株异常的菌株，用SsNSRV-1的特异性引物进行RT-PCR检测，发现SsNSRV-1在多个菌株中存在（图3.17）。其中包括湖北省2株、安徽省1株、江西省2株、陕西省1株、黑龙江省1株，共计7个菌株。这些省份的气候和环境多有不同，例如，黑龙江省位于中国最北部，而江西省位于中国的南部，这两个省份的环境气候差异巨大。另外，菌株HLJ-048采自发病的大豆上，而其它菌株均采自发病的油菜上。因此，SsNSRV-1在自然界中有广泛的分布。图3.17SsNSRV-1的自然分布核盘菌菌株中检测SsNSRV-1的存在，两对引物均设计在SsNSRV-1的L基因上（见表3.3），菌株Ep-1PNA367和1980作为阴性对照，核盘菌的Actin基因作为内参，菌株信息见表3.1。Fig.3.17NaturaldistributionofSsNSRV-1RT-PCRdetectionofSsNSRV-1inindividualisolatescollectedfromsomeprovincesinChina.TheS.sclerotiorumstrainsEp-1PNA367and1980wereusedasnegativecontrols.Theprimersusedare66 核盘菌新型RNA病毒研究AH98-p5-F4/AH98-p5-R4andAH98-p5-F5/AH98-p5-R5.ThepredictedlengthsoftheRT-PCRproductsforSsNSRV-1are722ntsand1051nts,respectively.TheActingenewasusedasaninternalcontrolandtheinformationofSsNSRV-1-infectedstrainswerelistedinTable3.1.3.4.11SsNSRV-1的转录组分析无毒菌株Ep-1PNA367和SsNSRV-1侵染的菌株Ep-1PNA367-PT2在PDA培养基上培养3d，收集菌丝，通过RNA-seq筛选差异表达的基因。其中菌株Ep-1PNA367产生了46630968个cleanreads，与已测序的核盘菌菌株1980基因组匹配86.61%，完全没有匹配到1980基因组的cleanreads有6244456个，占所有测得总数的13.39%，匹配到菌株1980的基因有52.18%，鉴定出表达的基因共有12591个，有283个新的转录本，发生可变剪切的基因有5410个；菌株Ep-1PNA367-PT2得到了46633024个cleanreads，与测序的核盘菌菌株1980基因组匹配83.76%，完全没有匹配到基因组的cleanreads数有7571027个，占所测得总数的16.24%，匹配到菌株1980的基因有50.06%，鉴定出表达的基因共有12669个，有296个新的转录本，发生可变剪切的基因有5422个（表3.6，表3.7，表3.8）。筛选到受SsNSRV-1侵染差异2倍以上的基因（differentialexpressiongenes，DEGs）有1791个（FDR≤0.001AND|log2Ratio|≥1），其中上调的基因有915个，下调的基因有876个；差异2-4倍（1≤|log2Ratio|≤2）的基因有1381个，其中上调的基因有792个，下调的基因有579个；差异4-8倍（2≤|log2Ratio|≤3）的基因有173个，其中上调的基因有92个，下调的基因有181个；差异8倍以上（|log2Ratio|≥3）的基因有147个，其中上调的基因有31个，下调的基因有116个（图3.18），因此可以看到病毒侵染后核盘菌显著变化的基因主要表现为下调，即受到病毒的抑制。通过分析核盘菌感染SsNSRV-1后变化最显著的30个代表基因发现，在这30个基因中下调的有26个，上调的仅有4个（表3.9）。下调的基因包括脱氢酶类、抗药性蛋白、MFS转运蛋白、多肽合成酶、肽酶、氧化还原酶、甲基转移酶以及一些假定蛋白等。为进一步阐明受SsNSRV-1影响的基因功能差异，将得到的这些DEGs进行GO富集分类，GO富集分类共分为三个本体，分别是分子功能（molecularfunction）、细胞成分（cellularcomponent）和生物过程（biologicalprocess）。根据筛选条件（校正的pvalue<0.05），我们得到基于细胞成分显著富集的只有核糖体（46个基因）；基于分子功能显著富集的有10类，包括氧化还原酶活性（200个）、水解酶活性（57个）、蛋白结合（76个）、核糖体结构组分（40个）、胆碱脱氢酶活性（12个）等；与生物学过程有关显著富集的有10类，包括氧化还原过程（198个）、细胞氨基酸生物合成（39个）、单一有机体代谢（299个）、有机酸生物合成（138个）67 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文等（图3.19）。Pathway富集分析采用超几何分布的算法，以Qvalue<0.05为标准筛选到13个显著富集的代谢途径，包括核糖体合成通路（56个基因）、代谢通路（398）、戊糖和葡萄糖醛酸内部转化（26个）、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（28个）等（表3.10）。表3.6样品RNA-seq分析的原始结果Table3.6TherawdataofRNA-seqanalysisofeachsampleSampleNameCleanGenomeGeneExpressedNovelAlternativeGeneSNPreadsmapmapGeneTranscriptsSplicingFusionEp-1PNA3674663096886.61%52.18%12591283541027820-1Ep-1PNA367-PT24663302483.76%50.06%12669296542227647-1表3.7菌株Ep-1PNA367产生的reads与测序菌株1980基因组的比对结果及统计Table3.7AlignmentstatisticsoftherawreadsgeneratedfromstainEp-1PNA367MaptoGenomeMaptoGeneNumberPercentageNumberPercentageTotalReads46630968100.00%46630968100.00%TotalBasePairs4196787120100.00%4196787120100.00%TotalMappedReads4038651286.61%2433006352.18%perfectmatch3027875664.93%1832572239.30%<=5bpmismatch1010775621.68%600434112.88%uniquematch3866436382.92%2413076151.75%multi-positionmatch17221493.69%1993020.43%UnmappedReads624445613.39%2230090547.82%表3.8菌株Ep-1PNA367-PT2产生的reads与测序菌株1980基因组的比对结果及统计Table3.8AlignmentstatisticsoftherawreadsgeneratedfromstainEp-1PNA367-PT2MaptoGenomeMaptoGeneNumberPercentageNumberPercentageTotalReads46633024100.00%46633024100.00%TotalBasePairs4196972160100.00%4196972160100.00%TotalMappedReads3906199783.76%2334573350.06%perfectmatch2951337863.29%1772269038.00%<=5bpmismatch954861920.48%562304312.06%uniquematch3763974980.71%2316627649.68%multi-positionmatch14222483.05%1794570.38%UnmappedReads757102716.24%2328729149.94%68 核盘菌新型RNA病毒研究图3.18Ep-1PNA367被SsNSRV-1侵染后表达上调和下调的基因Fig.3.18ComparisonofexpressionofthemappedgenesbetweenstrainEp-1PNA367andSsNSRV-1-infectedEp-1PNA367表3.9核盘菌感染SsNSRV-1后显著变化的代表基因Table3.9RepresentativeS.sclerotiorumgenesexhibitingsignificantdifferentialexpressionlevelsGeneLeA367A367NVlog2GeneIDRegulationSeq.Descriptionngth-expressionexpressionRatio15-hydroxyprostaglandinSS1G_08137148016780-15.52DowndehydrogenaseSS1G_0408913827963-7.99Downpredictedproteinl-aminoadipate-semialdehydeSS1G_00729339343340238-7.45DowndehydrogenaseSS1G_1198820901779071002-7.41DowncholinedehydrogenaseSS1G_09097468163414-6.81DownpredictedproteinNADP-dependentalcoholSS1G_10803130876149718-6.67DowndehydrogenasemultidrugresistanceproteinSS1G_0409023852062-6.63Downcdr1SS1G_03247184025181254-6.57DownMFSmultidrugtransporterSS1G_109563542963-6.57DownhypotheticalproteinnonribosomalpeptideSS1G_13186147920403212-6.53Downsynthetase12SS1G_005131587632670-6.44Downglycosidehydrolaseproteinglycosidehydrolasefamily18SS1G_08695132810454118-6.41DownproteinSS1G_093651345311542-6.15DownhypotheticalproteinSS1G_091692686562882-6.04Downhypotheticalproteincytochromep450SS1G_04088171974412-5.90Downoxidoreductaseprotein69 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文SS1G_02084127121085.81UppredictedproteinSS1G_0417713713216845.78Upendopolygalacturonase5SS1G_04830492992-5.57Downhypotheticalproteinc2h2transcriptionfactorSS1G_135491539311367-5.48DownproteinSS1G_085666661323-5.40DownhypotheticalproteinSS1G_07116150612119277-5.39DownhypotheticalproteinSS1G_070192906199547-5.35Downpeptidases41familyproteinproteinrelatedtoplantSS1G_087064058956216-5.31DownexpansinscarboxylesterasefamilySS1G_08747441112041195.16Upprotein(secretedprotein)methyltransferaseSS1G_04080104772820-5.13Downdomain-containingproteinSS1G_02025813138642-4.99DownhypotheticalproteinSS1G_1119712581505-4.85DownpredictedproteinmybfamilytranscriptionSS1G_04107986123742-4.82Downfactormonooxygenasefad-bindingSS1G_085621410115840-4.80DownproteinSS1G_14321124341064.79Uphypotheticalprotein图3.19差异表达基因GO功能基因注释（pvalue<0.05）Table3.19FunctionalcategorizationofGOtermsinDEGswithpvalue<0.05.70 核盘菌新型RNA病毒研究表3.10KEGGpathway富集分析差异基因Table3.9KEGGpathwayenrichmentanalysisofDEGsDEGswithpathwayAllgenesPathwayKEGGPathwayPvalueQvalueannotation(1066)annotation(6675)IDRibosome56(5.25%)140(2.1%)4.54E-124.76E-10ko03010Metabolicpathways398(37.34%)1960(29.36%)5.66E-102.97E-08ko01100Pentoseandglucuronate26(2.44%)65(0.97%)2.62E-069.16E-05ko00040interconversionsGlycine,serineand28(2.63%)82(1.23%)3.73E-059.80E-04ko00260threoninemetabolismStarchandsucrose88(8.26%)374(5.6%)5.89E-051.24E-03ko00500metabolismSteroidbiosynthesis24(2.25%)69(1.03%)9.49E-051.66E-03ko00100Biosynthesisof191(17.92%)978(14.65%)0.00071.06E-02ko01110secondarymetabolitesValine,leucineand9(0.84%)18(0.27%)0.00081.06E-02ko00290isoleucinebiosynthesisTryptophan30(2.81%)112(1.68%)0.00222.39E-02ko00380metabolismHistidinemetabolism21(1.97%)70(1.05%)0.00222.39E-02ko00340Linoleicacid18(1.69%)58(0.87%)0.00302.90E-02ko00591metabolismFructoseandmannose24(2.25%)88(1.32%)0.00464.04E-02ko00051metabolismTyrosinemetabolism23(2.16%)84(1.26%)0.00524.20E-02ko00350图3.20核糖体组装相关通路Fig.3.20TheribosomepathwayinKEGGdatabase71 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文红色方框表示涉及到该成分的基因上调表达，绿色方框表示涉及到该成分的基因下调表达。Theredboxesindicatethegeneswereup-regulatedandthegreenboxindicatesthegenesweredown-regulated.3.5讨论3.5.1真菌负义链RNA病毒非逆转录RNA病毒的基因组能够整合到真核生物的基因组中，即病毒的内生化，前人研究中发现这种现象普遍存在（(Belyietal.,2010;Chibaetal.,2011;Fortetal.,2012;Horieetal.,2010;KatzourakisandGifford,2010;Liuetal.,2010;Tayloretal.,2010,2011)。首先引起关注的现象是发现单股负义链RNA病毒Bornavirus的N基因存在于人、灵长类动物、啮齿类动物和大象的基因组中（Horieetal.,2010）。Taylor等2011年也发现单股负义链RNA病毒Filovirus的N蛋白和VP35存在于蝙蝠的基因组中。后来的研究发现单股负义链RNA病毒的基因组序列广泛存在于高等脊椎动物中，并且N蛋白的同源序列最多（Horieetal.,2011），因此单股负义链RNA病毒具有广泛的内生化现象。Kondol等（2013）在豌豆白粉菌（Erysiphepisi）的基因组中发现了类似于单股负义链RNA病毒NyamaninivirusL蛋白的序列，说明了真菌-ssRNA病毒早期可能存在并发生内生化现象，此外还在草坪币斑病菌（Sclerotiniahomoeocarpa）的转录组数据库（transcriptomeshotgunassemblylibraries，TSA）中鉴定出了3条与Nyamaninivirus的L蛋白具有显著相似的序列，从而说明真菌中可能存在-ssRNA病毒。然而，真菌中是否存在-ssRNA病毒，-ssRNA真菌病毒的基因组结构特点、病毒粒子结构及形态、转录策略以及进化地位等问题仍然没有解决。我们首次在核盘菌（S.sclerotiorum）菌株AH98中发现和鉴定了一个-ssRNA病毒SsNSRV-1，克隆了该病毒的基因组全长，并对SsNSRV-1的分子特性、生物学特性、进化地位以及自然分布进行了比较详细的研究。3.5.2SsNSRV-1病毒粒子形态及核衣壳特性目前发现的单股负义链RNA病毒目（Mononegavirales）成员均有病毒粒子，并且都具有包膜结构（envelop），这种包膜来自寄主的磷脂双分子膜，但是病毒粒子形态具有多态性。即使同一个科的成员，病毒粒子的形态差异也很大，例如副粘液病毒（Paramyxoviruses）（Lambetal.,2007）。SsNSRV-1似乎也具有包膜结构的病毒粒子，病毒粒子呈丝状，类似于Ebolavirus的病毒粒子。由于不能直接观察到病毒粒子的内部结构，因此推定SsNSRV-1一定存在一种类似于包膜的结构（图3.10A）。而且，我们在菌株AH98和Ep-1PNA367-PT2的菌丝切片中均观察到了具有包膜的72 核盘菌新型RNA病毒研究病毒粒子类似的结构（EVLS）（图3.11）。病毒粒子包膜结构受到损坏时，螺旋状的核衣壳就会释放出来（图3.10A）。但是SsNSRV-1核衣壳的组装方式与Ebolavirus不同，SsNSRV-1在包膜中以螺旋形式进行组装的（图3.10A），而Ebolavirus的核衣壳在包膜中呈线性排布（Ellisetal.,1978）。尽管SsNSRV-1的病毒粒子形态与已知的Mononegaviruses都不同，但是SsNSRV-1的核衣壳形态和结构特性几乎与所有的Mononegaviruses相同，例如核衣壳均呈螺旋状的结构，有多种构象，可以观察到N蛋白的单体，且可以作为复制和转录的模板等。因此，Mononegaviruses的核衣壳具有十分保守的结构和特性，有助于这一类病毒的复制、转录以及病毒粒子的组装，并进一步调整和适应寄主细胞内的微环境。3.5.3SsNSRV-1基因组结构特性及基因功能特性在基因组结构上，SsNSRV-1与已知的Mononegaviruses有较大的差别，并不遵循Mononegaviruses经典的N-P-G-M-L基因结构模型（图3.5）。目前研究发现SsNSRV-1具有6个ORF，经过Northernblot、5’RACE和3’RACE验证，这6个ORF真实存在并且表达（图3.5、图3.7、图3.8）。SsNSRV-1的N蛋白由ORFII编码而不是ORFI，并且N蛋白可能有2种形式，即p43和p41（图3.10G，表3.4）。Bornavirus和Marburgvirus的N蛋白也发现具有两种形态，Marburgvirus的N蛋白有94KDa和92KDa两种形态（p94和p92），且p94经过磷酸化修饰而p92未经过磷酸化修饰（Beckeretal.,1994）；Bornavirus的N蛋白根据大小分为p40和p38两种形式，p38是通过N基因内部的编码起始位点形成的，其N端少了13个氨基酸，这13个氨基酸在p40中是一个核定位信号，帮助Bornavirus进入到细胞核中进行复制和翻译（Kobayashietal.,1998）。SsNSRV-1的ORFIV与Mononegaviruses的G蛋白位置对应，但是ORFIV很小，只有186nt，且编码的蛋白缺少信号肽、跨膜结构域、胞内功能域以及胞外功能域，而这些功能域在病毒的G蛋白中是普遍存在的（Stevenetal.,2006）。在弹状病毒（Rhabdoviruses）中，G蛋白在病毒侵入过程中可以通过改变自身的构象，引起细胞膜结构的重排，使病毒的包膜和细胞膜融合，进而帮助病毒完成侵染过程（Albertinietal.,2012）。但是考虑到真菌这一低等的真核生物结构和特点，SsNSRV-1可能根本就没有G蛋白，即真菌病毒的一些结构和功能在进化过程中可能会发生丢失，从而使自己的结构更为简单，功能也更为高效。真菌病毒尽管在进化关系上与一些动物或植物病毒很近，但是会“删掉”一些“多余”的基因，包括外壳蛋白（Coatprotein）和运动蛋白（Movementprotein）（Preisigetal.,2000;Xieetal.,2006;Liuetal.,2009）。另外，在SsNSRV-1的L基因后，还存在另外一个ORF（ORFVI），这一个基因在Kondo等(2013)鉴定的Lprotein-like的序列73 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文ShTSA1-3L中也存在（图3.6A），但是它们之间没有序列上的相似性，具体功能也未知。同时，我们也发现SsNSRV-1的N蛋白与ShTSA1-L的ORFI以及ShTSA3-L的ORFII在氨基酸序列上具有显著相似性（图3.6B），因此可以推定，真菌单股负义链RNA病毒的N蛋白和L蛋白很保守，而其它的基因功能趋向分化。3.5.4SsNSRV-1分类地位思考目前，单股负义链RNA病毒目（Mononegavirales）包括5个科，系统发育分析SsNSRV-1与Bornaviruses以及Nyamiviruses的亲缘关系最近（图3.15B），考虑到SsNSRV-1的分子特性及病毒粒子结构和形态，SsNSRV-1应属于Mononegavirales，但是SsNSRV-1在基因组结构和病毒粒子的形态及结构上又表现出自己的特殊性，因此我们已经建议成立一个新的真菌单股负义链RNA病毒科核盘菌单股负义链RNA病毒属MymonaviridaeSclerotimonavirus来容纳SsNSRV-1以及将来发现的真菌单股负义链RNA病毒，该提议已经被国际病毒分类委员会（ICTV）受理审议。3.5.5SsNSRV-1弱毒特性及生防潜力SsNSRV-1的病毒粒子在PEG介导的作用下能够侵染核盘菌的原生质体，该病毒可以引起核盘菌的毒力衰退，并且显著减慢核盘菌的生长速度，影响核盘菌的菌核形成能力（图3.16A、C、D、E），但是并不影响核盘菌的产酸能力（图3.16F）。核盘菌在生长过程中能够产生大量的酸性物质，其中主要是草酸（oxalicacid），有报道表明草酸在核盘菌致病过程中是必需的致病因子（Williamsetal.,2011）。感染SsNSRV-1的核盘菌仍然具有较强的产酸能力，但是并能够致病，因此可以推定核盘菌除草酸外，还有多种独立的致病机制。我们通过对峙培养以及用病毒粒子直接侵染核盘菌探讨SsNSRV-1水平传播的能力，发现该病毒的传播能力很低，与核盘菌DNA病毒1SsHADV-1的生物能力有很大的差距，原因可能是SsNSRV-1的病毒粒子结构相对于SsHADV-1要复杂很多，影响了SsNSRV-1的传播效率和能力。3.5.6转录组分析SsNSRV-1对核盘菌的影响RNA-seq测序数据表明，核盘菌感染SsNSRV-1后被显著影响的基因共1791个，其中915个显著上调，876个显著下调（图3.18）。这些基因中能够富集到pathway通路上的有936个，未富集到pathway通路上的有855个。Pathway富集分析表明，受SsNSRV-1显著影响的pathway包括代谢相关、氨基酸合成和代谢、糖类代谢、类固醇的生物合成、脂类代谢，以及次级代谢产物的合成（表3.10）。其中影响最大的pathway是核盘菌的核糖体组装（ribosome）（表3.10），即核盘菌的蛋白翻译74 核盘菌新型RNA病毒研究被SsNSRV-1激活，表现在核糖体组装相关的基因几乎全部上调（图20）。