生物被膜状态结核分枝杆菌的转录组学分析及荧光定量pcr检测方法的建立

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1、生物被膜状态结核分枝杆菌的转录组学分析及荧光定量PCR检测方法的建立TranscriptomeanalysisofbiofilmformationinMycobacteriumtubercolusisanddevelopmentofquantitativerealtimePCRdetectionmethod作者姓名：杨志强领域（方向）：兽医指导教师：于录教授类别：兽医硕士答辩日期：2015年6月2日基金资助：1.国家“十二五”传染病防治科技重大专项（NO.2012ZX10003002）；2.国家自然科学基金(NO.31172364)中文摘要生

2、物被膜状态结核分枝杆菌的转录组学分析及荧光定量PCR检测方法的建立结核病是世界上最严重的致死性传染性疾病之一。结核分枝杆菌作为引起人类结核病的病原微生物，从新石器时代伴随人类至今，直到目前仍然导致每年约900万人发病以及接近150万患者死亡。由于结核分枝杆菌有很强的抗药性和逃避机体免疫的能力，结核病的感染需要6-9月的多种药物治疗。然而，在全世界范围内出现耐多药菌株和广泛耐药菌株使得混合药物治疗变得效果低下并花费更长时间。已有研究证实，结核分枝杆菌同绿脓杆菌等其他细菌一样，可以在体外形成生物被膜，而且在不同结核分枝杆菌菌株间存在生物被膜产量的

3、差异；研究同样表明，结核分枝杆菌生物被膜的产量与其耐药性和致病性密切相关。生物被膜的形成使细菌的耐药性提高10-1000倍，约有65-80%的感染被认为与生物被膜有关，结核分枝杆菌生物被膜的形成为结核病治疗带来了巨大的挑战。在本研究中，我们首先利用RNA高通量测序技术，进行了生物被膜状态和浮游状态结核分枝杆菌菌株H37Rv的转录组对比，找到一批生物被膜状态结核分枝杆菌的差异表达基因，然后通过比较、筛选和验证，建立了基于基因Rv3519的荧光定量PCR分析结核分枝杆菌菌株生物被膜产量高低的方法，实现了通过分析标识基因表达就可以判断菌株的生物被膜

4、产量。本研究具体开展的工作：1.改进了Ojha教授建立的结核分枝杆菌生物被膜体外培养方法，解决了结核分枝杆菌生物被膜体外培养时间长、重复性差问题；为了寻找结核分枝杆菌生物被膜相关的标识基因，在国际上首次运用了Illumina测序平台对生物被膜状态与浮游状态的结核分枝杆菌进行了高通量全转录组测序。结果表明：运用改I良苏通培养基在血清瓶中进行生物被膜培养，结核分枝杆菌生物被膜的生长状态良好，培养时间缩短一周。测序获得的纯净序列读取片段组装成4550个unigene，其中4007个与已知基因匹配，543个为新发现的转录本。被膜菌与浮游菌相比，437

5、个基因差异表达，其中153个基因显著下调(≤2倍)，284个基因显著上调(≥2倍)。343个显著差异基因注释到377条GO条目，114个显著差异基因注释到86个KEGG通路中。差异表达基因主要集中于硫代谢、类固醇降解、Atrazine降解、ABC转运蛋白等相关通路中，提示生物被膜态中的细菌处于饥饿与缺氧状态并伴随着硫同化作用与类固醇降解作用的增强，硫代谢通路中的基因除可以作为标识基因外，还可作为抗结核生物被膜研究的潜在药物靶标。2.以为测序结果为基础，并结合前期研究结果，从中选取代表基因Rv3519，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检

6、测生物被膜态的不同结核分枝杆菌Rv3519表达水平，结晶紫染色检测结核分枝杆菌生物被膜的形成能力，比较分析Rv3519基因表达与结核分枝杆菌生物被膜形成能力的关系。结果表明：生物被膜形成能力强的结核分枝杆菌菌株Rv3519基因表达量高，生物被膜形成能力弱的菌株，Rv3519基因表达量低。说明结核分枝杆菌生物被膜形成能力与Rv3519基因表达水平相关，Rv3519基因可以作为结核分枝杆菌生物被膜形成能力的潜在分子诊断标识。总之，本研究通过RNA高通量测序技术对生物被膜状态和浮游状态结核分枝杆菌的转录组进行分析，筛选出与结核生物被膜形成能力相关的

7、标识基因Rv3519，并建立了荧光定量PCR检测生物被膜形成能力的方法，为针对结核分枝杆菌生物被膜介导耐药性的临床用药提供参考。关键词：结核分枝杆菌，生物被膜，RNA转录组测序，硫代谢，荧光定量PCR,Rv3519IIAbstractTranscriptomeanalysisofbiofilmformationinMycobacteriumtubercolusisanddevelopmentofquantitativerealtimePCRdetectionmethodTuberculosis(TB)remainsoneoftheworld’

8、sdeadliestcommunicablediseases(WHO).Mycobacteriumtuberculosis(M.tuberculosis),thec