用豆状囊尾蚴囊液免疫动物的形态观察及快速诊断方法的研究

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1、ObservationofMorphologyonImmuneAnimalsbyCysticFluidofCysticercusPisiformisandResearchofRappidDiagnosisMethodADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgronomyMajor:BasicVeterinaryMedicineResearchField:PathologyandMolecularImmunol

2、ogyCandidate:SunYuqianSupervisor:Prof.PanYaoqianHenanInstituteofScienceandTechnologyJune,2015摘要兔豆状囊尾蚴病是由豆状带绦虫的中绦期豆状囊尾蚴寄生于兔的肝脏、大网膜、肠系膜和腹腔内引起的一种多发常见的绦虫病，但是目前还没有活体诊断方法。为了建立一种快速诊断该病的血清学方法，本研究通过对试验动物的免疫形态的研究和PVC-Dot-ELISA方法分别验证豆状囊尾蚴囊液蛋白的免疫原性和反应原性，即验证豆状囊尾蚴囊液蛋白可以作为免疫原的可行性。然后

3、纯化筛选囊液蛋白并进行鉴定。再通过免疫方法获得小鼠阳性血清，建立阻断ELISA诊断方法。分别用兔脑炎原虫病、兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病、兔弓形虫病和球虫病阳性血清，检测其特异性。应用该检测方法检测兔血清临床样品，测定检测率。免疫形态研究结果表明，脾脏的脾小结明显增多，生发中心发育明显，动脉周围淋巴鞘密集；回肠和肠系膜淋巴结的固有层内的T淋巴细胞和浆细胞明显增多；鼠脾脏和回肠内有大量的阳性T淋巴细胞和浆细胞，表明动物机体发生了不同程度的免疫反应。PVC-Dot-ELISA检测结果表明六只小鼠均产生了有效效价。筛选纯化蛋白的结果表明

4、用超滤离心管分离的大于50kDa的囊液蛋白为最终纯化蛋白，且该纯化蛋白浓度很高，SDS-PAGE分析显示，该目的蛋白分子量在63kDa附近，与预期一致。建立的阻断ELISA检测方法结果显示，纯化囊液蛋白的最佳包被浓度为5μg/mL，一抗最佳稀释度为1:800，最佳包被条件是4℃/过夜，最佳封闭条件为37℃/3h，二抗最佳稀释比例和反应条件为1:5000，37℃，反应30min。特异性分析显示建立的阻断ELISA检测方法与兔脑炎原虫病、兔瘟、兔巴氏杆菌病、兔弓形虫病和球虫病均无交叉反应性。用该阻断ELISA检测方法检测100份临床样

5、品，结果显示检测率为82.35%。本研究证明豆状囊尾蚴囊液蛋白具有很好的免疫原性和反应原性，机体不仅发生了细胞免疫和体液免疫，还产生了阳性血清。建立的阻断ELISA诊断方法具有很好的特异性和敏感性。关键词：兔豆状囊尾蚴病，免疫形态，囊液蛋白，PVC-Dot-ELISA，阻断ELISAIABSTRACTCysticercosisPisiformisinRabbitisamultipleandcommoncestodiasisthatiscausedbyCysticercuspisiformisparasitizingrabbits’

6、liver、omentummajus、mesenteriumandabdominalcavity.Buttherehasbeennoadiagnosismethodaboutlivingrabbitsofar.InordertoestablisharapidandsensitiveELISAmethod,theresearchwastoverifytheimmunogenicityandreactogenicityofC.pisiformiscysticfluidbytheimmunemorphologychangesofexpe

7、rimentalanimalsandPVC-Dot-ELISAmethodseverally.ItwastovalidatethefeasibilityofC.pisiformis’cysticfluidthatcanbeusedasimmunogen.ThecysticfluidofC.pisiformiswaspurified、screenedandappraised.ItistoestablishtheblockingELISAmethodwithmice’spositiveserumsbyimmunizationmetho

8、d.TheestablishedblockingELISAwasusedtodetecttheantibodyofEncephalitozoonosisinRabbit、ViralHaemorrhagicDiseaseinRabbit、Pasteu