核糖体的功能在于产生大量的蛋白，因此，SsNSRV-1侵染核盘菌后，核盘菌的整个蛋白合成体系被激活，可能有利于病毒的大量复制和繁殖，同时有利于病毒大量合成自身所需要的蛋白。病毒在侵染寄主的过程中能够利用细胞的“机器”来有效地的完成复制（Lopezetal.,2010）。病毒侵染寄主后，激活寄主的核糖体大量合成，这一现象不仅仅局限于-ssRNA病毒，也发生在dsRNA病毒、+ssRNA病毒以及DNA病毒，推测该现象可能是普遍存在的。例如，在真菌病毒FgV1-DK21侵染F.graminearum后，F.graminearum的核糖体合成途径受到显著的激活（Choetal.,2012）。图3.18表明，SsNSRV-1侵染核盘菌后，表达量差异较大的基因多数是下调的，即病毒侵入寄主时首先要抑制寄主某些基因的表达，值得注意的是基因SS1G_08137在对照菌株Ep-1PNA367中包括1678个reads，而感染病毒SsNSRV-1后，该基因完全不表达（0个reads），该基因初步预测编码羟基前列腺素脱氢酶（15-hydroxyprostaglandindehydrogenase,15-PGDH），并且该基因在真菌中广泛存在，多数被注释成假定蛋白，只有在灰霉（BotrytiscinereaBcDW1）、白僵菌（BeauveriabassianaARSEF2860）中注释成羟基前列腺素脱氢酶。15-PGDH能够催化高活性的15-羟基的前列腺素转化成低活性的15-酮基前列腺素（Taietal.,2006）。有研究表明，15-PGDH能够抑制肿瘤的形成，超量表达15-PGDH能够显著地减少人类的各种器官的肿瘤形成，包括肠道、肺、胃、乳腺等（Geeetal.,2003;Backlundetal.,2005;Thieletal.,2009）。因此可以推定15-PGDH不仅在人和高等动物中起重要作用，在低等的真核生物比如真菌中也同样发挥着重要的作用，这就可以解释15-PGDH在真菌中广泛存在的原因，15-PGDH基因受到显著的抑制可能会导致核盘菌功能和代谢的紊乱，进而影响核盘菌的生长和发育。同时我们还发现被SsNSRV-1侵染后，核盘菌中胆碱脱氢酶（cholinedehydrogenase,CHDH）的基因SS1G_11988也是显著下调的（表3.9）。胆碱是生物体主要的甲基来源之一，它的代谢产物能够形成生物体通用的甲基供体腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）。SAM可以参与80多种甲基转移反应，包括DNA、RNA以及蛋白的甲基化（Xuetal.,2008）。CHDH能够催化胆碱形成甜菜醛，甜菜醛经过氧化作用形成甜菜碱，可以为半胱氨酸提供甲基供体，有研究表明胆碱代谢的紊乱会导致乳腺癌的产生（Xuetal.,2008）。因此，可以推定CHDH与核盘菌代谢过程中的甲基转移有密切关系，CHDH的下调会导致甲基供体的减少和缺乏，同时我们还发现甲基转移酶功能域的基因SS1G_04080也受到强烈的抑制，进而可能导致核盘菌的DNA、RNA以及蛋白的甲基化作用受到抑制，影响核盘菌的生长和发育。此外，L-氨基乙二酸-半醛脱氢酶（l-aminoadipate-semialdehydedehydrogenase）和依赖于NADP的乙醇脱氢酶同样发挥着类似的作用75 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文（NADP-dependentalcoholdehydrogenase）。值得注意的是，这些氧化过程同样伴随着能量的代谢，能量代谢的异常也可能造成核盘菌生长和发育的异常。我们还注意到核盘菌感染SsNSRV-1后，显著下调的基因还包括MFS转运蛋白（MFSmultidrugtransporter）。作为一种防御机制，真菌具有转运系统以抵御杀菌剂、抗生素、植保素以及毒性因子。真菌的转运系统主要由两种，一种是ABC转运系统（ATP-bindingcassettetransporters），通过水解ATP产生能量来进行物质运输；另外一种是MFS转运系统（majorfacilitatorsuperfamily(MFS)transporters），缺少ABC功能域，依靠离子梯度形成的化学渗透作用来进行物质转运。在真菌大豆紫斑病菌（Cercosporakikuchii）、烟草尾孢菌（Cercosporanicotianae）以及镰刀菌（Fusariumgraminearum）中报道MFS转运蛋白有助于真菌毒素的分泌（Callahanetal.,1999；Changetal.,2004；Menkeetal.,2012）。因此，SsNSRV-1侵染核盘菌后，核盘菌的MFS转运系统受到了显著抑制，进而可能影响一些次生代谢产物的分泌。核盘菌被SsNSRV-1侵染后显著下调的基因还包括糖苷水解酶蛋白（SS1G_00513,glycosidehydrolaseprotein;SS1G_08695,glycosidehydrolasefamily18protein（GH18））。GH18是几丁质酶的一种，广泛分布在各种生物中，包括病毒、细菌、植物、真菌、动物（Duoetal.,2006）。目前真菌中发现的几丁质酶都属于GH18，GH18还具有乙酰葡糖胺糖苷酶的作用，在去糖基化过程中发挥着重要作用（Cantareletal.,2009）。真菌中含有多个几丁质酶基因（Gaoetal.,2011;Zhengetal.,2011），几丁质酶和几丁质合酶在真菌细胞分化和发育过程中的细胞壁重建中发挥着重要的作用，同时可以帮助真菌抵御其它生物以及不良环境，几丁质的降解产物还可以作为营养来源（Seidletal.,2008;Hartletal.,2012;Bowmanetal.,2006）。几丁质酶参与到真菌的的多个生物过程，包括真菌生长、自我溶解、营养吸收以及致病力等（Hartletal.,2012），在绿僵菌中，一个几丁质酶基因的敲除就会使绿僵菌的致病力显著减弱（Boldoetal.,2009;Staatsetal.,2013）。因此，SsNSRV-1的侵染，会显著抑制核盘菌几丁质酶基因的表达，进而可能影响核盘菌细胞壁的完整性、致病力以及生长发育和防卫。核盘菌的细胞色素p450氧化还原酶基因（SS1G_04088,cytochromep450oxidoreductaseprotein（CPR））在SsNSRV-1侵染后显著下调。CPR是锚钉在膜上的黄素蛋白，能够催化NADPH的电子转移到细胞色素p450或其它电子受体上，涉及到多个生物合成反应(Porteretal.,1991)。CPR是细胞色素p450系统众多酶家族中的一员，细胞色素p450系统参与到生物体代谢的多个方面，包括多种外源有害物质的代谢、类固醇、脂肪酸以及脂溶性维生素的合成以及多种有机物的转换等（Bernhardtetal.,2006）。CPR基因表达水平的剧烈下降，势必会造成核盘菌整个基础代谢的紊乱。76 核盘菌新型RNA病毒研究核盘菌的MYB家族的转录因子在SsNSRV-1侵染后也发生了显著的下调（SS1G_04107，familytranscriptionfactor（MYB-TFs））。真菌中有多个MYB-TFs，例如在镰刀菌（F.graminearum）基因组中，有多达19个MYB-TFs（Sonetal.,2011）。研究表明MYB-TFs能够参与真核生物多种细胞过程，包括细胞增殖、细胞自噬、细胞分化、细胞代谢以及响应各种胁迫（Dubosetal.,2010;Ohetal.,1999;Ramsayetal.,2008;Ravagliaetal.,2013）。在真菌中，MYB-TFs蛋白的敲除在杜仲种腐病菌（Ashbyagossypii）中会影响腺嘌呤的吸收以及相应的信号通路、延迟孢子萌发（Mateosetal.,2006）；在构巢曲霉（Aspergillusnidulans）中，会影响无性生殖和有性生殖的分化（Arratiaetal.,2012;Wieseretal.,1995）；在镰刀菌中，MYB-TFs是产生分生孢子、营养生长、有性发育，以及致病力所必需的（Kimetal.,2014）。综上所述，SsNSRV-1对核盘菌的影响表现在多个方面，多数是一些基本的代谢，包括生长和发育相关的物质、能量和信号，进而影响生物的多个生理生化过程，最终导致核盘菌的弱毒特性。但是SsNSRV-1具体怎样影响这些基因和通路的变化，还需要将来进一步详细的探索和解释。3.5.7SsNSRV-1的应用及展望Mononegaviruses中多数病毒可以侵染人和高等的哺乳动物，而且具有很高的致死率，SsNSRV-1可以作为一种安全高效的工具，研究-ssRNA病毒的复制和致病机理，并且可以用于筛选抗-ssRNA病毒的药物，还有助于研究病毒的生态和进化，探讨-ssRNA病毒和核盘菌互作的机理。但是，我们也发现仍然有很多问题有待进一步解决，比如SsNSRV-1的病毒粒子中发现了大量的缺陷型RNA（图3.10F），这些RNA有什么功能；除N蛋白和L蛋白外，SsNSRV-1的其它基因有什么功能；SsNSRV-1的病毒粒子究竟有没有包膜结构以及病毒粒子结构解析；SsNSRV-1影响核盘菌生长、致病以及菌核形成的机制等。77 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文第四章双节段dsRNA病毒SsBRV1分子特性及生物学特性研究4.1引言目前根据病毒核酸的性质，真菌病毒可以分为RNA病毒和DNA病毒，RNA病毒又可以分为双链RNA（dsRNA）病毒、正单链RNA（+ssRNA）病毒和负单链RNA（-ssRNA）病毒。目前报道的已知-ssRNA病毒仅有SsNSRV-1，DNA病毒仅有SsHADV-1。随着大量真菌病毒报道的出现（Chibaetal.,2009;Yuetal.,2010;Linetal.,2012;Wuetal.,2012;Liuetal.,2014;Zhangetal.,2014a;Huetal.,2014;Zhangetal.,2014b），新发现的真菌病毒具有特殊的分子特性和分类地位，引发了人们对真菌病毒分类的重新思考。已经发现的dsRNA真菌病毒目前包括6个科，分别是全病毒科、双分病毒科、巨型双节段病毒科、产黄青霉病毒科、四节段病毒科、呼肠孤病毒科（Ghabrialetal.,2015），以及Wu等2013年建议成立的Botybirnaviridae，该科目前仅含有一个成员BotrytisporriRNAvirus1（BpRV1），基因组含有2个dsRNA片段（Wuetal.,2012）。一般来说，具有dsRNA形式的真菌病毒多数表现出隐性侵染（crypticinfectionorlatentinfection）（Ghabrialetal.,2009），即对寄主真菌的生物学特性没有明显的影响。但是新发现的dsRNA真菌病毒Rosellinianecatrixmegabirnavirus1(RnMBV1)、BotrytisporriRNAvirus1(BpRV1)以及Sclerotiniasclerotiorumpartitivirus1(SsPV1)（Chibaetal.,2009;Wuetal.,2012;Xiaoetal.,2014）均使寄主真菌表现出严重的衰退症状。因此，随着越来越多的dsRNA真菌病毒被报道，dsRNA真菌病毒表现出越来越丰富的生物学特性以及分子特性，改变着人们对传统真菌病毒的认识和观念。在核盘菌中，目前已经报道了多个真菌病毒及其分子特性和生物学特性，包括双分病毒（Liuetal.,2012;Xiaoetal.,2014）、弱毒病毒（Xieetal.,2011;Khalifaetal.,2014）、线粒体病毒（Xieetal.,2012;Khalifaetal.,2013;Xuetal.,2015）、α弯曲病毒（Xieetal.,2006)）以及一些未分类的病毒（Yuetal.,2010;Liuetal.,2014;Huetal.,2014;Liuetal.,2009）。由此可见，核盘菌中的真菌病毒具有丰富的种类和数量，有助于病毒种类、进化以及病毒与寄主之间互作的研究。我们从四川省分离的菌株中发现了一个新的双节段dsRNA病毒，与灰霉中报道的双节段dsRNA病毒BpRV1（Wuetal.,2012）具有一些相似的分子特性，可能也属于Botybirnaviridae病毒科的成员，因此命名为Sclerotiniasclerotiorumbotybirnavirus1（SsBRV1）。本章就对该病毒的基因组结构、分子特性、生物学特性、分类地位以及病毒粒子形态和结构特性进行了较为详细的研究。78 核盘菌新型RNA病毒研究4.2材料与方法4.2.1试验材料菌株SCH941，于2010年采集自四川省雅安市荥经县，菌株Ep-1PNA367见3.2。菌株SCH941R6和R7来自SCH941的原生质体再生的菌株。4.2.2生物学特性核盘菌菌株的分离、致病力测定、生长速度测定、菌落形态观察见3.3.1。4.2.3核盘菌的原生质体再生核盘菌的原生质体再生参见肖雪琼（2013）博士学位论文。4.2.4dsRNA提取dsRNA提取参见刘慧泉（2011）博士学位论文。4.2.5SsBRV1全长cDNA的克隆4.2.5.1随机引物克隆未知序列的dsRNA克隆参见3.3.2.3。4.2.5.2末端克隆SsBRV1末端克隆参见3.3.2.4，反转录反应略有改动：加完接头后的dsRNA，14.5μl；DMSO，2μl；95℃3min，立即冰浴，5min；依次加入，5×Reactionbuffer，5μl；dNTP(10mmoleach，TaKaRa)，2μl；RRI(40U/μl,TaKaRa)，0.5μl；M-MuLVReverseTranscriptase(200U/μl，Promega)，1μl；25℃，10min；42℃，50min；50℃，10min；65℃，5min。4.2.5.3PCR产物测序PCR产物的回收纯化、连接、转化、测序参见3.3.2.3（6）。4.2.6SsBRV1病毒粒子特性79 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文SsBRV1病毒粒子的提取、病毒粒子观察、PEG介导的转染以及结构蛋白的鉴定参见3.3.4。4.2.7dsRNA的Northernblot分析（1）SsBRV1RNA制备：提取菌株SCH941R6菌丝中dsRNA以及该菌株中SsBRV1的病毒粒子，从病毒粒子中提取SsBRV1的vRNA，用来进行Northernblot分析。（2）dsRNA电泳：①dsRNA和vRNA上样量约500ng，1μlEB（200ng/μl），3μlloadingbuffer，用DEPC处理过的ddH2O补充至15μl；②电泳缓冲液为0.5×TBE，琼脂糖凝胶浓度为0.6%，4℃电泳，2.5V/cm，电泳10-15h。③观察电泳结果，如果条带清晰，分离情况较好，进行下一步转膜。（3）转膜、杂交、结果观察参见3.3.5。4.2.8序列分析和系统发育分析所用到的生物信息学软件序列编辑、ORF预测、序列同源性搜索、蛋白序列比对、蛋白模型预测、系统发育分析参见3.3.6。4.2.9SsBRV1探针制备、RT-PCR检测所用引物BRV1S1-F:5’-CCAGGGCAGTTGCTACAGTCAT-3’BRV1S1-R:5’-TTGCCGCAGAGGGGAATC-3’BRV1S2-F:5’-TCCCCGAGCAACTCAAAAACC-3’BRV1S2-R:5’-GCACGATTTAGTGCTGCGGTTT-3’BRV1S3-F:5’-TTATCACTCGCACTTCACACGCAG-3’BRV1S3-R:5’-GCCCTCAACGCCTTCGTAAAAG-3’BRV1S1-F/BRV1S1-R用来检测dsRNA1及Northernblot分析的探针制备；BRV1S2-F/BRV1S2-R用来检测dsRNA2及探针制备；BRV1S3-F/BRV1S3-R用来检测dsRNA3。4.2.10核盘菌子囊孢子诱导将活化的菌株用打孔器打取5个菌丝块，放到胡萝卜培养基中，20℃培养20d，收集培养基中产生的菌核，用水将菌核清洗干净，晾干。将晾干的菌核用吸水纸包好，再用自封袋封好，放到4℃进行低温处理20d。处理后的菌核，放到种有油菜的80 核盘菌新型RNA病毒研究盆钵中，覆上一层沙子，同时保持湿润，置于10-20℃条件下进行子囊盘诱发，30d左右观察菌核萌发情况。4.3结果与分析4.3.1菌株SCH941生物学特性菌株SCH941采集自四川省雅安市荥经县，该菌株在PDA培养基上菌落生长异常，菌落边缘发生扇变，生长缓慢，不产生菌核或有少量菌核产生，菌落有较多的色素沉积（图4.1A），菌株的致病力几乎完全丧失，在离体的油菜叶片上几乎不发病（图4.1B）；通过原生质体再生得到了一些表型恢复的菌株（图4.1A），表现为菌落生长正常，生长速度快，产生大量的菌核均匀分布在菌落边缘，有较强的致病力，在离体的油菜叶片上能够产生较大的病斑（图4.1B）。提取菌株SCH941以及原生质体再生菌株R6、R7的dsRNA发现，菌株SCH941中有多条dsRNA片段，大小约在1.0Kbp-6.6Kbp之间，而R6和R7菌株中只观察到了2条dsRNA片段，大小分别为6.6Kbp和1.5Kbp，因此推定R6和R7菌株中的这两条6.6Kbp和1.5Kbp大小的dsRNA片段不是导致SCH941产生弱毒特性的因子。图4.1菌株Ep-1PNA367、SCH941以及SCH941原生质体再生菌株的生物学特性Fig.4.1Colonymorphology,virulenceandmycoviruscontentofstrainEp-1PNA367,SCH941anditsderivativeisolates.A，菌落形态；B，致病力测定；C，dsRNA电泳检测A,Thecolonymorphology.AllthestrainswereculturedonPDAat20-22℃for10days.B,Virulencetestondetachedleavesofrapeseed.Thephotosweretaken3dayspostinoculationat20-22℃.C,dsRNAprofilesseparatedon1.0%argarosegel.81 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文4.3.2SsBRV1的基因组结构及特性从菌株SCH941R6中分别克隆了两条dsRNA序列，从6.6Kbp的dsRNA片段中得到的两个大的contig，最后得到的序列全长分别为6457bp（GenBank登录号：KP774592）和5965bp（GenBank登录号：KP774593），因此推测SCH941R6中6.6Kbp的dsRNA片段可能有两个dsRNA片段，经过进一步琼脂糖电泳发现SCH941R6中6.6Kbp的dsRNA片段实际上包含两条dsRNA片段（图4.7B,C），因此命名为dsRNA1和dsRNA2，同时Northernblot也证明了这两个dsRNA片段的存在（图4.2A），而SCH941R6中1.5Kbp的dsRNA片段经过克隆得到的全长序列为1647bp，暂时命名为dsRNA3。dsRNA1有一个ORF（ORF1，nt568-6343），5’UTR长为567bp，3’UTR长114bp；dsRNA2也只有一个ORF（ORF2，nt577-5848），5’UTR长为576bp，3’UTR长117bp。dsRNA1和dsRNA2的5’UTR和3’UTR严格保守，序列相似性分别为95%和85%（图4.3A，B），并且Northernblot也证明了这一序列的保守性（图4.2A）。5’UTR和3’UTR均含有反向重复序列，形成颈环结构（图4.3C）。ORF1推测编码的蛋白含有1925个氨基酸，分子量为217KDa，C端含有一个保守的RdRp功能域（RdRp_4,Pfam02123）（图4.2B），与一些未分类的dsRNA病毒BotrytisporriRNAvirus1（BpRV1）、Spissistilusfestinusvirus1（SpFV1）、Circulifertenellusvirus1（CiTV1）以及全病毒科（Totiviridae）和产黄青霉病毒科的成员（Chrysoviridae）（表4.1）进行blast分析，结果表明SsBRV1与BpRV1之间的相似性最高，得分为875（表4.1），SsBRV1的氨基酸序列aa14-920与BpRV1的aa29-920也具有显著的相似性（表4.2），而aa892-1436没有发现具有显著相似性的序列，具体功能还未知。ORF2推测编码的蛋白含有1757个氨基酸，分子量大小为195KDa，blast分析SsBRV1的ORF2氨基酸区域aa94-1009，1409-1730与BpRV1的ORF2氨基酸区域aa254-1148，1461-1761具有显著的相似性，分别具有27%和23%的相似性（表4.2），而氨基酸区域aa1010-1408没有发现具有显著相似性的序列。有意思的是，在ORF2的nt2650-2953发现一个生长素受体结合功能域（hormonereceptorbindingdomain，GHBP（Pfam12772,Evalue=3.88e-04））（图4.2B），多重序列比对发现SsBRV1含有典型的GHBP功能域保守氨基酸残基（图4.6）。同时，我们还发现ORF1的氨基酸区域aa348-807与ORF2的氨基酸区域aa135-621之间具有显著的相似性（Evalue=4e-10）（图4.2B），序列比对分析发现这两个氨基酸序列之间具有很保守的氨基酸位点（图4.4）。ORF1与ORF2之间的这种氨基酸序列保守性，在另一个双节段dsRNA病毒BpRV1中同样存在（Evalue=5e-06）（图4.5A，B），这一区域同样含82 核盘菌新型RNA病毒研究有保守的氨基酸位点（图4.5B），而在典型的双节段dsRNA病毒Birnavirus、Picobirnavirus以及Partitivirus中均没有发现这种特性。这一保守的区域功能还有待进一步的研究。dsRNA3的全长为1647bp（GenBank登录号：KP774594），GC含量为46.9%，在序列上与dsRNA1、dsRNA2均没有显著的相似性，同时该片段也没有发现大的可能具有功能的ORF，该序列在NCBI数据库中比对也没有发现具有显著性相似的序列，具体功能还未知。同时，dsRNA3在SsBRV1的病毒粒子中也存在（图4.7），但是在PEG介导的病毒粒子转染过程中，dsRNA3会发生丢失（图4.9），鉴于dsRNA3这种特性，我们认为dsRNA3不是SsBRV1所必需的，可能是SsBRV1的卫星RNA（satellite-likeRNA，SatlRNA）。图4.2SsBRV1基因组结构及特性Fig.4.2GenomeorganizationofSsBRV1A，Northernblot分析SsBRV1的dsRNA1和dsRNA2。菌丝中的dsRNA以及病毒粒子中的vRNA均进行了Northernblot分析，探针1-3在基因组的位置见B图；B，SsBRV1dsRNA1和dsRNA2的基因结构。dsRNA1和dsRNA2全长分别为6457和5965bp，dsRNA1只有一个ORF（ORF1,nt568-6343），5’UTR长568bp，3’UTR长114bp；dsRNA2也只有一个ORF（ORF2,nt577-5848），5’UTR长577bp，3’UTR长117bp。长方形表示ORF，大小和位置均已标出。灰色方框表示保守的功能域：RdRp功能域(RdRp_4,pfam02123)；生长激素受体结合蛋白功能域（GHBP,pfam12772）。dsRNA1与dsRNA2之间的灰色区域表示这两个区域的蛋白质序列具有显著的相似性。A,NorthernblotanalysisthedsRNA1anddsRNA2ofSsBRV1.BothdsRNAfrommyceliaandviralparticlesweresubjectedtonorthernblotanalysis.Thepositionsofprobes1to3areshowninpanelB.B,SchematicrepresentationofthegeneticorganizationofSsBRV1dsRNA1anddsRNA2segments.dsRNA1and2are6457and5965ntinlength,respectively.dsRNA1hasa568-nt-long5’UTR,oneORF(ORF1),anda114-nt-long3’UTR,whiledsRNA2hasa577-nt-long5’UTR,oneORF(ORF2),anda117-nt-long3’UTR.ORF1to-2arecomposedof1925and1757codons,respectively.Open83 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文boxesdrawnwithsolidlinesdenoteORFs.ThegraypositiononORF1and-2showedtheconserveddomain:RdRPdomain(RdRp_4,pfam02123)andagrowthhormonereceptorbindingdomain(GHBP,pfam12772).ThegrayareabetweendsRNA1and-2indicatesthepositionwithsignificantsimilarity.NumbersabovesolidlinesrefertomappositionsofinitiationandterminationcodonsoftherespectiveORFs.表4.2SsBRV1与BpRV1结构蛋白之间的相似性比较Table4.2ComparisonofthestructuralproteinsbetweenSsBRV1andBpRV1GenesVirusnameSize(aa)CoverageIdentityEvalueBitscoreSsBRV1192514-891ORF126%1e-73284BpRV1190229-920SsBRV1175794-1009ORF227%4e-94348BpRV11788254-1148SsBRV117571409-1730ORF223%4e-0972.4BpRV117881461-176184 核盘菌新型RNA病毒研究表4.1SsBRV1的RdRp区域BLASTp搜索的结果Table4.1SummaryoftheBLASTpsearchwithSsBRV1RdRpRdRP_4conservedregionBLASTMycovirusesRdRpsize(aa)AccessionNO.ConserveddomainSize(aa)Identity%BitscoreCoverageEvalueUnclassifiedSsBRV119251437-1618182BpRV119021347-15942483887589%7.00E-174YP_006390636.1PLV1277651-9042542510320%1.00E-18YP_009025166.1SpFV11338681-9492692389.722%2.00E-14YP_003800001.1CiTV11326688-9372502987.816%8.00E-14YP_003800003.1RnMBV11111508-761254236713%2.00E-07YP_003288763.1TotiviridaeUmVH118201024-15305072511925%1.00E-23NP_620728.1UvRV1823196-5713763186.712%1.00E-13YP_007761589.1TcV21132587-8352492475.920%3.00E-10CBY84993.1TvV21436799-12294312971.214%8.00E-09AED99808.1TvV31443804-12354322967.812%1.00E-07AED99800.1BbRV1834222-5843632462.421%4.00E-06CCC42235.1ChrysovidaePeCV11117362-832471227927%3.00E-11YP_392482.1RsCV11138575-853279237927%3.00E-11AFE83590.1ACDACV11087541-806288237226%4.00E-09CAH03664.1CnCV1962539-8222842169.725%2.00E-08ACT79255.1GACV1957357-7493932168.923%3.00E-08ADO60926.1AfCV11114370-8294602167.823%8.00E-08CAX48749.1MoCV11127571-8312612167.426%1.00E-07YP_003858286.1MoCV31127557-8312752163.526%1.00E-06YP_008914864.1PotyviridaeCYAV63426-3112862358.216%6.00E-05CAA63099.2PartitiviridaeFgRV21137572-8462752261.222%8.00E-06ADW08802.185 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文图4.3dsRNA1和dsRNA2的分子特性Fig.4.3MolecularcharacteristicsoftheSsBRV1dsRNA1anddsRNA2segments.A，保守的5’末端序列，灰色的ATG表示ORF1和ORF2的起始密码子；B，保守的3’末端序列；C，5’UTR和3’UTR预测的颈环结构。A,Conserved5’UTRs.ThestartcodonsofORF1and2arecoloredingray;B,Conserved3’UTRs;C,PredictedsecondarystructuresoftheterminalsequencesofthedsRNA1anddsRNA2segments.86 核盘菌新型RNA病毒研究图4.4SsBRV1ORF1与ORF2保守的蛋白序列进行序列比对Fig.4.4AlignmentofaminoacidsequenceswithsignificantsequencesimilaritybetweenSsBRV1ORF1andORF2相同的氨基酸残基用灰色标示，保守的及半保守的氨基酸残基用“:”和“.”标示。Theidenticalaminoacidresiduesareshadedingrayandindicatedbyasterisks.Theconservedandsemi-conservedaminoacidresiduesareindicatedbycolonsanddots.图4.5BpRV1基因组结构及特性Fig.4.5BpRV1genomicorganizationandmolecularcharactistics87 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文A，BpRV1基因组结构，方框表示ORF灰色区域表示ORF1与ORF2的蛋白序列具有显著相似的区域；B，BpRV1的ORF1与ORF2具有显著相似性的区域蛋白序列的比对。A,SchematicalrepresentationofthepolypeptidesregionswithsignificantsimilaritybetweenBpRV1ORF1andORF2;B,AlignmentofaminoacidsequencewithsignificantsequencesimilaritybetweenBpRV1ORF1andORF2.Theidenticalaminoacidresiduesareshadedbygraycolorsandindicatedbyasterisks.Theconservedandsemi-conservedaminoacidresiduesareindicatedbycolonsanddot.图4.6不同物种之间GHBP功能域的多序列比对Fig.4.6AminoacidsequencealignmentofGHBPdomainamongdifferentspecies“*”表示完全相同的氨基酸残基，“：”“.”表示保守和半保守的氨基酸残基。CAVPO，豚鼠；PAPAN，东非狒狒；MOUSE，小家鼠；MONDO，南方短尾负鼠；COLLI，野鸽；PKLSJ，中国软壳龟；ANGJA，鳗鲡；SASA，虹鳟；CYSE，半滑舌鳎。Theasterisksindicateidenticalaminoacidresidues,thecolonsrepresenttheconservedaminoacidresiduesandthedotsrepresentthesemi-conservedaminoacidresidues.Theselectedspeciesarelistedinthefollows:CAVPO,CaviaporcellusQ9JI97.1;SsBRV1;PAPAN,Papioanubis,Q9XSZ1.1;MOUSE,Musmusculus,Q3UP14;MONDO,Monodelphisdomestica,Q9N0Y7;COLLI,Columbalivia,Q90375.1;PKLSJ,Pelodiscussinensisjaponicus,Q9DE35;ANGJA,Anguillajaponica,Q6L631;SASA,Salmosalar,NP_001135089.1;CYSE,Cynoglossussemilaevis,ACM43288.1.4.3.3SsBRV1的病毒粒子及结构从菌株SCH941R6中提取SsBRV1的病毒粒子，透射电镜观察结果表明，SsBRV1的病毒粒子呈球形，直径38nm左右，表面比较粗糙（图4.7A）。裂解其中的核酸，经琼脂糖凝胶电泳分析发现，病毒粒子中的dsRNA带型及大小与菌丝中提取到的dsRNA均相同，均包括dsRNA1、dsRNA2和dsRNA3（图4.7B）。SsBRV1的病毒粒子在PEG介导的作用下能够成功侵染强毒菌株Ep-1PNA367的原生质体，通过从SsBRV1侵染的菌株Ep-1PNA367中提取SsBRV1的病毒粒子，受体菌株EP-1PNA367作为阴性对照，解析SsBRV1的病毒粒子结构蛋白。SDS-PAGE电泳分析发现SsBRV188 核盘菌新型RNA病毒研究的病毒粒子能够检测到特异的3条dsRNA片段，分子量大小为别是120KDa、100KDa和80KDa，命名为p120、p100、p80（图4.7D）。p120、p100、p80经过蛋白指纹图谱（PMF-MS）鉴定分析，结果表明p120共鉴定出27个肽段，经过序列比对分析，这27个肽段能够匹配到ORF2上，覆盖的范围为aa1-1407之间的氨基酸区域；p100产生了34个肽段，经过序列比对，其中33个肽段能够匹配到ORF1编码的蛋白aa323-933之间的氨基酸区域，一个匹配到SsBRV1的RdRp区域（aa1842-1850）；p80产生了34个肽段，同样匹配到ORF1编码蛋白aa323-933之间的氨基酸序列（表4.3）。根据鉴定结果，我们将这些肽段在SsBRV1的基因组上的位置进行了分析（图4.9），推定ORF1的aa568-3433编码结构蛋白的p100和p80，鉴于p80在p100内部，p80可能是p100的降解产物，也可能是p100经过翻译后的加工过程产生p80，类似于全病毒Helminthosporiumvictoriaevirus190S(HvV190S)(Huangetal.,1996)；而ORF2的577-3871编码SsBRV1的结构蛋白p120。因此，SsBRV1的外壳蛋白CP可能包括3个组分，分子量大小分别是120KDa、100KDa、80KDa，并且ORF1和ORF2都参与了SsBRV1的CP形成，ORF1实际上编码一个cap-pol融合蛋白，但是ORF1、ORF2具体怎样编码或加工形成p120、p100、p80这3个结构蛋白，还需要进一步的研究。图4.7SsBRV1病毒粒子及蛋白结构Fig.4.7CompositionofvirusparticlesofSsBRV1A，SsBRV1的病毒粒子形态；B，菌丝提取的dsRNA（mycelia）以及病毒粒子释放的dsRNA（VP）琼脂糖凝胶电泳，dsRNA3用箭头标示；C，0.7%琼脂糖电泳分析SsBRV1的dsRNA1、dsRNA2，marker为HindIII消化的λDNA（TaKaRa）；D，SDS-PAGE电泳分析SsBRV1的病毒粒子结构蛋白，SsBRV1的病毒粒子从SsBRV1侵染的Ep-1PNA367中提取（VP），遗传背景完全相同的菌株Ep-1PNA367作为阴性对照（VF），蛋白的大小根据蛋白Marker（PageRulerPrest.，ThermoScientific）进行估计。A,TEMobservationofvirusparticles;B,1%agarosegel-electrophoresedanalysisofdsRNA566profilesfrommyceliaandviralparticles.HindIII-digestedλDNAwasusedasthemolecularmarker;C,0.7%agarosegel-electrophoresedanalysisoftheupperdsRNAbandrunin0.5×TBEbufferat50V89 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文for16hD;D,10%SDS-PAGEgel-electrophoresedanalysisoftheproteincomponentsofviralparticlespurifiedfromSsBRV1-infectedtransfectant(laneVP).FractionsfollowedthesamemethodasvirusparticlespurificationfromtheisogenicstrainEp-1PNA367wasalsoanalyzed(laneVF).Themolecularweightoftheproteinbandswasestimatedbytheproteinmarkers.图4.8SsBRV1的结构蛋白对应的基因组位置和大小Fig.4.8GenomesegmentassignmentofSsBRV1structuralproteins结构蛋白p120、p100、p80大小见图4.7D，ORF1绿色区域表示可能编码p100和p80，虚线表示p100和p80经PMF-MS鉴定得到的肽段分布在ORF1的范围；ORF2的灰色区域可能编码p120，虚线表示p120经PMF-MS鉴定得到的肽段分布在ORF2的范围。p120、p100、p80经PMS-MS鉴定得到的肽段及序列见表4.2。Proteinsof120,100,and80KDainSsBRV1purifiedpreparations(Fig.4.7D)wereanalyzedasdescribedinMaterialsandmethods.Thepolypeptidesof120and100KDaarepredictedtocorrespondtoORF1andORF2portionscoloredbylightgreenandgrayrespectively.ThedashedlineindicatedtheregionoftrypticpeptidesidentifiedbyMSanalysis(seeTable4.2).Thepolypeptidesof80KDawereincludedinthatofp100.90 核盘菌新型RNA病毒研究表4.3SsBRV1结构蛋白p120、p100、p80经PMF-MS鉴定得到的肽段Table4.3Summarytheresultsofp120、p100、p80analyzedbyPMF-MS.ObservedCalculatedIonsPutativeAminoacidsequence±deltaFrequencyPositionMassMassscoreORFp120ELTLHAK810.4641810.45990.004224.472886-892ORF2GTLIQPAK826.4965826.49120.005337.492804-811ORF2SLAANLSR830.4681830.4610.007149.9411060-1067ORF2MPDINFK863.4272863.42110.006143.662114-120ORF2GFPIEFR864.4551864.44940.005734.553219-225ORF2YIWEETK967.4723967.46510.007228.051594-600ORF2KIDSSLGVR973.561973.55560.005452.363651-659ORF2LIDHLESR981.531981.52430.006756.993500-507ORF2AISMNDLKK1018.5551018.5480.007129.631385-393ORF2FNGLAETLR1019.5481019.540.007547.881815-823ORF2FNADIELGR1033.5271033.5190.007743.813393-402ORF2ITTEYEQR1038.5061038.4980.007545.352187-194ORF2ATGNLVTTQR1059.5731059.5670.005547.43195-204ORF2STNTVTGEPR1060.5221060.5150.007453.141660-669ORF2YIWEETKR1123.5741123.5660.007446.022594-601ORF2LFDQGGVGSVR1133.591133.5830.007256.892793-803ORF2AEAVFNSYVR1154.5791154.5720.007146.274403-412ORF2KFNADIELGR1161.6221161.6140.00768.976393-402ORF2NPFLVQAPTAK1184.6641184.6550.008955.121121-131ORF2KLFDQGGVGSVR1261.6871261.6780.009260.332792-803ORF2HELQSQVNVAR1279.6671279.6630.003813.554414-424ORF2IALLAMLDTHSNK1425.7721425.7650.007537.695425-438ORF2RHELQSQVNVAR1435.7721435.7640.007212.4413413-424ORF2VNYPVIATSTGYR1439.7511439.7410.010367.473172-184ORF291 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文IALLAMLDTHSNK1441.7671441.760.007280.653425-438ORF2GTPVLSSLAYESLR1491.8041491.7930.010976.252508-521ORF2FVRDEQWSGTVSK1537.7351537.753-0.01730.3211229-1241ORF2AQDIEYTYAPLGAK1538.7721538.7620.010578.472869-882ORF2RIALLAMLDTHSNK1581.8761581.8660.010123.792425-438ORF2GWLNTVTGGSPPEIR1582.8221582.810.011197.683538-552ORF2LDDIPEQLKNPEYAK1771.9121771.8990.012367.834833-847ORF2SNSVSAQLGVDQISPAGR1784.9151784.9020.013757.252747-764ORF2NGDEELGIQPMYSAIR1791.861791.8460.014339.922353-368ORF2SVTYDESFPALPTAAEK1824.9011824.8780.022539.1711082-1098ORF2SVDGDNHVAWLTIAILR1878.9961878.9950.000315.345232-248ORF2HSSDPSTHDGNAPVPMPR1900.8571900.8490.008642.497727-744ORF2DWIYDAMPSGFSSWSR1903.8291903.820.009527.752522-537ORF2HSSDPSTHDGNAPVPMPR1916.8521916.8440.008521.124727-744ORF2LIYLGLRPAIVQYEER1932.0941932.0830.011220.165670-685ORF2SQVLFVHLQDSHYEAYK2063.0352063.0110.02359.391990-1006ORF2ANIFDTNPTDWMHYLADFSK2385.0832385.0740.0093114.264626-645ORF2ALQTASVVNNIKPYLELNALFK2445.382445.3630.017371906-927ORF2GHIEMTSGIANQFGINLEDMVQAR2646.2682646.2530.014798.011262-285ORF2VFEMVLPSNAADASEVVYLAYLSGMLDDSMR3408.6183408.5930.02563.111320-350ORF2MSEAQDASGLASHYEPAFDFNNAISFSSAVMNLGTKPK4031.8864031.8670.01912.253686-723ORF2p100SNVAFMK795.3996795.39490.004749.921744-750ORF1SLTRVTR831.4874831.4926-0.005212.682873-879ORF1LLGVVGER841.5078841.50220.005753.172564-571ORF1FELHEPK898.4595898.45480.004713.814934-940ORF1RVADAVLR898.5395898.53480.004731.762499-506ORF1FHTDSNFK994.4563994.45090.005410.756556-563ORF1THTGANQHGR1077.5121077.5060.005816.452643-652ORF1SIPEPEQQR1082.5411082.5360.004910.724947-955ORF192 核盘菌新型RNA病毒研究NIALGMIFSR1120.6121120.6060.005423.237612-621ORF1TAMVCLPVVER1273.661273.6520.007939.729718-728ORF1NISPQFEELER1360.6681360.6620.005933.72323-333ORF1AISFGWESKPIR1389.7451389.7410.00429.1310751-762ORF1IMSEQNQPAQMR1431.6681431.660.007726.914465-476ORF1GAASLMTQSANADTR1492.7031492.6940.008679.17358-372ORF1ISSYLALEITPEDK1577.8261577.8190.00751.2243763-776ORF1MTGTSSSHIHQYVSK1661.791661.7830.006595.2910729-743ORF1TFSSSVGLPKPYHSR1661.8621661.8530.00972.628622-636ORF1MTGTSSSHIHQYVSK1677.7861677.7780.007857.557729-743ORF1FYGEFYDDNISDLR1752.7731752.7630.009694.862820-833ORF1YINQNDLWDQFAIAR1865.921865.9060.0136102.23597-611ORF1SVATDEDEVAVFSPFDR1882.8671882.8590.008589.956539-555ORF1ISSYLALEITPEDKNFK1967.041967.0250.014413.61763-779ORF1DLNEEEAMQVDSLWATMK2108.9522108.9390.012948.852880-897ORF1VTSGSGVQSYLVQTIWGFGPR2238.1592238.1430.015490.331337-357ORF1VSGDTLNANILLDTVAANPVTR2253.212253.1970.013388.023477-498ORF1LNTTFNDNMITDLYNSVGDR2302.072302.0540.0159101.15410-429ORF1EAVLTSFVCHSQWGPSEQHR2354.0932354.0860.006314.848800-819ORF1APNFYATIDTMQDDFDLEYK2396.0622396.0520.010316.578698-717ORF1SQLEHLEGSPTIWNTSTAATPLEFTKPK3082.5773082.5610.016122.336845-872ORF1SKPTNAVMLPHGSNDLDVETMLYLMGHGR3182.5523182.5310.021323.185507-535ORF1AALEAASAENDAEEDEDDEEFEYPQPTANPTGQGQR3893.6373893.6260.01129.361898-933ORF1TVAFWTTNPQFEIVPVSEDTIMYDTLAGLSVEGQMVR4144.0484144.0170.030280.982373-409ORF1ESFHAVVASGTWHCAAMEETLFESVVNVMEETAGIGP4163.9414163.9030.038445.283660-697ORF1YMTEESITR1128.521128.5120.00830.6711842-1850ORF1p80DLALNR700.3905700.38680.003820.961637-642ORF1VADAVLR742.4377742.43370.00431.92499-506ORF1SNVAFMK795.4004795.39490.005542.981744-750ORF193 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文RVMEFK808.4317808.42650.005117.773654-659ORF1LLGVVGER841.5074841.50220.005355.493564-571ORF1RVADAVLR898.5395898.53480.004738.993499-506ORF1TALLKQEK929.5588929.55450.004316.242788-795ORF1FHTDSNFK994.4566994.45090.005732.787556-563ORF1THTGANQHGR1077.5121077.5060.005429.385643-652ORF1SIPEPEQQR1082.5411082.5360.00499.231947-955ORF1NIALGMIFSR1120.6141120.6060.008152.6863612-621ORF1TAMVCLPVVER1273.6571273.6520.004433.6611718-728ORF1NISPQFEELER1360.6721360.6620.009572.884323-333ORF1AISFGWESKPIR1389.7471389.7410.006258.4918751-762ORF1IMSEQNQPAQMR1431.6671431.660.007688.7121465-476ORF1GAASLMTQSANADTR1492.7031492.6940.008990.4524358-372ORF1ISSYLALEITPEDK1577.8221577.8190.003177.4867763-776ORF1MTGTSSSHIHQYVSK1661.7921661.7830.008683.6315729-743ORF1TFSSSVGLPKPYHSR1661.8621661.8530.009251.0311622-636ORF1MTGTSSSHIHQYVSK1677.7881677.7780.0096107.2515729-743ORF1FYGEFYDDNISDLR1752.771752.7630.006757.8810820-833ORF1YINQNDLWDQFAIAR1865.9181865.9060.0118101.646597-611ORF1SVATDEDEVAVFSPFDR1882.8571882.859-0.001189.3711539-555ORF1ISSYLALEITPEDKNFK1967.0321967.0250.007323.457763-779ORF1VTSGSGVQSYLVQTIWGFGPR2238.1552238.1430.0113102.132337-357ORF1VSGDTLNANILLDTVAANPVTR2253.2112253.1970.0143127.947477-498ORF1LNTTFNDNMITDLYNSVGDR2302.0672302.0540.01359.2610410-429ORF1EAVLTSFVCHSQWGPSEQHR2354.0972354.0860.01159.5711800-819ORF1APNFYATIDTMQDDFDLEYK2396.062396.0520.008673.2816698-717ORF1SQLEHLEGSPTIWNTSTAATPLEFTKPK3082.5823082.5610.020979.26845-872ORF1SKPTNAVMLPHGSNDLDVETMLYLMGHGR3182.5473182.5310.01653.717507-535ORF1TVAFWTTNPQFEIVPVSEDTIMYDTLAGLSVEGQMVR4144.0444144.0170.026971.785373-409ORF1ESFHAVVASGTWHCAAMEETLFESVVNVMEETAGIGPR4163.9264163.9030.022833.692660-697ORF194 核盘菌新型RNA病毒研究4.3.4SsBRV1的系统发育分析SsBRV1的ORF1的C端含有一个保守的RdRp结构域（图4.2B），经过多重序列比对分析，发现SsBRV1的RdRp结构域同样含有dsRNA病毒广泛存在的8个保守motif（图4.8A）。根据SsBRV1的RdRp序列，通过最大似然法构建了系统发育树，结果表明SsBRV1与双节段dsRNABpRV1的亲缘关系最近，其次是全病毒UstilagomaydisdsRNAvirus-H1(UmV-H1)，这三个病毒形成一个单独的分支。根据BpRV1的分子特性和进化地位，Wu等2014年建议成立一个新的病毒科Botybirnaviridae(http://talk.ictvonline.org/files/proposals/taxonomy_proposals_fungal1/m/fung01/4812.aspx)，因此SsBRV1应该也是该病毒科的一个新成员。有意思的是，SsBRV1与BpRV1基因组均具有2条dsRNA片段，而UmV-H1是全病毒科成员，基因组只有一个dsRNA片段，但是他们之间又具有很近的亲缘关系。同样与SsBRV1亲缘关系较近的病毒SpFV1和CiTV1基因组也只含有一个dsRNA片段，但是这2个病毒的寄主是昆虫（Spearetal.,2010）。我们还可以看到在这些亲缘关系较近的dsRNA病毒中，包括基因组只有1条dsRNA片段的全病毒科（Totiviridae）、2条dsRNA片段的Megabirnaviridae以及SsBRV1和BpRV1、4条dsRNA片段的Chrysoviridae以及Quadriviridae，这些病毒的进化关系值得我们进一步的思考和探索。图4.8SsBRV1系统发育分析Fig.4.8PhylogeneticanalysisofSsBRV195 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文A，SsBRV1及与其相关dsRNA病毒的RdRp进行多序列比对，红色虚线表示SsBRV1的位置，SsBRV1的RdRp含有dsRNA病毒8个保守的motif（I-VIII）；B，SsBRV1的系统发育树，SsBRV1的位置用红色五角星标示，病毒的名字及序列号见表4.4。A,AminoacidsequencealignmentofcoreRdRpmotifsofSsBRV1andsomeselectedviruses.Theasterisksindicateidenticalaminoacidresidues,thecolonsrepresentchemicallyhighlysimilaraminoacidresiduesandthedotsindicatechemicallylowsimilaraminoacidresidues.Identicalandchemicallysimilaraminoacidresiduesareshadedingray,andred,dottedhorizontallineshowsSsBRV1.B,PhylogeneticanalysisofSsBRV1.MembersofTotiviridae,ChrysoviridaeandunassignedvirusesrelatedtoSsBRV1areselectedtoconstructamaximumlikelihoodtree.TheredstarindicatesSsBRV1.Forabbreviationsofvirusnamesandviralproteinaccessionnumbersusedinphylogeneticanalysis,seeTable4.4.表4.4SsBRV1系统发育分析所用的病毒信息Table4.4SelectedvirusesusedforphylogeneticanalysisofSsBRV1GenbankVirusFamilyVirusNameAbbreviationaccessionNo.TotividaeUstilagomaydisvirusH1UmVH1NP_620728.1SaccharomycescerevisiaevirusL-AScV-L-AAAA50508.1SaccharomycescerevisiaevirusLaScV-L-BCAAB02146.1HelicobasidiummompaNo.17dsRNAvirusHm17VBAC81754.1SphaeropsissapineaRNAvirus1SsRV1NP_047558.1Magnaportheoryzaevirus1MoV1BAD60833.1GremmeniellaabietinaRNAvirusGaVL1AAK11656.1Botryotiniafuckelianatotivirus1BfTV1CAM33265.1Trichomonasvaginalisvirus1TVV1AET81012.1HelminthosporiumvictoriaevirusHvV190SAAB94791.2LeishmaniaRNAvirus1-1LRVNP_041191.1GremmeniellaabietinaRNAvirusL1GaVL1AAK11656.1ConiothyriumminitansRNAvirusCmRVYP_392467.1ZygosaccharomycesbailiivirusZZbV-ZNP_624325.1AmasyacherrydiseaseassociatedChrysoviridaeACD-CVYP_001531163.1chrysovirusVerticilliumdahliaechrysovirus1VdCVADG21213.1Agaricusbisporusvirus1AbV1CAA64144.1Helminthosporiumvictoriae145SvirusHvV145SAAM68953.1PenicilliumchrysogenumvirusPcVYP_392482.1QuadriviridaeRosellinianecatrixquadrivirus1RnQV1BAL46425.1Amasyacherrydisease-associatedmycovirusACDAV-RPartitiviridaeCAJ29958.1RNA-dependentRNApolymerase1dRp1Amasyacherrydisease-associatedmycovirusACDAV-RCAJ29959.1RNA-dependentRNApolymerase2dRp296 核盘菌新型RNA病毒研究UnassignedSpissistilusfestinusvirus1SpFV1ADK12922.1Circulifertenellusvirus1CiTV1ADK12924.1Cucurbityellows-associatedvirusCYAVCAA63099.2PhlebiopsisgiganteamycovirusdsRNA1PgRV1CAJ34333.2FusariumgraminearumdsRNAmycovirus-3FgV3YP_003288789.1DiplodiascrobiculataRNAvirus1DsRV1YP_003359178.1PhlebiopsisgiganteamycovirusPgRV2CAJ34335.2LentinulaedodesmycovirusHKBLeV-HKBBAG71788.2Rosellinianecatrixmegabirnavirus1/W779RnBMV1BAI48016.1BotrytisporridsRNAvirus1BpRV1YP_006390636.1Alternariaalternatavirus1AaRVYP_001976142.1Aspergillusmycovirus341AMVABX79997.14.3.5SsBRV1的生物学特性从菌株SCH941R6中提取SsBRV1的病毒粒子，在PEG介导的作用下能够成功转染菌株Ep-1PNA367的原生质体，在得到的转染子中，通过检测菌株的dsRNA，发现有些菌株的dsRNA3丢失了（图4.9E，F），经过RT-PCR进一步验证，证实这些菌株的dsRNA3确实丢失了（图4.9G），因此SsBRV1的dsRNA3可能是卫星RNA，在SsBRV1转染过程中可能会丢失，但是并不影响SsBRV1的存在，我们把含有卫星RNA的菌株简称为SatlRNA(+)，而不含卫星的菌株简称为SatlRNA(-)。通过比较这些菌株的生物学特性发现，无论SsBRV1是否携带SatlRNA，SsBRV1对核盘菌Ep-1PNA367的菌落形态没有明显的影响（图4.9A）；并且都能够在离体的油菜叶片上产生较大的病斑（图4.9B），但是统计分析发现SatlRNA存在时，SsBRV1能够显著减弱Ep-1PNA367的致病力，而SatlRNA(-)菌株与强毒菌株Ep-1PNA367的致病力没有显著差异（图4.9C）；生长速度比较发现，SatlRNA存在时，SsBRV1能够显著减慢菌株Ep-1PNA367的生长速度，而菌株Satl(-)与强毒菌株没有显著的区别（图4.9D）。SsBRV1对核盘菌的影响取决于SatlRNA是否存在，SatlRNA存在时，SsBRV1能够引起核盘菌的弱毒特性，而SatlRNA不存在时，SsBRV1表现为隐性侵染，对核盘菌的生物学特性没有显著的影响。97 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文图4.9SsBRV1的生物学特性Fig.4.9ThebiologicalpropertiesofSsBRV1Satl(+)表示SsBRV1携带卫星RNA，Satl(-)表示SsBRV1不携带卫星RNA。A，菌落形态；B，致病力检测；C，病斑直径统计；D，生长速度统计，统计分析所用的样品有3个重复，“*”表示在p=0.05显著水平下具有显著的差异；E，1%琼脂糖电泳分析SsBRV1侵染的菌株，菌株Ep-1PNA367作为阴性对照，携带卫星RNA的菌株SCH941R7作为阳性对照；F，0.7%的琼脂糖电泳分析SsBRV1的dsRNA1和dsRNA2；G，RT-PCR检测SsBRV1侵染的菌株中dsRNA1、dsRNA2以及dsRNA3，预期的目标片段大小分别是533bp、611bp和487bp。Satl(+)indicatesSsBRV1-infectedtransfectantscarryingtheSatlRNA,whereasSatl(-)indicatesSsBRV1-infectedtransfectantslosingtheSatlRNA.A,Colonymorphology.AllofthestrainswereculturedonPDAfor10daysat20-22°C;B,Virulencetestonthedetachedleavesofrapeseed;C,Statisticalanalysisofthelesionsize;D,Statisticalanalysisofthegrowthgrate.TheerrorbarsindicatetheSDfromthreesamplemeans.“*”aresignificantlydifferentattheP<0.05levelofconfidence98 核盘菌新型RNA病毒研究accordingtoDuncan’smultiplerangetest;E,1%agarosegel-electrophoresedanalysisofdsRNAfromSsBRV1-infectedtransfectants.SCH941R7(shownasR7)wasusedasthepositivecontrol;F,TheupperdsRNAbandfromSsBRV1-infectedtransfectantswasfurtherisolatedin0.7%agarosegelandrunin0.5×TBEbufferfor16hat50V;G,RT-PCRconfirmationoftheSsBRV1-infectedtransfectants.SCH941R7(shownasR7)wasusedasthepositivecontrol.ThepredictedsizesoftheRT-PCRproductswere553,611,and487bp.4.3.6SsBRV1基因组结构比较典型的双节段dsRNA病毒包括Birnaviruses、Picobirnaviruses、Partitiviruses，我们选取了这些病毒与SsBRV1以及BpRV1的基因组结构进行比较。尽管这些双节段dsRNA病毒基因组都含有2条dsRNA片段，但是SsBRV1的基因组明显要大很多（12.4Kbp），Birnaviruses的基因组大小为5.9-6.9Kbp，Picobirnaviruses的基因组大小为3.9-4.5Kbp，Partitiviruses的基因组大小为2.8-4.8Kbp（Delmasetal.,2011;Ghabrialetal.,2011）。尽管这些双节段dsRNA病毒的dsRNA1和dsRNA2的5’端序列都存在一定的相似性，但是远远没有SsBRV1的两条dsRNA片段之间序列保守。值得注意的是，Birnaviruses和Picobirnaviruses的dsRNA1编码病毒的外壳蛋白（CP），dsRNA2编码病毒的RdRp；在双分病毒Partitiviruses中，正好相反，dsRNA1编码病毒的RdRp，而dsRNA2编码病毒的CP。但是SsBRV1的dsRNA1编码病毒的cap-pol融合蛋白，并且dsRNA2也编码病毒的CP。SsBRV1的ORF1与ORF2之间的氨基酸序列有显著的相似性，而前面3种典型的双节段dsRNA病毒的ORF1与ORF2之间没有这种特性。Birnaviruses和Picobirnaviruses的dsRNA1与dsRNA2包装在同一个病毒粒子中，Partitiviruses的dsRNA1与dsRNA2分别包装在不同的病毒粒子中，考虑到SsBRV1的基因组大小，并且病毒粒子中的dsRNA1与dsRNA2比例并不同，dsRNA2的含量明显比dsRNA1的含量多（图4.7C），因此可以推定SsBRV1的dsRNA1与dsRNA2可能包装在不同的病毒粒子中。综上所述，这些典型的双节段dsRNA病毒与SsBRV1在基因组大小、基因表达策略以及进化关系上都存在明显的区别。4.3.7SsBRV1在子囊孢子后代带毒率检测通过诱导菌株Ep-1PNA367和携带SsBRV1的菌株Satl(+)产生子囊孢子，我们在子囊孢子的后代中通过RT-PCR检测了SsBRV1的存在情况。结果表明，在检测的21个菌株中，只有3号菌株能够检测到SsBRV1的目标片段，而且病毒的含量很低（图4.11），因此SsBRV1不能通过子囊孢子有效地传递给后代。99 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文图4.10SsBRV1与典型的双节段dsRNA病毒基因组结构比较，其中包括Birnavirus、Picobirnavirus以及Partitivirus。Fig.4.10GenomecomparisonbetweenSsBRV1andthetypicalbipartitedsRNAvirusesincludingBirnavirus,Picobirnavirus,Partitivirus.Theselectedvirusesarelistedasfollows:BpBV1,Botrytisporribotybirnavirus1;IPNV,Infectiouspancreaticnecrosisvirus;IBDV,Infectiousbursaldiseasevirus;HPV,Humanpicobirnavirus;BCV1,Beetcrypticvirus1;andCcVF17,CannabiscrypticvirusisolateFedora17.100 核盘菌新型RNA病毒研究图4.11SsBRV1相关菌株有性世代及子囊孢子再生菌株带毒率检测Fig.4.11ThesexualphaseofSsBRV1-relatedstrainsandRT-PCTdetectionforstrainsgeneratedfromascospores.A1，菌株Ep-1PNA367产生的子囊盘；A2，菌株Ep-1PNA367子囊盘中的子囊；A3，菌株Ep-1PNA367的子囊孢子；B1，菌株Satl(+)产生的子囊盘；B2，菌株Satl(+)的子囊；B3，菌株Satl(+)的子囊孢子；C，RT-PCR检测子囊孢子后代的带毒率，核盘菌的Actin基因作为内参，RT-PCR所用引物见4.2.9，预期的目标片段大小分别是533bp，611bp。A1,TheapotheciumofstrainEp-1PNA367;A2,TheascusofstrainEp-1PNA367;A3,TheascosporesofstrainEp-1PNA367;B1,TheapotheciumofstrainSatl(+);B2,TheascusofstrainSatl(+);B3,TheascosporesofstrainSatl(+);C,RT-PCRdetectionforSsBRV1andprimersusedherewerelistedin4.2.9.TheActingenewasusedasthecontrol.ThepredictedPCRproductswere533bp,611bp.101 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文4.4讨论SsBRV1在亲缘关系上，与来自灰霉的双节段dsRNA病毒BpRV1最近，并且它们之间也有相同的一些分子特性，但是SsBRV1与BpRV1也有明显的区别。SsBRV1对核盘菌的菌落形态没有显著的影响，并且SsBRV1侵染的核盘菌仍具有较强的致病力（图4.9A，B）。而BpRV1能够引起其寄主真菌Botrytisporri产生典型的弱毒症状，几乎完全丧失致病力（Wuetal.,2012）。S.sclerotiorum和B.porri具有许多相同的发育和生理特点，并且均属于同一个分类单元，即核盘菌科（Sclerotiniaceae），有意思的是亲缘关系相近的病毒SsBRV1与BpRV1在亲缘关系相近的寄主中却引起完全不同的症状。因此探讨SsBRV1能否侵染灰霉以及能够引起什么样的表型是一个很有意思的课题，有待进一步的研究。同时，我们发现SsBRV1与BpRV1均具有球形的病毒粒子，SsBRV1病毒粒子的直径（38nm）略大于BpRV1的病毒粒子（35nm）。SsBRV1与BpRV1病毒粒子结构和特点有以下区别：一是SsBRV1也发现有3个外壳蛋白，但是大小与BpRV1明显不同。SsBRV1的外壳蛋白分子量大小分别是120KDa、100KDa、80KDa，即p120、p100、p80，而BpRV1外壳蛋白分子量大小分别是85KDa、80KDa、70KDa，即p85、p80、p75。二是SsBRV1的ORF1编码较小的蛋白p100和p80，而ORF2编码较大的蛋白p120；而BpRV1的ORF1编码较大的蛋白p85和p80，ORF2编码较小的蛋白p75。三是SsBRV1的dsRNA1和dsRNA2在病毒粒子中含量并不相同，而BpRV1在病毒粒子中的含量是相同的。SsBRV1和BpRV1的这些区别可能依赖于不同的寄主，也可能是这两个病毒对其寄主影响差异很大的原因。SsBRV1含有一个卫星RNA片段，且对核盘菌的致病力及生长速度有显著的影响（图4.9）。双节段dsRNA病毒也可能含有卫星RNA或缺陷型RNA（Rongetal.,2002;Tuomivirtaetal.,2005;Liuetal.,2008;Zhangetal.,2013;Chibaetal.,2013）。病毒的卫星RNA能够影响寄主的症状，表现为加强、减弱和调控寄主的毒力（Kaperetal.,1977;Waterworthetal.,1979）。同样，病毒卫星RNA的构象可能通过调控病毒或寄主的因子及复制信号进而影响病毒的生物学特性（Annamalaietal.,2003;Simonetal.,2009;Huangetal.,2009）。此外，真菌双分病毒的缺陷型dsRNA能够作为干扰RNA影响病毒的复制，进而影响实验菌株C.parasitica的表型（Chiaetal.,2013）。因此，SsBRV1的卫星RNA可能通过多种机制影响核盘菌的毒力。SsBRV1的dsRNA1和dsRNA2具有非常保守的5’UTR（图4.2A，4.3A），这样长且严格保守的末端序列，除BpRV1和RnMBV1外，在其它双节段dsRNA病毒以及多节段dsRNA病毒都很少见。值得注意的是，SsBRV1的ORF1和ORF2的起始密码子ATG并不在保守的5’UTR中（图4.3A），而BpRV1两个ORF的起始密102 核盘菌新型RNA病毒研究码子包含在保守的末端序列之中。另外，SsBRV1的ORF1和ORF2均编码一个大的多聚蛋白，这两个大的多聚蛋白如何形成外壳蛋白p120、p100、p80以及病毒的RdRp，还需要进一步的研究。全病毒UmV-H1也只含有一个ORF，推定编码一个多聚蛋白，这个多聚蛋白含有一个papain-like蛋白酶，能够自我剪切进而形成病毒的CP和RdRP（Kangetal.,2001）。在一些Birnaviruses中，ORF2也能够产生前体蛋白，在病毒粒子的组装过程中通过自我加工形成病毒的CP（Delmasetal.,2011）。SsBRV1似乎也是采用了这种翻译后加工的机制。我们还注意到，SsBRV1的ORF2含有一个生长激素受体结合蛋白的功能域GHBP（图4.2B）。生长素（GH）是一类进化保守的蛋白类激素，广泛存在于人、老鼠、牛、鸡、猪等多种高等动物中，能够调控脂类、糖类以及矿物质的代谢，进而对细胞的代谢和分化产生多种影响（Kopchicketal.,2000）。GH需要与相应的受体作用才会发挥作用，即生长素受体（GHR）。生长素受体结合蛋白（GHBP）是通过生长素受体（GHR）蛋白剪切作用或其mRNA的可变剪切产生的GHR截短的形式，能够与GHR竞争性地结合生长素（GH），进而作为GH的储存器或负调控因子以维持GH的生理浓度（Gonzalezetal.,2007）。我们推测真菌中可能也含有类似生长素的蛋白及调控系统，然而我们在所有的真菌基因组中并没有检测到GH及GHR的同源蛋白。GHR蛋白不仅仅要结合相应的信号分子，还在信号通路中发挥着相应的功能，换句话说，一个蛋白除了含有结合功能域外，还需要其它的功能域才能发挥某种功能。真菌是低等的真核生物，与哺乳动物在很多方面有很大的差异，如果真菌的某个蛋白含有一个类似于GHBP的结合结构域，该蛋白在功能上与GHR可能有很大的差异，这也可能解释为什么真菌基因组中没有GH或GHR同源蛋白。系统发育分析结果显示，SsBRV1与单组分的dsRNA病毒以及四节段的Quadriviruses和Chrysoviruses具有比较近的亲缘关系（图4.8B）。这里我们就会产生一个问题，多节段的dsRNA病毒是由单节段的dsRNA病毒产生，还是单节段的dsRNA病毒由多节段的dsRNA病毒产生。有意思的是，巨型双节段dsRNA病毒RnMBV1具有2条dsRNA基因组，但是在田间采集的一些Rosellinianecatrix菌株中发现，RnMBV1的dsRNA2可以丢掉（Kanematsuetal.,2014）。Liuetal.（2012）指出单组分的dsRNA病毒，即使Totiviruses也并不是单系起源的，而是由多个进化世系分别进化形成的。因此，关于不同节段dsRNA病毒之间的进化关系还不是很清楚。通过本章内容研究，我们发现双节段dsRNA病毒在进化上与单组分dsRNA病毒以及四组分dsRNA病毒之间有着比较近的亲缘关系，同时表现出与BpRV1不同的生物学特性，丰富和深化了病毒学的种类及内容，同时有助于我们了解和揭示病毒的进化关系。103 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文第五章呼肠孤病毒SsReV1分子特性及生物学特性研究5.1引言呼肠孤病毒（Reoviruses）是最大的病毒科之一，具有广泛的寄主范围，包括植物、节肢动物、鱼、哺乳动物和真菌等等，目前具有15个属，基因组含有多个dsRNA片段，包括9、10、11或12个dsRNA片段（Attouietal.,2012）。该科病毒都具有球形的病毒粒子，直径大小为60-80nm，根据病毒粒子是否具有“刺突”结构，分为有刺突呼肠孤病毒亚科（Spinareovirinae）和无刺突呼肠孤病毒亚科（Sedoreovirinae）两个亚科，其中有刺突病毒亚科包括9个属，无刺突病毒亚科包括6个属。目前，真菌中报道的呼肠孤病毒有3个，但是在数据库中有2个真菌呼肠孤病毒的信息，分别是侵染板栗疫病菌的Cryphonectriaparasiticamycoreovirus-1(MyRV-1)和侵染紫纹羽病菌的Rosellinianecatrixmycoreovirus-3(MyRV-3)。其中，MyRV-1有11条dsRNA片段，大小在4.2-0.73Kbp之间；MyRV-3有12条dsRNA片段，大小在4.2-0.9Kbp之间（Hillmanetal.,2004;Osakietal.,2002）。已经报道的MyRV-3和MyRV-1的病毒粒子具有刺突状结构，属于有刺突呼肠孤病毒亚科。这两个真菌呼肠孤病毒均能够引起寄主产生严重的弱毒特性。本研究在核盘菌菌株SCH941中发现了一个呼肠孤病毒，命名为SclerotiniasclerotiorumReovirus1（SsReV1），该病毒与双节段dsRNA病毒SsBRV1共同侵染菌株SCH941，本章就SsReV1的基因组结构、分子特性、病毒粒子形态及结构、进化地位以及生物学特性进行了较为详细的研究。5.2材料与方法5.2.1试验材料菌株SCH941，于2010年采集自四川省雅安市荥经县，菌株EP-1PNA367见3.2。5.2.2生物学特性核盘菌菌株分离、致病力测定、生长速度测定、菌落形态观察见3.3.1。5.2.3核盘菌的原生质体再生核盘菌的原生质体再生参见肖雪琼（2013）博士学位论文。104 核盘菌新型RNA病毒研究5.2.4dsRNA提取dsRNA提取参见刘慧泉（2011）博士学位论文。5.2.5SsReV1全长cDNA的克隆SsReV1的序列克隆，末端序列克隆、PCR产物连接转化测序参见4.2.5。5.2.6SsBRV1病毒粒子特性SsBRV1病毒粒子的提取、病毒粒子观察、PEG介导的转染以及结构蛋白的鉴定参见3.3.4。5.2.7dsRNA的Northernblot分析SsReV1的Northernblot分析参见4.2.7。5.2.8序列分析和系统发育分析所用到的生物信息学软件序列编辑、ORF预测、序列同源性搜索、蛋白序列比对、蛋白模型预测、系统发育分析参见3.3.6。5.2.9SsReV1RT-PCR检测和Northernblot所用引物表5.1SsReV1分析和检测所用引物Table5.1PrimerinformationusedtoanalysisforSsReV1PrimerSequence(5’-3’)TmPositionRolesReV1S1-FATGCCTATTCTCTTCTTCCAACTGC62.71000-1025ForNorthernblotanalysis;SsReV1detectionReV1S1-RCGGTGTAATTTATCCCATAGCTCACT62.61578-1604ReV1S2-FTGCCATTGAGTCCGTTTCGC64.12347-2367ForNorthernblotanalysisReV1S2-RCGTTTGGACGGCAGTTGAATG63.72976-2997ReV1S3-FCATTGGACAAACGGATTTTACGG63.51716-1739ForNorthernblotanalysisReV1S3-RTTATTACCGCCATTTTCGCCTT63.12330-2352ReV1S4-FTACGCCGCTCACTGATCTTGTC63579-601ForNorthernblotanalysisReV1S4-RTCGATTCGGATTGGTCTTTAGTTG62.61242-1266ReV1S5-FATGAACGCAATCAATGGCTTACAG63.4691-715ForNorthernblotanalysisReV1S5-RCCAAGCCGAGTTTTTGATGTCCT64.51209-1232ReV1S6-FTACGGCATCCACCCCAATACTC63.5665-687ForNorthernblotanalysisReV1S6-RTGAAGTTCGGGCTAAGAGTGTCG63.51138-1161ReV1S7-FGCTGAGAGCGTTGCGGAAGT62.81225-1245ForNorthernblotanalysisReV1S7-RCTCCGTTCGGTTTCATCCAAGT631806-1828ReV1S8-FCCCCATTAGCGGATAGAATAGCAG65412-436ForNorthernblotanalysisReV1S8-RAATAATCCATCCGCCAAAGACG63.1966-988ReV1S9-FGCAACGCCAGGTCCTACAGC62.9359-339ForNorthernblotanalysisReV1S9-RGCCTTGAAGACTGGCATAAGAGAAG65943-968ReV1S10-FCCAAAATGATGCGTTGCCCG66.6436-456ForNorthernblotanalysisReV1S10-RGCGTTTGTAGCGAGTTGGGAC62.21154-1175ReV1S11-FTTTCCGCAACAACCCAAGCC65.4447-467ForNorthernblotanalysisReV1S11-RCGGTAGATTGATTTTCGGTCAGG62.8957-978ReV1S12-FGCTGAATCCGTTCGTGATCTGTC63.4279-302ForNorthernblotanalysisReV1S12-RGAATACCCTTTGCCTGCCCC63.2910-930105 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文5.3结果与分析5.3.1菌株SCH941及其相关菌株的生物学特性图5.1SsReV1相关菌株生物学特性Fig.5.1ThebiologicalpropertiesofSsReV1-relatedstrainsA，菌落形态；B，致病力测定；C，病斑大小统计；D，生长速度统计；统计分析均采用3个重复，显著性检验水平为0.05；E，SsReV1相关菌株的dsRNA电泳分析，菌株SCH941作为阳性106 核盘菌新型RNA病毒研究对照（简写为941）；F，SsReV1相关菌株的RT-PCR，菌株SCH941作为阳性对照简写为941。菌株SCH941R15、SCH941R117、SCH941R124、SCH941R155分别来自SCH941原生质体再生的菌株，分别简写为R15、R117、R124、R155。A,Thecolonymorphologyofdifferentstrains;B,Virulencetestondetachedleavesofrapeseed;C,StatisticalanalysisoflesionsizeamongSsReV1-relatedstrains.D,StatisticalanalysisofgrowthrateamongSsReV1-relatedstrains.MeansfollowedbythedifferentlettersonthetopofeachcolumnaresignificantlydifferentattheP<0.05levelofconfidenceaccordingtoDuncan’smultiplerangetest.E,AgarosegelanalysisofdsRNAsfromSsReV1-relatedstrains.StrainSCH941(shownas941)wasusedasthepositivecontrol.F,RT-PCRdetectionofSsReV1andSsBRV1fromSsReV1-relatedstrains.StrainSCH941(shownas941)wasusedasthepositivecontrol.StrainsR15,R117,R124,R155indicatedstrainSCH941R15,SCH941R117,SCH941R124,SCH941R155generatedfromtheprotoplastsofstrainSCH941.菌株SCH941表现出严重的弱毒症状，该菌株前期研究表明感染了两个dsRNA病毒，即双节段dsRNA病毒SsBRV1和呼肠孤病毒SsReV1，并且SsBRV1对菌株SCH941的表型没有显著影响。通过原生体再生，我们得到了只含有SsReV1的菌株SCH941R15、R117SCH941（分别简写为R15、R117）和不含病毒的菌株SCH941R124、SCH941R155（分别简写为R124、R155）（图5.1E，F）。菌落形态比较发现，相对于原始菌株SCH941，只携带SsReV1的菌株R15、R117菌落形态正常，有大量菌核产生且均匀分布在菌落的周围（图5.1A），生长速度快（图5.1D），致病力强，能够在离体的油菜叶片上产生较大的病斑（图5.1B）；相对于不携带病毒的菌株R124和R155，只携带SsReV1的菌株R15、R117没有明显的表型变化（图5.1A），致病力和生长速度均没有显著的差异（图5.1B，D）。因此，呼肠孤病毒SsReV1表现为隐性侵染，即对核盘菌的表型没有显著的影响。5.3.2SsReV1基因组结构和特性SsReV1基因组含有11条dsRNA片段（图5.2A），大小分布在1-5Kbp，根据分子量大小分别命名为S1-S11，这11条dsRNA片段来自SsReV1的病毒粒子，且分子摩尔数近似相等，说明这11条dsRNA是由同一个病毒粒子包装在一起。通过序列克隆我们得到了SsReV1的全基因组序列，全基因组大小为28055bp，GC含量为42.6%，其中S1大小为4450bp，GC含量为43.0%；S2为3966bp，GC含量为43.2%；S3为3749bp，GC含量为42.2%；S4为2888bp，GC含量为41.8%；S5为2625bp，GC含量为42.2%；S6为2223bp，GC含量为42.6%；S7为2085bp，GC含量为42.8%；S8为1954bp，GC含量为42.4%；S9为1628bp，GC含量为42.0%；S10为1279bp，GC含量为42.6%；S11为1218bp，GC含量为43.8%。S1只含有107 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文1个ORF（ORF1，nt20-4400），5’UTR长为19bp，3’UTR长为49bp；S2只含有1个ORF（ORF2，nt39-3888），5’UTR长为38bp，3’UTR长为78bp；S3只含有1个ORF（ORF3，nt20-3662），5’UTR长为19bp，3’UTR长为86bp；S4只含有1个ORF（ORF4，nt374-2639），5’UTR长为373bp，3’UTR长为249bp；S5含有1个ORF（ORF5，nt53-2546），5’UTR长为52bp，3’UTR长为68bp；S6含有2个ORF，ORF6-1（nt141-1437）和ORF6-2（nt1905-2172），5’UTR长为140bp，3’UTR长为50bp；S7含有1个ORF（ORF7，nt29-2012），5’UTR长为28bp，3’UTR长为73bp；S8含有1个ORF（ORF8，nt23-1876），5’UTR长为22bp，3’UTR长为77bp；S9含有1个ORF（ORF9，nt24-1551），5’UTR长为23bp，3’UTR长为77bp；S10含有1个ORF（ORF10，nt28-1159），5’UTR长为27bp，3’UTR长为119bp；S11含有2个ORF，ORF11-1（nt27-282）和ORF11-2（nt256-1132），5’UTR长为26bp，3’UTR长为86bp（图5.2B，表5.2）。因此，SsReV1含有至少13个ORF,其中S6和S11含有2个ORF，而其它dsRNA片段都只含有1个ORF。我们还发现，除S4和S6外，S1-S12的3’UTR长度均大于5’UTR，有意思的是，S4的5’UTR和3’UTR最长，分别是373bp和249bp，远远大于其它dsRNA片段的5’UTR（19-52bp）和3’UTR（49-119bp），S6也具有较长的5’UTR（140bp），但是每个dsRNA片段UTR大小的作用还不清楚，还需要进一步的研究和探索。我们发现S1-S11的末端序列均严格保守，均含有保守的序列“5’-GAGWUKK-------UGCAGUC-3’”，其中标有下划线的核苷酸是严格保守的（图5.2）。根据S1-S11的大小及相应的ORF，我们将所编码的蛋白依次命名为VP1-VP11，其中S6和S11含有2个ORF，所对应的蛋白分别为VP6-1、VP6-2和VP11-1、VP11-2。Blast分析表明，VP1与Coltivirus属的Coloradotickfevervirus（CTFV）、Eyachvirus（EYAV）以及真菌呼肠孤病毒MyRV-1的VP1具有显著的相似性（表5.3），并且含有呼肠孤病毒RdRp保守的motif（aa850-852），这3个病毒的VP1均为病毒的RdRp，因此推定SsReV1的VP1是病毒的RdRp蛋白，负责病毒的复制和繁殖。SsReV1的VP2与CTFV、EYAV以及MyRV-1的VP2均具有显著的相似性（表5.3），CTFV的VP2是病毒的甲基转移酶（Methyltransferase），同时还可以作为细胞的受体蛋白（cell-receptor），因此SsReV1的VP2可能是病毒的甲基转移酶，同时，也可能作为细胞的受体蛋白。SsReV1的VP5分别与Eyachvirus的VP4和Coloradotickfevervirus的VP4具有显著的相似性（Evalue=3e-08，Evalue=9e-08）（表5.3），CTFV和EYAV的VP4的功能未知。SsReV7的VP7蛋白尽管没有得到具有显著相似性的序列，但是在氨基酸区域aa296-396之间含有一个呼肠孤病毒外壳蛋白的一个保守结构域Reo_sigmaC（ReovirussigmaCcapsidprotein，5.26e-05），因此VP7可能参与SsReV1108 核盘菌新型RNA病毒研究病毒粒子的形成。SsReV1的VP8分别与Coloradotickfevervirus和Eyachvirus的VP10具有显著的相似性（Evalue=2e-05和Evalue=2e-04）（表5.3），CTFV的VP10是病毒的激酶（Kinase）和螺旋酶（helicase）。而其余的蛋白均没有检测到具有显著相似的蛋白，因此功能还有待进一步研究。DELTA-Blast（DomainEnhancedLookupTimeAcceleratedBlast）分析表明，VP6-1的氨基酸序列（aa239-320）与多种细菌的核糖核酸酶III（ribonucleaseIII）具有极显著的相似性（Evalue<1e-10）表（5.3），其中包括阿拉伯糖醋杆菌（Acetohalobiumarabaticum）、普通热脱硫杆菌（Thermodesulfobacteriumcommune）、极端耐热菌（Marinitogapiezophila）、梭菌科细菌（Clostridiaceaebacterium）、口腔纤毛菌（Leptotrichiabuccalis）、厌氧氨氧化菌（CandidatusKueneniastuttgartiensis）。细菌核糖核酸酶III能够剪切双链的核糖体RNA（rRNA），参与到rRNA前体的加工和剪切过程。细菌核糖核酸酶III含有一个dsRNA结合motif（pfam00035）和ribonucleaseIII功能域（pfam00636），而真核生物的ribonucleaseIII蛋白分子量更大，定位在细胞核中。同时，我们还发现VP6-1的区域（aa253-317）含有一个保守的DSRM功能域（Double-strandedRNAbindingmotif，pfam00035，Evalue=2.04e-3），同时含有该功能域保守的motif和氨基酸残基（图5.5）。DELTA-Blast分析还发现，VP7的氨基酸序列（aa296-565）与多种真菌的假定蛋白具有极显著的相似性（（Evalue<1e-10）表5.3），并且该区域含有一个保守的Atg14功能域（UVradiationresistanceproteinandautophagy-relatedsubunit14，pfam10186，Evalue=2.26e-03），此功能域在细胞自噬过程和囊泡蛋白分类中起着重要作用。多序列比对结果表明VP7含有Atg14功能域保守的motif和氨基酸残基（图5.6）。同时，SsReV1病毒粒子中的vRNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，分别根据S1-S11的序列设计特异性引物，制备相应的探针（表5.1），用地高辛标记探针，进行Northernblot分析。结果表明S1-S11的探针均能够特异性地检测SsReV1基因组中相应的11条dsRNA片段（图5.4），进一步证明SsReV1的基因组含有11条dsRNA片段。109 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文图5.2SsReV1基因组结构Fig.5.2ThegenomicorganizationofSsReV1A，1%琼脂糖凝胶电泳分析SsReV1病毒粒子中的RNA（vRNA），可以观察到11条dsRNA片段，大小在5-1Kbp，DNAMarker为DL5000（TaKaRa，China）；B，SsReV1基因组S1-S11的结构和大小，方框表示ORF，实线表示非翻译区，dsRNA、ORF大小都已标注。ORF6和ORF7上鉴定的功能域已标出。A,1%agarosegelanalysisofSsReV1vRNAreleasedfromviralparticles.11dsRNAsegmentswithsizesrangingfrom5Kbpto1Kbpwereobserved.TheDNAmarkerwasDL5000(TaKaRa,China);B,ThegenomeorganizationandsizeofeachdsRNAsegment.TheboxindicatedtheORFandthesolidlineindicatedtheuntranslatedregion.AllthesizesofeachdsRNAsegmentandORFwereindicated.ConserveddomainsidentifiedonORF6andORF7wereindicated,respectively.110 核盘菌新型RNA病毒研究图5.3SsReV1末端保守的序列，保守的序列用粗字体表示Fig.5.3TheconservedterminalsequencesofSsReV1werebold图5.4SsReV1基因组Northernblot分析Fig.5.4NorthernblotanalysisofSsReV1genomeNorthernblot分析用的引物未知见表4.1，dsRNA来自病毒粒子，用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析，探针用地高辛标记。dsRNAsreleasedfromviralparticleswereseparatedon1%agarosegelandstainedwithEthidiumBromide.TheprimersusedforNorthernblotanalysiswerelistedinTable4.1andtheprobeswerelabeledwithdigoxigenin.111 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文图5.5多序列比对分析VP6-1含有的DSRM保守结构域，保守的氨基酸位点用灰色标示Fig.5.5SequencealignmentofDSRMdomainpresentinVP6-1,theconservedaminoacidresiduesareshadeingraycolor.Sc2LBS，酿酒酵母dsRNA结合功能域；MOLU，西方X植原体；DANRE，斑马鱼；ANOGA，冈比亚按蚊；DROME，果蝇；XENLA，非洲爪蛙；TETFL，绿河鲀；HUMAN，智人；ARATH，拟南芥。Sc2LBS,S.cerevisiaedsRNAbindingdomain;VP6-1,SsReV1VP6-1;MOLU,WesternXphytoplasma;DANRE,Daniorerio;ANOGA,Anophelesgambiae;DROME,Drosophilamelanogaster;XENLA,Xenopuslaevis;TETFL,Tetraodonfluviatilis;HUMAN,Homosapiens;ARATH,Arabidopsisthaliana.图5.6多序列比对分析VP7含有的Atg14保守结构域，保守的氨基酸位点用灰色标示Fig.5.6SequencealignmentofAtg14domainpresentinVP7,theconservedaminoacidresiduesareshadeingraycolor.YARLI，耶罗维亚酵母；KLULA，乳酸克鲁维酵母；ASHGO，棉阿舒囊霉；YEAST，酿酒酵母；VANPO，酵母；CHAGB，球毛壳菌；ASPFL，黄曲霉；ASPFU，烟曲霉；Zea，玉米。YEAST,Saccharomycescerevisiae;VANPO,Vanderwaltozymapolyspora;CHAGB,Chaetomiumglobosum;ASPFL,Aspergillusflavus;ASPFU,Aspergillusfumigates;Zea,Zeamays112 核盘菌新型RNA病毒研究表5.2SsReV1S1-S11基因和蛋白性质Table5.2OverviewofgenesandproteinsonS1-S11ofSsReV1GeneproteinGenomeLength5'UTR3'UTRPositionProteinLengthIsoelectricPredictedfunctionsegmentGC%MM(kDa)(bp)(bp)(bp)ofORF(nt)designation(aa)point(pI)putativeRNA-dependentS1445043.0194820-4400VP11460164.78.91RNApolymeraseS2396643.2387639-3888VP21283143.75.7Methyltransferase,cell-receptorS3374942.2198520-3662VP31214135.76.49hypotheticalproteinS4288841.8373247374-2639VP475583.46.26hypotheticalproteinS5261542.2526753-2546VP583191.36.62StructuralproteinS6222342.614049141-1439VP6-143248.96.16hypotheticalprotein1905-2174VP6-2899.711.21hypotheticalproteinS7208542.8287129-2012VP766172.16.39hypotheticalproteinS8195442.4217622-1876VP861869.87.84Kinase,helicase,structuralproteinS9162842.0237524-1551VP950957.35.84StructuralproteinS10127942.62711828-1159VP1037742.24.65hypotheticalproteinS11121843.8268427-284VP11-1859.79.18hypotheticalprotein256-1134VP11-229232.57.89hypotheticalprotein113 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文表5.3SsReV1蛋白Blast比对结果Table5.3TheBlastresultsofSsReV1proteinsThematchedregionBLASTAccessionNO.ThehitsnameSsReV1proteinsThehits(aa)IdentityBitscoreCoverageEvalueEyachvirusVP1(113-1450)RdRp(96-1433)27%42691%1e-121NP_620280.1ColoradotickfevervirusVP1(107-1450)RdRp(88-1433)27%42292%4e-120NP_690891.1Mycoreovirus1VP1(155-1429)VP1(98-1330)27%39387%1e-110YP_001936004.1Mycoreovirus3VP1(166-1433)RdRp(107-1340)27%34486%2e-94YP_392478.1EyachvirusVP2(165-1204)VP2(150-1192)21%12381%6e-25NP_620281.1Mycoreovirus1VP2(70-1202)VP2(8-1148)22%11988%9e-24YP_001936005.1ColoradotickfevervirusVP2(166-1204)VP2(143-1184)21%11880%2e-23NP_690892.1Mycoreovirus3VP2(218-1234)VP2(158-1173)21%90.179%1e-14YP_392476.1EyachvirusVP5(553-788)VP4(768-1005)23%68.228%3e-08NP_620283.1ColoradotickfevervirusVP5(553-761)VP4(768-978)24%66.625%9e-08NP_690894.1AcetohalobiumarabaticumVP6-1(239-318)ribonucleaseIII(161-234)21%10318%7e-22WP_013277993.1ThermodesulfobacteriumVP6-1(250-324)ribonucleaseIII(160-238)25%10217%2e-21WP_038061080.1communeMarinitogapiezophilaVP6-1(249-320)ribonucleaseIII(165-236)19%10116%3e-21WP_041638834.1ThermodesulfobacteriumVP6-1(250-324)ribonucleaseIII(160-238)25%99.817%1e-20WP_028840705.1hveragerdenseClostridiaceaebacteriumVP6-1(250-318)ribonucleaseIII(168-236)22%99.815%2e-20WP_006308995.1LeptotrichiabuccalisVP6-1(242-318)ribonucleaseIII(155-231)19%99.017%3e-20WP_015769719.1Uncinocarpusreesii1704VP7(296-564)predictedprotein(22-266)13%14340%5e-33XP_002541961.1hypotheticalTalaromycesmarneffeiVP7(296-565)12%14140%3e-32XP_002150868.1protein(22-277)BudsiteselectionproteinTalaromycesmarneffeiPM1VP7(296-565)12%14040%5e-32KFX45804.16(40-295)hypotheticalCoccidioidesimmitisRSVP7(296-564)15%13540%2e-30XP_001248486.1protein(22-267)ParacoccidioidesbrasiliensishypotheticalproteinVP7(297-539)12%13236%1e-29EEH17472.1Pb03(23-249)hypotheticalHistoplasmacapsulatumVP7(297-539)12%13236%2e-29EEH06578.1protein(23-249)ColoradotickfevervirusVP8(394-616)VP10(375-597)26%58.236%2e-05NP_690899.1EyachvirusVP8(394-616)VP10(375-597)26%55.136%2e-04NP_620290.1114 核盘菌新型RNA病毒研究5.3.3SsReV1病毒粒子结构和特性从菌株SCH941R117中提取SsReV1的病毒粒子，透射电子显微镜TEM观察表明，SsReV1的病毒粒子呈球形，直径在65nm左右，病毒粒子表面没有发现有明显的刺突状结构（图5.7A）。提取病毒粒子中的dsRNA，经琼脂糖凝胶电泳分析发现与菌丝中提取的dsRNA具有相同大小的dsRNA和带型（图5.7B）。SDS-PAGE分析SsReV1病毒粒子的结构蛋白，结果表明，相对于遗传背景完全相同的不携带病毒的菌株SCH941R124，在提取SsReV1病毒粒子样品中可以观察到9个蛋白，分子量大小分别为165KDa、145KDa、102KDa、90KDa、65KDa、63KDa、57KDa、50KDa、30KDa，根据分子量大小分别命名为p165、p145、p102、p90、p65、p63、p57、p50、p30，其中p102、p90和p50在对照菌株中也存在，可能是寄主核盘菌的蛋白（图5.7C）。SsReV1病毒粒子样品中特异性的蛋白条带p165、p145、p65、p63、p57、p30进行了肽段指纹图谱鉴定（PMF-MS）。肽段指纹图谱鉴定分析结果表明，p165共鉴定出27个肽段，经过序列比对，这27个肽段能够匹配到VP1上，覆盖的范围为aa1-1407之间的氨基酸区域（表5.4），根据序列比对的信息，推测VP1应该负责编码SsReV1的RdRp蛋白，蛋白鉴定结果表明VP1是一个真实存在的蛋白，存在于SsReV1的病毒粒子中。p145共得到68个肽段，均匹配到VP2，覆盖的范围为aa54-1253，因此ORF2编码SsReV1的结构蛋白p145（表5.4）。p65共得到11个肽段，匹配到SsReV1的VP5，覆盖的范围为aa249-743，因此ORF5编码SsReV1的结构蛋白p65。p63共得到16个肽段，匹配到VP8，覆盖的范围为aa17-579，因此ORF8编码SsReV1的结构蛋白p63。p57共得到30个肽段，均匹配到VP9，覆盖范围为aa1-448，因此ORF9编码SsReV1的结构蛋白p57。p30共得到15个肽段，均匹配到VP9，覆盖范围为aa1-448，因此ORF9同样编码SsReV1的结构蛋白p30。由此可见，SsReV1的病毒粒子至少有p165、p145、p65、p63、p57共5个结构蛋白，而p30匹配到VP9的范围与p57相同，因此p30可能是p57的降解产物，也可能是SsReV1病毒粒子的一个结构蛋白，还需要进一步的实验验证。115 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文图5.7SsReV1病毒粒子形态及结构Fig.5.7VirusparticlesofSsReV1A，SsReV1病毒粒子形态；B，1%琼脂糖凝胶电泳分析菌株SCH941R117菌丝中的dsRNA以及病毒粒子中的dsRNA（vRNA），SsReV1的基因组11个dsRNA片段均已标出，DNAMarker为DL5000（TaKaRa，China）；C，SDS-PAGE电泳分析SsReV1的病毒粒子结构蛋白，SsReV1的病毒粒子菌株SCH941R117中提取（VP），遗传背景完全相同的菌株SCH941R124作为阴性对照（VF），蛋白的大小根据蛋白marker（PageRulerPrest，ThermoScientific）进行估计。A,ThemorphologyofSsReV1virusparticles;B,1%agarosegel-electrophoresedanalysisofdsRNAreleasedfrommyceliaandvirusparticles.The11dsRNAsegmentsS1-S11werelabeled.TheDNAmarkerwasDL5000(TaKaRa，China);C,SDS-PAGEgel-electrophoresedanalysisofthestructuralproteinsreleasedfromvirusparticles.VirusparticleswerepurifiedfromstrainSCH941R117,andtheisogenicstrainSCH941R124wasusedasthenegativecontrol.Themolecularweightofeachproteinwasestimatedastheproteinmarker(PageRulerPrest,ThermoScientific).表5.4SsReV1结构蛋白PMF-MS鉴定结果Table5.4PMF-MSanalysisofSsReV1structuralproteinPeptidesOMCM±DeltaPositionFrISMPP165GLPFGQR773.41773.42-0.00511215-1221110.55VP1QFFQVR823.42823.43-0.00931402-1407110.55VP1HLFPDLR896.48896.49-0.00581161-116717.55VP1SPHAPGITR934.49934.5-0.0101951-959110.55VP1FTIHADLLR1084.591084.6-0.0169937-94517.55VP1DTPFFFGGQK1142.521142.54-0.0156719-72816.23VP1EVLTSGFVFR1153.61153.61-0.0166782-79116.34VP1NFNAVALQER1160.581160.59-0.0179199-20816.34VP1STAEFDEDVR1167.491167.5-0.01421236-124513.74VP1VVLRPELNEK1195.671195.69-0.0231183-19216.51VP1MWIDDFQYR1288.531288.55-0.02211-924.11VP1VNATNAGYLASLR1348.681348.71-0.0293992-100419.34VP1LSNEFQFLGLPK1391.711391.74-0.03221106-111716.34VP1FGVPFPTAISVQR1417.731417.77-0.04451043-1055110.55VP1LIGQLQYVHGAVK1424.791424.81-0.0259116-12819.3VP1MFDAAAAYTTFLR1492.671492.7-0.0288591-60316.23VP1QNAIAGAPSMYPFR1537.71537.73-0.03904-91719.34VP1116 核盘菌新型RNA病毒研究VALADEYVASFQPR1564.761564.79-0.03261375-138814.19VP1QVFGFNTHYFVGR1570.731570.77-0.0341389-140119.35VP1GANVSLTNDPTVLDTER1800.851800.89-0.0387213-22913.88VP1FSENQMQALDSLTANR1839.821839.84-0.01731359-137414.19VP1FDWESYFFDIQTTR1853.81853.83-0.0301542-55513.88VP1IEDLVSHPVVEDYARK1868.921868.96-0.04051169-118414.54VP1ELSQQVGESDDAYYNR1872.781872.81-0.02871090-110513.74VP1LPLLSLIDHGFFVGYDQR2089.052089.1-0.0471143-116015.41VP1LFVDSMRFSENQMQALDSLTAN2704.112704.26-0.14971352-137414.37VP1P145FLYER726.38726.370.01491126-113016.34VP2EMASVAR762.38762.370.0087838-84416.34Vp2LLCAAIR815.48815.470.0082284-29018.55VP2SVFDVVR820.45820.440.0102477-48316.23VP2LELGAIGR827.5827.490.01361-36816.34VP2INESGYR837.41837.40.0138685-69116.34VP2DADELYR880.4880.390.011089-109513.88VP2VAGEEAWK888.45888.430.01321246-125314.26VP2ILDVDQIK942.54942.540.0038859-86614.11VP2NIAPQFEK945.5945.490.0067204-21116.34VP2KINESGYR965.49965.490.0016684-69119.3VP2VISALGGVTR971.58971.580.002940-949110.55VP2TMISANPNR1002.51002.490.0115436-444110.55VP2HAIFSALEK1014.551014.55-0.0001484-49217.55VP2TMISANPNR1018.51018.490.0098436-444110.55VP2DGPVVDAFGR1031.511031.50.0054801-81014.11VP2HVSDAWDFK1103.511103.50.0083369-37715.41VP2HPLLFFDHK1152.611152.610.0007778-78617.72VP2TIETPFSEMK1197.561197.560.0061811-82024.26VP2YPLAKPTPLER1283.721283.72-0.0048311-32119.3VP2HGEVAEIVQGNR1307.661307.660.0005617-62815.48VP2IQGVVLVQTDDK1313.711313.72-0.0047291-30214.11VP2DENIPATTPNDR1341.621341.620.003139-5013.88VP2VILYDASTYLGR1369.721369.72-0.0011629-64016.23VP2TYTVPAASQFPGR1393.71393.70696-70819.34VP2HFSFGYLAVETR1425.71425.7-0.0006212-22317.54VP2GLLTVVFNGLHYR1487.821487.82-0.00811131-114319.35VP2IQGVVLVQTDDKGK1498.831498.84-0.0075291-30416.34VP2TWAHPDAMYQIGK1532.711532.710.0003845-85727.54VP2QNAILQHGGTDGTLR1562.781562.78-0.00579-9327.55VP2VATSMDFQNFYGVK1606.861606.730.1295787-80036.23VP2TGAWAMAQQLIHER1626.791626.79-0.0069739-75227.55VP2AALLEVTLVDTTLDR1628.891628.9-0.00421174-118813.88VP2NLTGGAISGETDQKVR1645.771645.83-0.0581253-26816.51VP2AFAYPLGFVISEDVK1654.851654.86-0.0121461-47514.19VP2HPVIDAVDDAYSDPR1668.771668.77-0.0012954-96814.02VP2YTQNGHISNMITTIK1736.841736.84-0.0038269-28319.3VP2117 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文DWYSSTTFPVESYAK1779.791779.8-0.0073925-93914.19VP2AFAYPLGFVISEDVKR1810.951810.96-0.008461-47616.51VP2FFVFNGSDLPSTMPSIR1913.931913.93-0.0075821-83716.23VP2TGAWAMAQQLIHERMR1915.921915.90.0179739-754110.45VP2FFVFNGSDLPSTMPSIR1929.921929.93-0.0114821-83716.23VP2TGAWAMAQQLIHERMR1931.891931.9-0.004739-754110.45VP2HLTGQLTLGTLFSDPEIR1997.051997.06-0.0082903-92015.46VP2DGLGDFSFSYMGGQTIPTR2063.922063.93-0.0064642-66024.11VP2AQLCEAFFPSSNGDFLQR2085.942085.96-0.0135599-61624.19VP2DADPATIEGVLNGQTFTDEK2119.972119.99-0.022754-7313.61VP2DQNKHPVIDAVDDAYSDPR21542154-0.0023950-96814.16VP2EIMFPVLASYNPHIVNHTR2253.122253.14-0.0166580-59827.7VP2NPETTLMMNTLAYLNNNTAR2297.072297.08-0.0077661-68026.34VP2VVASAVKPILPIDDAPDPLILR2311.342311.35-0.00781192-121314.31VP2NPETTLMMNTLAYLNNNTAR2313.062313.07-0.009661-68016.34VP2YLDLATYFPLPNYVSNAVWR2401.192401.21-0.01921226-124516.23VP2KPMDLPDYSNLTVPSTLITEAK2433.192433.23-0.045994-11524.37VP2DLGETQIVTFIGPDEVFGDDIVR2534.242534.25-0.01121100-112213.51VP2ETTIGLSQYIAPTVFPDAIHADL2599.342599.35-0.0103180-20314.36VP2KLSFFGLAEVLHHIYYPAIESVSR2647.362647.38-0.0225755-77716.5VP2VGYSAVPIGSVTASFEYENELFD2649.252649.26-0.00581144-116713.78VP2RSRPSALQFITDMNLPELFSLATT2915.452915.47-0.0255709-73416.51VP2YGKP65FTVPVSR804.46804.450.0107580-586110.55VP5WLEYAVR935.49935.490.0044737-74316.34VP5TNHGAIIAR951.52951.52-0.0004357-365110.55VP5VVASGSYTGR995.51995.50.0112570-57919.34VP5VPGTDTPVTDVR1255.651255.640.0102721-73214.11VP5LHVVGAIPQAFK1278.741278.74-0.0082460-47119.69VP5FFSPISGEVDIK1337.681337.69-0.0025507-51814.19VP5YHEASADIGSVTHR1541.731541.720.0105274-28716.5VP5IAAGMGDLINLMNDLIR1860.941860.94-0.0079249-26524.11VP5GPQSDGALANLSIAGNDNGIR2039.0120390.004309-32914.11VP5P63SEFISR737.33737.37-0.044855-6016.34VP8IQQAAIAK841.46841.5-0.045259-26619.69VP8NYPDLQPK973.46973.49-0.029317-2416.23VP8ALFDHVLIK1054.561054.62-0.0571225-23317.55VP8ILYMITDGGR1153.531153.58-0.0529434-44326.23VP8LSQPGIWTLR1169.591169.66-0.062345-54110.55VP8EEAPSLFEWK1234.531234.59-0.0569465-47413.98VP8SLIVNPLAIAVR1264.721264.79-0.0694568-579110.55VP8ALFDHVLIKDPR1422.711422.8-0.0876225-23617.55VP8EFDPFGVSECVR1440.571440.63-0.0608445-45613.93VP8IAAPVLVTDVSHVEK1576.791576.88-0.089137-15115.46VP8118 核盘菌新型RNA病毒研究HPNYHNALLLENR1589.721589.81-0.087529-4117.7VP8KHPNYHNALLLENR1717.81717.9-0.102128-4119.31VP8SCGAATIFLGDITPLADR1876.831876.94-0.1004119-13614.11VP8QYYSMMNKEEAPSLFEWK2265.032264.960.0685457-47414.48VP8p57MVIEQR774.37774.41-0.0343211-21626.34VP9ALSFSTR780.37780.41-0.0468426-432110.55VP9FQEPGNR846.36846.4-0.043481-8716.34VP9IITTVFR848.47848.51-0.0432290-296110.55VP9IFHWEK858.4858.44-0.0431386-39117.55VP9TALAIDDR873.41873.46-0.0472219-22614.11VP9YSLDQQK880.39880.43-0.0413449-45516.23VP9FVFLFAPK967.5967.55-0.048688-9519.69VP9DITVYTHK975.46975.5-0.0421203-21017.54VP9KIITTVFR976.55976.61-0.0526289-296111.66VP9SANYYPTAR1041.441041.49-0.0458301-30919.17VP9NSDGTINVVR1073.491073.55-0.0532128-13716.23VP9LNDILDEFK1105.511105.57-0.0574227-23513.88VP9MMSQLATNAR1137.481137.53-0.0445376-385310.55VP9SDVDTAYSER1141.431141.49-0.054196-10513.88VP9SHIAIRDEPAK1235.671235.660.0116236-24617.55VP9QSFDFIVSIAR1264.581264.65-0.0655392-40226.23VP9MSSNDYINVSR1302.591302.540.0491-1116.23VP9MSSNDYINVSRHR1578.771578.720.0531-1319.35VP9SIAAGELVYPYASPR1592.731592.82-0.0883339-35316.45VP9FHPLTLLSTLATAEVK1739.871739.98-0.108433-44817.55VP9DLFTNYESNVSDYATIR2006.812006.92-0.116816-3213.88VP9ANSAPNSFVLNRPQLGALR2023.972024.09-0.123106-124112.5VP9ADSNEILYYIPGHPSAATLR2186.972187.1-0.130433-5215.46VP9ETVSLDALVQPNHTYTPFEQVR2543.112543.27-0.1595178-19914.42VP9FSETMPDIDLSEFSDQFALLDK2563.012563.17-0.1538258-27913.51VP9P30ALSFSTR780.34780.41-0.0681426-432110.55VP9MVIEQR790.33790.4-0.0665211-21626.34VP9FQEPGNR848.44848.370.07281-8716.34VP9TALAIDDR873.39873.46-0.0672219-22614.11VP9KIITTVFR976.53976.61-0.0818289-296111.66VP9SANYYPTAR1041.421041.49-0.0729301-30919.17VP9LNDILDEFK1105.481105.57-0.0859227-23513.88VP9MMSQLATNAR1153.461153.52-0.0647376-385110.55VP9QSFDFIVSIAR1264.551264.65-0.0902392-40226.23VP9MSSNDYINVSR1302.611302.540.0711-1116.23VP9SIAAGELVYPYASPR1592.71592.82-0.1212339-35316.45VP9FHPLTLLSTLATAEVK1739.851739.98-0.1324433-44817.55VP9TALAIDDRLNDILDEFK1960.921961.01-0.0925219-23513.88VP9Note:OM,ObservedMass;CM,CalculatedMass;Fr,Frequency;IS,IonsScore;MP,MatchedProtein119 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文5.3.4SsReV1的进化分析根据VP1，即病毒的RdRp蛋白，对SsReV1进行了系统发育分析，结果表明，呼肠孤病毒科可以分为两个大的类群，即Spinareoviruses和Sedoreoviruses，这两个亚群就是根据呼肠孤的病毒粒子有无“刺突”结构而成立的，显然有“刺突”结构的呼肠孤病毒之间的亲缘关系相对更近一些，无“刺突”结构的呼肠孤病毒之间的亲缘关系较近（图5.8）。SsReV1与呼肠孤病毒科已经成立的属Fijivirus、Coltivirus以及Mycoreovirus有比较近的亲缘关系，有着共同的分支，应该来自一个共同的祖先。有意思的是，SsReV1并不在已经成立的真菌呼肠孤病毒属内部，而是在Coltivirus和Mycoreovirus两个属的基部，Fijivirus和Coltivirus之间，并且具有很高的分值支持（98）。根据进化树的分支长度，SsReV1与Coltivirus亲缘关系更近，并且Blast结果也表明SsReV1与Coltiviruses的亲缘关系更近（表5.3）。因此，在分类上，SsReV1可能代表一个新的分类单位，并不属于已经成立的真菌呼肠孤病毒属。图5.8SsReV1的系统发育分析Fig.5.8PhylogeneticanalysisofSsReV1呼肠孤病毒科已经成立的病毒属都用来进行系统发育分析，SsReV1的位置用箭头标示，同时SsReV1分支的节点也用箭头标示，用来构建进化树的病毒列在表5.5中。EachgenusintheReoviridaewereusedforphylogeneticanalysis.SsReV1andthebranchofSsReV1wereindicatedasarrow.120 核盘菌新型RNA病毒研究表5.5用来进行系统发育分析的呼肠孤病毒的信息Table5.5Theinformationofreovirusesusedforphylogeneticanalysis.VirusFamilyVirusNameAbbreviationGenbankaccessionNo.AquareovirusChumsalmonreovirusCSVCHSRVAAL31497.1StripedbassreovirusSBRVAAM93410.1AmericangrasscarpreovirusAGCRVABV01040.1GoldenshinerreovirusGSRVAAM92745.1GrasscarpreovirusHZ08GCRV-HZ08ADJ75336.1ColtivirusColoradotickfevervirusflorioCTFV-FlNP_690891.1Eyachvirusfr578EYAV-Fr578NP_620280.1CypovirusDendrolimuspunctatuscypovirus1DpCPV-1AAN46860.1Bombyxmoricypovirus1BmCPV-1AAK20302.1Heliothisarmigeracypovirus14HaCPV-14ABB51571.1DinovernavirusAedespseudoscutellarisreovirusAPRVYP_443936.1FijivirusNilaparvatalugensreovirusIzumoNLRV-IzBAA08542.1FijidiseasevirusFDVYP_249762.1RiceblackstreakeddwarfvirusRBSDVCAC82519.1MycoreovirusMycoreovirus1MyRV1YP_001936004.1Mycoreovirus3MyRV3YP_392478.1Avianorthoreovirus-StellersealionOrthoreovirusARV-SSRVAED99918.1reovirusMammalianorthoreovirus1MRV-1P0CK32.1NelsonBayorthoreovirusNBRVAEQ49381.1OryzavirusRiceraggedstuntvirusThailandRRSV-ThNP_620541.1CardoreovirusEriocheirsinensisreovirusESRVAAT11887.1MimoreovirusMicromonaspusillareovirusMpRVYP_654545.1OrbivirusBluetonguevirus1BTV-1ACR58458.1Bluetonguevirus10BTV-10CAA31306.1IbarakivirusIBAVBAD89093.1EquineencephalosisvirusEEVACJ06234.1PalyamvirusPALVYP_052935.1Africanhorsesicknessvirus1AHSV-1ACJ06244.1StretchLagoonorbivirusSLOVYP_002925132.1PhytoreovirusRicedwarfvirusARDV-ABAA14222.1RicedwarfvirusHRDV-HBAA01074.1RicedwarfvirusChinesestrainRDV-ChNP_620544.1HomalodiscavitripennisreovirusHVRVACO37232.1RicegalldwarfvirusGXRGDV-GXABF67520.1RotavirusAvianrotavirusAAvRV-ABAA24146.2BovinerotavirusAstrainRFBoRV-AAAA47319.1EquinerotavirusAEpRV-AAGS43840.1HumanrotavirusHuRV-L26A3DSK5.1HumanrotavirusBHuRV-BYP_008126843.1HumanrotavirusHuRV-CQ91E95.1PorcinerotavirusYMPoRV-YMQ85036.1SeadornavirusBannavirusJKT6423BAV-JKT6423NP_694469.1KadipirovirusJKT7075KDV-JKT7075NP_694468.1LiaoningvirusNE97-31LNV-NE97-31AAQ83562.1UnclassifiedCimodovirusCiVAHF20715.1Reoviruses121 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文5.3.5SsReV1的生物学特性从菌株SCH941中提取SsReV1的病毒粒子，在PEG的作用下能够成功侵染菌株Ep-1PNA367的原生质体，得到了携带SsReV1的Ep-1PNA367-PT12和Ep-1PNA367-PT13（简称PT12和PT13）。通过提取dsRNA以及RT-PCR验证，证明菌株PT12和PT13确实只含有SsReV1（图5.9E，F）。菌落形态比较发现PT12和PT13与EP-1PNA367（简写为A367）的菌落形态没有显著的差异，都能够正常产生菌核（图5.9A）；致病力测定表明，PT12和PT13致病力很强，均能在离体的油菜叶片上产生较大的病斑（图5.9B），数据统计分析PT12和PT13的致病力与对照菌株A367均没有显著的差异（图5.9D）；同时，在生长速度上，PT12和PT13有下降的趋势，平均每天为1.9cm左右，但是与对照菌株A367（约2.3cm/d）没有达到显著性的差异（图5.9C）。因此，呼肠孤病毒SsReV1对核盘菌Ep-1PNA367的生物学特性没有显著的影响。图5.9SsReV1生物学特性分析Fig.5.9ThebiologicalattributesofSsReV1122 核盘菌新型RNA病毒研究对照菌株Ep-1PNA367和携带SsReV1的菌株Ep-1PNA367-PT12、Ep-1PNA367-PT13分别简写为A367、PT12、PT13。A，菌落形态；B，致病力检测；C，生长速度统计；D，病斑直径统计，统计分析所用的样品有3个重复，显著水平为p=0.05；E，1%琼脂糖电泳分析SsReV1相关菌株中的dsRNA，菌株Ep-1PNA367作为阴性对照，菌株SCH941（941）和SCH941R117（R117）作为阳性对照；F，RT-PCR检测SsReV1和SsBRV1预期的目标片段大小分别是604和533nts。StrainsEp-1PNA367,Ep-1PNA367-PT12,Ep-1PNA367-PT13wereshownasA367,PT12,PT12,respectively.A,Colonymorphology.AllofthestrainswereculturedonPDAfor10daysat20-22°C;B,Virulencetestonthedetachedleavesofrapeseed;C,Statisticalanalysisofthelesionsize;D,Statisticalanalysisofthegrowthgrate.TheerrorbarsindicatetheSDfromthreesamplemeans.Thesignificantlevelisp=0.05accordingtoDuncan’smultiplerangetest;E,1%agarosegel-electrophoresedanalysisofdsRNAfromSsReV1-relatedtransfectants.StrainSCH941(shownas941)andSCH941R117(shownasR117)wasusedasthepositivecontrol.StrainEp-1PNA367wasusedasthenegativecontrol;G,RT-PCRconfirmationoftheSsReV1andSsBRV1.SCH941(shownas941)wasusedasthepositivecontrol.ThepredictedsizesoftheRT-PCRproductswere604and553nts,respectively.5.4讨论呼肠孤病毒的寄主范围非常广泛，包括高等的真核生物人、哺乳动物、鱼、昆虫，以及低等的真核生物真菌等。真菌呼肠孤病毒目前已经报道了3个，寄主分别是板栗疫病菌（Cryphonectriaparasitica）和紫纹羽病菌（Rosellinianecatrix）。SsReV1是在核盘菌中首次发现的真菌呼肠孤病毒，在基因组结构及特性、病毒粒子形态及结构、进化地位以及生物学特性等方面均表现出显著的特点。5.4.1SsReV1基因组结构和特点比较通过比较与SsReV1亲缘关系较近的呼肠孤病毒属Fijivirus、Coltivirus以及Mycoreovirus发现，在基因组大小上，SsReV1（28055bp）与Fijivirus（29339bp）和Coltivirus（29174bp）比较接近，远远大于真菌呼肠孤病毒MyRV-1（23426bp）、MyRV-3（24795bp）（表5.6）。Fijivirus病毒属基因组由10条dsRNA片段，Coltivirus病毒属有12条dsRNA片段，而真菌呼肠孤病毒属有11或12条dsRNA片段，而SsReV1轮基因组包括11个dsRNA片段，且S1-S11大小均显著大于MyRV-1和MyRV-3对应的dsRNA片段大小（表5.6）。根据基因组dsRNA电泳的带型，Fijivirus为4-2-1-3，Coltivirus为4-6-1-1，MyRV-1为3-3-2-3，MyRV-3为3-3-6，而SsReV1的dsRNA电泳带型为3-2-3-1-2，因此呼肠孤病毒的基因组dsRNA电泳带型表现出丰富的多样性，即使同一个属的成员之间也存在显著的差异。通过比较与SsReV1病毒相关的一些病毒属的基因组末端保守序列发现，123 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文Fijivirus属的末端保守序列为5’-AAGUUUU---GUC-3’，Coltivirus属的末端保守序列为5’GACAUUU---UGCAGUC-3’，而真菌呼肠孤病毒的两个成员之间序列差异较大，没有发现共同的特点，而SsReV1的末端保守序列多数为5’-GAGUUUU---UGCAGUC-3’，与Coltivirus属的末端保守序列十分接近，尤其是3’末端的序列完全相同，另外，我们还发现Fijivirus属、Coltivirus属以及SsReV1的3’末端最后3个核苷酸位点均是GUC，可能在呼肠孤病毒中有比较保守的作用。整体比较发现，呼肠孤病毒的5’末端保守序列的AU含量较高，而3’末端序列的GC含量较高，基因组末端序列严格保守是呼肠孤病毒一个重要的特点（Attouietal.,2011）。呼肠孤病毒的每个dsRNA片段上多数只有一个ORF，这也是呼肠孤病毒类群的一个重要特点。我们分析与SsReV1亲缘关系较近的呼肠孤病毒属Fijivirus、Coltivirus以及Mycoreovirus的基因组发现，这些病毒的每条dsRNA片段上均只含有一个顺反子，即只含有一个ORF，而在SsReV1的S6和S11上，均发现了2个不重叠的ORF（图5.2），并且序列经过多次验证，S6和S11中间确实存在一个终止密码子，目前还不清楚这些ORF的功能。表5.6SsReV1与呼肠孤病毒属Fijivirus、Coltivirus以及Mycoreovirus基因组大小、dsRNA带型比较Table5.6ComparisonofgenomesizeanddsRNAprofileamongSsReV1andFijivirus,Coltivirus,Mycoreovirus.GenomeFijivirusCiVSsReV1CTFV-FlMyRV-1MyRV-3segmentdsRNAsize(bp)S1453240484450435041274143S2382036573966390938463773S3362332263749358632513310S4356823022888315722692259S5315022812615243220232089S6283118742223214120562030S7219418382085213315361509S8195916091954202915391299S9184316001628188410721226S101819920127918809751171S11--86312189987321003S12--585--675--943Genomesize293392480328055291742342624755(bp)dsRNAprofile4-2-1-33-6-2-13-2-3-1-24-6-1-13-3-2-33-3-6124 核盘菌新型RNA病毒研究表5.7SsReV1与呼肠孤病毒属Fijivirus、Coltivirus以及Mycoreovirus末端保守序列比较Table5.7ComparisonofconservedterminiamongSsReV1andFijivirus,Coltivirus,Mycoreovirus.VirusfamilyStrains5’end3’endFDV5’-AAGUUUUUCAGCNNNNGUC-3’FijivirusRBSDV5’-AAGUUUUUAGCUNN(C/U)GUC-3’NLRV5’-AGUGUUGUC-3’UnclassifiedCiV5’-GAUAAAUCUAUUGAUC-3’UnclassifiedSsReV15’–GAG(U/C)U(U/G)(U/G)UGCAGUC-3’CTFV-Fl5’-(G/C)ACAUUUUGUUGCAGU(G/C)-3’ColtivirusEYAV-Fr5785’-GACA(A/U)UU(A/U)UG(C/U)AGUC-3’MyRV-15’-GAUCACGCAGUCA-3’MycoreovirusMyRV-35’-ACAAUUUUGCAGAC-3’5.4.2SsReV1蛋白功能分析目前能够确定SsReV1的VP1可能是病毒的RdRp蛋白，并且证明这一蛋白在病毒粒子中确实存在（图5.7C，图表5.4）。通过相似性搜索推定SsReV1的VP2和VP8可能是病毒的甲基转移酶和螺旋酶，而VP2和VP8均在SsReV1的病毒粒子中检测到（图5.7C，表5.4），因此VP2和VP8也是SsReV1的结构蛋白，参与病毒粒子的结构形成。另外SsReV1的结构蛋白还包括VP5和VP9（表5.4），但是这几个蛋白具体的功能还未知。但是在VP1（aa925-927）、VP3（aa1119-1221）和VP8（aa581-583）中均检测到RGDmotif(arginine-glycine-asparticacid)的存在，RGDmotif在病毒的蛋白中并不常见，是细胞结合蛋白的一个显著特征。但是，在病毒terovirusesVP1、orbivirusesVP7以及phagephi29末端蛋白均发现了RGDmotif的存在（Roivainenetal.,1991;Basaketal.,1996;Illanaetal.,1998）。病毒中的RGDmotif可能有2种作用，一种是帮助病毒与细胞的整联蛋白结合（Roivainenetal.,1991;Basaketal.,1996），另一种介导病毒蛋白与蛋白之间的互作（Illanaetal.,1998）。因此我们推定，VP1、VP3和VP8在病毒SsReV1侵染，以及和核盘菌互作过程中可能发挥着比较重要的作用。SsReV1的蛋白VP5、VP8和VP9推测的分子量大小分别为91.3KDa、69.8KDa、57.3KDa，而在SsReV1的病毒粒子中p65、p63、p57、p30经过PMF-MS鉴定分别对应VP5、VP8和VP9。p65、p63、p30的分子量大小分别为65KDa、63KDa、30KDa，均小于推测的VP5、VP8和VP9的分子量，这一现象在病毒结构蛋白的鉴定过程中125 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文比较普遍（Linetal.,2012;Wuetal.,2012;Liuetal.,2015(unpublished)），可能由于蛋白的降解或翻译后加工或修饰产生的。5.4.3SsReV1的分类地位根据RdRp蛋白对SsReV1进行进化分析表明，SsReV1并不位于已经成立的真菌呼肠孤病毒属内部，而是位于真菌呼肠孤病毒属和Coltivirus属的分支基部，Coltivirus属和Fijivirus属之间（图5.8）。基因组比较也发现，SsReV1的基因组大小更接近Fijivirus属和Coltivirus属的病毒，而远大于MyRV-1和MyRV-3。Blast分析也表明SsReV1与CTFV-Fl和EYAV-Fr578的相似性更高，并且SsReV1与CTFV-Fl和EYAV-Fr578有相似的保守的末端序列。MyRV-1的病毒粒子直径约为80nm，病毒粒子表面能够观察到明显的“刺突结构”（Hillmanetal.,2004），而SsReV1的病毒粒子直径约为65nm左右，明显小于MyRV-1，并且病毒粒子表面没有观察到明显的“刺突”结构（图5.7A）。值得注意的是，MyRV-1的病毒粒子观察时用的负染试剂为1%乙酸双氧铀（uranylacetate），SsReV1所用的负染试剂为2%磷钨酸（phosphotungsticacid，pH7.0），而2%磷钨酸报道能够破坏MyRV-1的病毒粒子结构，因此SsReV1的病毒粒子也可能被2%磷钨酸破坏而观察不到表面的“刺突”结构。由此可见，已经成立的真菌呼肠孤病毒属并不能完全代表所有真菌中的呼肠孤病毒，随着病毒数量和种类的增多，真菌中的呼肠孤病毒可能有着不同的类群和分类地位。例如，能够侵染植物的呼肠孤病毒包括植物呼肠孤病毒属（Phytoreovirus）、斐济病毒属（Fijivirus）以及水稻病毒属（Oryzavirus），斐济病毒和水稻病毒病毒粒子均有“刺突”结构，属于刺突呼肠孤病毒亚科，而植物呼肠孤病毒属的成员病毒粒子没有“刺突”结构，属于无刺突呼肠孤病毒亚科，并且在亲缘关系上植物呼肠孤病毒与斐济病毒以及水稻病毒较远，因此这三类病毒虽然均能够侵染植物，但是有着不同的进化和分类地位，植物呼肠孤病毒属这一分类单元并不能够代表所有的侵染植物的呼肠孤病毒的种类和特性。即使侵染同一种植物的呼肠孤病毒也可能有着不同的分类地位，例如侵染水稻的呼肠孤病毒有水稻矮缩病毒（Ricedwarfvirus）、南方黑条矮缩病毒（Southernriceblack-streakeddwarfvirus）以及水稻草丛矮化病毒（Riceraggedstuntvirus）等，但是这三种病毒在分类上分别属于植物呼肠孤病毒属、斐济病毒属、水稻病毒属三个不同的分类单元（Attouietal.,2011）。因此，真菌中的呼肠孤病毒甚至同一种真菌中的呼肠孤病毒在进化和分类也有多样性。5.4.4菌株SCH941中dsRNA与菌株表型的关系探讨已经报道的真菌呼肠孤病毒MyRV-1和MyRV-3均能够导致寄主真菌产生严重126 核盘菌新型RNA病毒研究的衰退症状，表现为菌株生长缓慢、菌落异常、致病力下降或完全丧失致病力，但是SsReV1与发现的多数dsRNA病毒一样，表现为隐性侵染，即对寄主没有明显的影响（图5.1，图5.9）。多节段的dsRNA病毒，如Quadriviruses，Chrysoviruses均表现为隐性侵染，对寄主真菌表型没有显著的影响(Linetal.,2012;Bucketal.,1977;Covellietal.,2004;Jiangetal.,2004)。双节段dsRNA病毒SsBRV1和呼肠孤病毒SsReV1对寄主核盘菌的生物学表型均没有显著的影响，有意思的是，菌株SCH941只含有的两个dsRNA病毒即SsBRV1和SsReV1，但是表现出严重的衰退症状（图5.1）。我们发现菌株SCH941中dsRNA片段有多达17条dsRNA片段，其中S1、S2为双节段dsRNA病毒SsBRV1，S3-S7、S9-S11、S13、S16、S17为呼肠孤病毒SsReV1，S14为SsBRV1的卫星RNA。片段S12已经得到全序列，该序列有SsReV1保守的5守末端序列，但是没有3端端保守的序列，也有一个ORF，但是在数据库中没有相似的序列，在核酸水平上与SsBRV1没有任何相似性。而S8和S15一直没有得到序列的信息。不同类型之间的病毒混合侵染时，可能会发生互作，进而影响寄主的表型。弱毒病毒CHV1与呼肠孤病毒MyRV-1混合侵染时，CHV1的p29蛋白能够引起MyRV-1的S6和S10发生重组，进而能够减弱板栗疫病菌的生长速度和毒力（Sunetal.,2008）。因此SsReV1和SsBRV1混合侵染时，也可能发生互作，进而影响菌株的表型，引起弱毒症状。另外，未得到序列的S8和S15也可能是2个新的病毒，进而影响菌株SCH941的表型，导致严重的弱毒症状。图5.10dsRNA电泳带型比较Fig.5.10ComparisonofdsRNAprofile菌株SCH941和SCH941R117（941R117）菌丝体中的dsRNA比较，SCH941含有多达17条dsRNA片段均已标出（S1-S17）。DNAmarker为HindIII酶切的λDNA。ComparisonofdsRNAprofilebetweenstrainSCH941andSCH941R117(shownas941R117).17dsRNAsegmentsisolatedfromstrainSCH941werepointed(S1-S17).TheDNAmarkerisHindIII-digestedλDNA.5.4.5SsReV1的ORF6-1和ORF7可能存在水平基因转移水平基因转移（HorizontalGeneTransfer,HGT）是指亲缘关系远的物种之间的127 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文遗传信息的传递，进而能够获得新的生物功能，来适应新的环境（KeelingandPalmer,2008）。水平基因转移是原核生物进化的主要动力（KooninandWolf,2008），并且在原核生物与真核生物之间以及真核生物之间进化过程中发挥着重要的作用，尤其是真菌之间（(KeelingandPalmer,2008;Andersson,2009;Marcet-HoubenandGabaldon,2009;Gladieuxetal.,2014）。真菌之间目前已经报道66个具有潜在功能的基因发生过水平基因转移，这些基因涉及到氮、氨基酸、核酸、蛋白质、糖类以及脂类的代谢以及细胞转运等功能（Richards,2011）。病毒的进化非常快，远远快于细胞生物的基因，可能是地球生物界中遗传多样性最丰富的物种（Rohweretal.,2003;Kooninetal.,2013;Kristensenetal.,2013）。因此，病毒以及相关的的遗传元件不会有一个共同的祖先，事实上，没有一个基因在病毒的基因组中是保守的，包括病毒的标志基因复制酶和外壳蛋白（Kooninetal.,2006;Koonin，2009;Holmes,2011）。因此病毒与其寄主之间势必具有广泛的遗传信息的传递，即病毒与真核寄主之间也存在着广泛的水平基因转移，包括病毒的基因转移到寄主的基因组中，即病毒的内生化（Belyietal,2010a;Belyietal,2010b;Horieetal,2010;Kapooretal,2010;Liuetal,2010;Tayloretal,2010;Chibaetal.,2011），还包括寄主的基因转移到病毒基因组中（MoreiraandGarcía,2005;MoreiraandBrochier-Armanet,2008;Gorbalenya,1992;Meyersetal.,1989;MayoandJolly,1991;Agranovskyetal.,1991,Doljaetal.,2006;Khatchikianetal.,1989）。通过blast分析比对，SsReV1的VP6-1与多种细菌的核酸酶III（ribonucleaseIII）具有显著的相似性（表5.3），SsReV1含有的DSRM功能域与多种真核生物的DSRM功能域比较相似（图5.5）。RibonucleaseIII（RNaseIII）是一个高度保守的特异性识别dsRNA的内切核糖核酸酶（endoribonucleases），最初是在细菌中发现和鉴定的（Nicholson，2014），包括细菌的RNaseIII、真核生物的Rnt1p、Drosha酶和Dicer酶。RNaseIII包括一个内切核糖核酸酶功能域，其中含有一个二价金属离子结合位点，以及后面的dsRNA结合功能域（Lamontagneetal.,2003）。RNaseIII在细菌中能够调控多种基因的表达，从而调控金属离子运输和生长等（Limetal.,2012;Membrilloetal.,1999），酵母中Rnt1p能够直接剪切mRNA调控糖类、细胞循环以及细胞壁的胁迫反应等（Geetal.,2005;Lavoieetal.,2012;Catalaetal.,2004），在多细胞生物中，Drosha酶和Dicer酶可以加工产生小RNA进而特异性地调控基因的表达（Lundetal.,2006）。128 核盘菌新型RNA病毒研究第六章双节段dsRNA病毒SsBRV3分子特性及生物学特性研究6.1材料与方法6.1.1试验材料菌株HN138于2009年采集自湖南省常德市安乡县。6.1.2生物学特性核盘菌菌株分离、致病力测定、菌落形态观察见3.3.1。6.1.3核盘菌的原生质体再生核盘菌和灰霉的原生质体制备参见肖雪琼（2013）博士学位论文。6.1.4dsRNA提取dsRNA提取参见刘慧泉（2011）博士学位论文。6.1.5SsBRV3全长cDNA的克隆SsReV2的序列克隆，末端序列克隆、PCR产物连接转化测序参见4.2.5。6.1.6SsBRV3全长cDNA的克隆SsBRV3病毒粒子的提取、PEG介导的转染参见3.3.4。6.2结果与分析6.2.1菌株HN138生物学特性菌株HN138于2009年采集自湖南省常德市安乡县，该菌株在室内培养条件下菌落形态异常，气生菌丝发达，不产生菌核，生长缓慢，几乎完全丧失致病力，在离体的油菜叶片上接种不发病（图6.1A、B）。通过原生体再生技术，得到了表型恢复正常的菌株HN138R1，该菌株菌落形态正常，生长较快，能够产生菌核，菌核均匀分布在菌落的边缘，致病力较强，能够在离体的油菜叶片上产生较大的病斑（图6.1A、B）。提取菌丝中的dsRNA发现，菌株HN138中除基因组DNA外，还有2条核酸片段，大小分别为7Kbp和2.5Kbp左右，而再生菌株HN138R1中除基因组DNA外，只含有1条7Kbp的片段。因此，7Kbp的片段并不引起核盘菌产生弱毒症状，而2.5Kbp的片段可能引起核盘菌产生严重的弱毒症状。129 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文图6.1菌株HN138菌株生物学特性Fig.6.1ThebiologicalpropertiesofstrainHN138A，菌落形态；B，致病力测定；C，dsRNA电泳检测A,Thecolonymorphology;B,Virulencetestondetachedleavesofrapeseed;C,agarosegel-electrophoresedanalysisofdsRNAsfrommycelia.6.2.2SsBRV3基因组结构通过克隆7Kbp片段和2.5Kbp的片段，得到了两个病毒的序列信息，7Kbp的片段为一个dsRNA病毒，而2.5Kbp的片段为核盘菌DNA病毒SsHADV-1。经克隆得到了7Kbp片段的基因组全长，7Kbp的片段实际上包括2条dsRNA片段，分别命名为dsRNA-1和dsRNA-2（图6.2B），由于前面已经鉴定出双节段dsRNA病毒SsBRV1，将该病毒命名为Sclerotiniasclerotiorumbotybirnavirus3（SsBRV3）。该病毒的dsRNA-1全长为6213bp，含有一个ORF（ORF1），靠近C端含有一个RdRp功能域，而dsRNA-2全长为5878bp，含有一个ORF（ORF2），靠近C端含有一个PrgH功能域（pfam09480，Evalue=5.32e-03）（图6.2A）。PrgH为细菌Ⅲ型分泌系统的一个组分，在沙门氏菌中，该蛋白为一个四基因操纵子的构成成分，而在其它生物中为Ⅲ型分泌操纵子，是Ⅲ型分泌系统的核心元件。ORF1的1848-2840与ORF2的1607-2654在氨基酸水平具有显著的相似性（Evalue=3e-06）。Blast分析发现，SsBRV3的dsRNA-1、dsRNA-2分别与灰霉中发现的双节段dsRNA病毒BotrytisporriRNAvirus1(BpRV1)的dsRNA1和dsRNA2在核酸水平上有92%和97%的序列相似性，按照病毒分类界定的标准，核酸序列大于80%的相似性时，就定义为同一个病毒，SsBRV3与BpRV1是同一个病毒的不同株系。因此130 核盘菌新型RNA病毒研究SsBRV3与BpRV1具有相同的分子特性，例如具有非常保守的末端序列，末端序列都具有颈环结构等，还具有相同的进化地位。图6.2SsBRV3基因组结构Fig.6.2SsBRV3genomeorganizationA，SsBRV3的基因组结构，ORF1和ORF2上保守的功能域均已标出，ORF1和ORF2之间的氨基酸保守区域用灰色区域标出；B，琼脂糖凝胶电泳分析SsBRV3的dsRNA-1和dsRNA-2。A,SsBRV3genomeorganization.TheconserveddomainpresentinORF1andORF2waspointed.TheconservedproteinsequencebetweenORF1andORF2wasshadedwithgraycolor;B,Agarosegel-electrophoresedanalysisofdsRNA-1anddsRNA-2ofSsBRV3.6.2.3SsBRV3与BpRV1的生物特性比较SsBRV3对核盘菌的表型没有显著影响，携带SsBRV3的菌株HN138R1菌落形态正常，能够产生菌核，生长速度快且具有较强的致病力（图6.1）。我们从菌株HN138提取SsBRV3的病毒粒子，在PEG的作用下转染灰霉菌株Bc05.10的原生质体，得到了携带SsBRV3的灰霉菌株Bc05.10-PT1、-PT2、-PT3（简写为PT1、PT2、PT3），通过提取这些菌株的dsRNA，发现含有SsBRV3的dsRNA片段（图6.3B）。通过比较菌株PT1、PT2、PT3与Bc05.10，这些菌株在菌落形态上没有明显的差异，生长速度均较快（图6.3A）。而BpRV1能够引起严重的弱毒症状，表现为菌落扇变，生长速度显著下降，致病力下降等症状（Wuetal.,2012）。因此，SsBRV3与BpRV1尽管是同一个病毒的不同株系，但是对寄主表型有着完全不同的的影响。131 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文图6.3SsBRV3对灰霉Bc05.10生物特性的影响Fig.6.3ThebiologicaleffectsonstainBc05.10ofSsBRV3A，菌落表型；B，琼脂糖电泳分析SsBRV3的dsRNAA,Thecolonymorphology;B,Agarosegel-electrophoresedanalysisofdsRNAfromSsBRV3-relatedstrains.StrainHN138R1(138R1)wasusedasthepositivecontrol.6.2.4SsBRV3与BpRV1氨基酸比较通过比较ORF1编码的蛋白发现，SsBRV3与BpRV1之间有53个氨基酸的差异，其中23个氨基酸化学性质发生改变，并且SsBRV3的948位点上缺少了一个脯氨酸（表6.2）。SsBRV3的dsRNA1有6213个核苷酸（nt），其中nt1-2000之间与BpRV1差异的氨基酸有7个；nt2000-4000之间与BpRV1差异的氨基酸有37个，且缺少了一个脯氨酸；nt4000-6213之间有9个氨基酸的差异，因此SsBRV3与BpRV1之间ORF1的氨基酸差异主要集中在dsRNA1的中间区域。通过比较ORF2编码的蛋白发现，SsBRV3与BpRV1共有15个氨基酸的差异，其中有4个氨基酸性质发生了改变，且这些差异的氨基酸主要集中在ORF2编码蛋白的C端（表6.1）。因此SsBRV3与BpRV1的氨基酸差异主要集中在ORF上。132 核盘菌新型RNA病毒研究表6.1SsBRV3与BpRV1的ORF2所编码的蛋白之间的氨基酸比较.Table6.1ThedifferentaminoacidsbetweenORF2-encodedproteinofSsBRV3andBpRV1.氨基酸位点2182368228321006102410221062SsBRV3I(IIe)V(Val)I(IIe)Q(Gln)R(Arg)V(Val)T(Thr)V(Val)BpRV1M(Met)I(IIe)V(Val)X(?)K(Lys)I(IIe)I(IIe)I(IIe)化学性质-----+-氨基酸位点1174117911871191160616241680SsBRV3M(Met)P(Pro)S(Sre)R(Arg)V(Val)S(Ser)A(Ala)BpRV1V(Val)S(Ser)G(Gly)K(Lys)L(Leu)L(Leu)V(Val)化学性质-+---+-表6.2SsBRV3与BpRV1的ORF1所编码的蛋白之间的氨基酸比较.Table6.2ThedifferentaminoacidsbetweenORF1-encodedproteinofSsBRV3andBpRV1.氨基酸位点44158231257268339510541SsBRV3N(Asn)R(Arg)A(Ala)I(IIe)G(Gly)S(Ser)E(Glu)V(Val)BpRV1S(Ser)K(Lys)T(Thr)V(Val)E(Glu)N(Asn)D(Asp)I(IIe)化学性质--+-+---氨基酸位点646812873877933945946948SsBRV3M(Met)D(Asp)V(Val)A(Ala)I(IIe)Q(Gln)P(Pro)-BpRV1I(IIe)E(Glu)I(IIe)T(Thr)T(Thr)K(Lys)L(Leu)P(Pro)化学性质---++-+氨基酸位点950951952953954959962964SsBRV3T(Thr)Q(Gln)Q(Gln)N(Asn)R(Arg)S(Ser)S(Ser)T(Thr)BpRV1R(Arg)E(Glu)E(Glu)K(Lys)K(Lys)R(Arg)P(Pro)A(Ala)化学性质+--+-+++氨基酸位点96596798298398498510011042SsBRV3V(Val)R(Arg)N(Asn)T(Thr)L(Leu)K(Lys)A(Ala)H(His)BpRV1T(Thr)K(Lys)A(Ala)V(Val)P(Pro)S(Ser)T(Thr)Y(Tyr)化学性质+-+++++-氨基酸位点10451046106410661118115311611173SsBRV3V(Val)A(Ala)N(Asn)D(Asp)G(Gly)V(Val)S(Ser)S(Ser)BpRV1A(Ala)S(Ser)S(Ser)E(Glu)R(Arg)I(IIe)N(Asn)K(Lys)化学性质+---+--+氨基酸位点11931200122613051503150415051506SsBRV3E(Glu)K(Lys)N(Asn)D(Asp)L(Leu)L(Leu)S(Ser)L(Leu)BpRV1K(Lys)Q(Gln)D(Asp)E(Glu)Y(Tyr)H(His)H(His)I(IIe)化学性质---+++-氨基酸位点162617201751SsBRV3K(Lys)K(Lys)E(Glu)BpRV1R(Arg)R(Arg)G(Gly)化学性质--+注：-表示氨基酸的化学性质没有改变；+表示氨基酸的性质发生了改变，SsBRV3中缺失的氨基酸加粗表示。Note:-indicatesthatthechemicalpropertyoftheaminoacidwasnotchanged;+indicatesthatthechemicalpropertyoftheaminoacidwaschanged.TheaminoacidlostinSsBRV3wasbold.133 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文6.3讨论菌株HN138同时感染了dsRNA病毒SsBRV3和DNA病毒SsHADV-1，SsBRV3对核盘菌的表型没有显著的影响，而SsHADV-1能够引起核盘菌产生严重的衰退症状，表现出典型的弱毒特性（Yuetal.,2010），并且SsHADV-1的病毒粒子具有很高的侵染效率，能够直接侵染核盘菌健康的菌丝，喷洒在植物的叶片上能够有效地限制核盘菌病斑的大小，在田间也表现出有效的生防潜力（Yuetal.,2013）。不同病毒共同侵染同一个寄主在真菌中很常见，这些病毒之间可能会发生相互作用，从而可能影响菌落表型的变化（Sunetal.,2008），SsHADV-1单独侵染的核盘菌菌落发生明显的扇变，有少量菌核产生，而菌株HN138却产生大量的气生菌丝，没有菌核产生，尽管生长速度很慢，但是菌落没有发生扇变，这两者之间的表型有着比较大的差异。因此SsBRV3可能与SsHADV-1存在潜在的相互作用，从而引起菌株HN138表型与SsHADV-1单独侵染时表型的差异，作用机理还需要将来进一步的研究。Botrytisporri属于灰霉属，与核盘菌同属于一个科，即核盘菌科，具有相似的生长和发育方式（Amselemetal.,2011），SsBRV3与BpRV1为一个病毒的不同株系，在核酸水平上分别有92%和97%的相似性，而对寄主的表型影响却完全不同。这种差异的原因现是由于不同寄主的背景差异引起的，还是由于SsBRV3发生了基因突变引起的，目前还不是很清楚。因此，需要将SsBRV3转染到Botrytisporri中，在同一个遗传背景下进行比较。另外，SsBRV3与BpRV1的dsRNA1和dsRNA2大小均在6Kbp左右，8%和3%的核苷酸差异，即分别有480个核苷酸和180个核苷酸的差异，同时还有53个和15个氨基酸的差异，这些核苷酸或氨基酸的差异很可能直接影响着SsBRV3和BpRV1毒力的差异，从而造成寄主表型的显著差异，这同样有待进一步地研究和探讨。SsBRV3和BpRV1分别来自不同的菌株，采自不同的地点，在核酸水平却有着很高的相似性，这就不得不让人思考一个问题：真菌病毒是怎样传播的。目前普遍认为真菌病毒没有体外传播途径，只能靠菌丝融合进行水平传播（Nussetal.,2005;Ghabrialetal.,2009），但是随着越来越多真菌病毒的报道，这一理论显然不能解释真菌病毒丰富的多样性。Yu等2013年报道，SsHADV-1可以打破菌丝不亲和的障碍，能够成功侵染小核盘菌（S.minor）和三叶草核盘菌（S.trifoliorum）；而且Xiao等2015年报道双分病毒SsPV1也可以通过对峙培养侵染小核盘菌（S.minor）、三叶草核盘菌（S.trifoliorum）和灰霉（Botrytiscinerea）；Yu等2013年报道SsHADV-1的病毒粒子可以直接侵染健康的核盘菌菌丝。因此，真菌病毒可能有着特殊的并且有效的体外传播途径或者传播介体。134 核盘菌新型RNA病毒研究第七章核盘菌真菌病毒多样性与宏病毒组学7.1引言病毒的发掘主要有两种方法，依赖于序列和不依赖于序列的方法。前者包括用一段已知的序列进行PCR扩增、杂交分析以及芯片分析，但是这种方法有很多缺点难以克服。一是建立在已知序列的基础上，而在发掘新的病毒资源时无能为力；二是效率很低；三是不能从整体上把握整个病毒资源的分类及动态；四是得到的信息容易产生偏差。相对于这种依赖于序列的方法，不依赖于序列的宏病毒组学（Metavirome）不受这种限制，样品中的任何病毒，无论是否能够培养、病毒已知还是未知，均能通过病毒宏基因组的方法检测到。狭义的宏病毒组学是指纯化病毒粒子，然后进行高通量测序，分析和鉴定样品中的病毒。广义的宏病毒组学还包括在转录组、小RNA水平上发掘新的病毒信息和资源。宏病毒组学主要包括三个过程，收集样品、高通量测序、生物信息分析（Breitbartetal.,2002;Breitbartetal.,2004a;Breitbartetal.,2004b）。宏病毒组学一诞生，就在发掘新的病毒资源方面展现出巨大的潜力和优势。例如通过病毒宏基因组学在哺乳动物、昆虫、植物、鸟类等多种生物中发现了并成立了众多新的DNA病毒和RNA病毒科（Lopezetal.,2009;Vegaetal.,2008;Ngetal.,2011;Rosarioetal.,2009;Djikengetal.,2009；Zhangetal.,2006;Kapooretal.,2008）。本章我们就采用宏病毒学从核盘菌中鉴定和发掘真菌病毒资源。7.2试验材料与方法7.2.1试验材料收集来自湖南省、湖北省、安徽省、四川省、江西省、陕西省等6个省份50个核盘菌菌株。7.2.2总RNA提取总RNA的提取参见肖雪琼（2013）博士学位论文。分别提取这50个菌株的总RNA，等量混合。7.2.3转录组测序、分析转录组的测序、分析由华大科技股份有限公司完成，转录组测序时对核糖体RNA没有处理，数据量2G。135 华中农业大学2015届博士研究生学位（毕业）论文7.2.4所需要的数据库病毒数据库下载地址ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/viral/7.3试验结果7.3.1比对统计样品样品经过转录组测序，共得到10670852个reads，其中匹配到核盘菌1980基因组上的reads共计9434843个reads（包括完全匹配和部分匹配），占所有reads的88.42%，而不能匹配（TotalUnmappedReads）到基因组上的有1236009个reads，占所有reads数的11.58%（表7.1）。将这些UnmappedReads进行序列组装，与全病毒的核酸数据库和蛋白数据库进行比对。表7.1得到的reads数与核盘菌基因组1980进行比对Table7.1SummaryofreadsmatchedwithstrainS.sclerotiorumgenomeMaptoGenomereadsnumberpercentageTotalReads10670852100.00%TotalBasePairs960376680100.00%TotalMappedReads943484388.42%perfectmatch419591539.32%<=5bpmismatch523892849.10%uniquematch928657187.03%multi-positionmatch1482721.39%TotalUnmappedReads123600911.58%7.3.2样品分析的过程Unmappedreads（Reads1）首先与全病毒基因组进行序列比对，得到了ReadsB，共计468294条reads，对这些reads进行组装得到了Contigs2，但是组装效果不好，没有组装出Scaff，contig组装的N50为60bp，最大长度为233bp，且长度多在80bp及以下，因此没有太大的价值。未能匹配到全病毒基因组的reads有17088980条（Reads2），对这些序列进行组装得到Contigs1，共得到25780条contigs（>200bp），Contigs1与核盘菌基因组进行比对，共计有23448条contigs能够比对到核盘菌基因组上，最后得到未知的序列共2332条contigs。这2332条contigs再与核盘菌的基因136 核盘菌新型RNA病毒研究组进行比对，设置较为宽松的条件（Evalue