日本海马白斑状皮肤溃烂病病原学及组织病理学研究

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1、鲁东大学硕士学位论文日本海马白斑状皮肤溃烂病病原学及组织病理学研究作者姓名：李海东指导教师：孙虎山教授学科专业：动物学研究方向：海洋动物免疫与病害防治鲁东大学生命科学学院二○一五年六月AThesisSubmittedtoLudongUniversityfortheDegreeofMasterEtiologyandhistopathologystudyforwhiteporphyriticulcerdiseaseofHippocampusjaponicusM．D．Candidate：HaidongLiSupervisor：HushanSunMajor：ZoologyResearchInte

2、rests：ImmunizationanddiseasecontrolofmarineanimalSchoolofLifeScience,LudongUniversityJune，2015摘要日本海马（Hippocampusjaponicus）在试验室养殖过程得了溃疡症，其主要症状表现为皮肤溃烂、肝脏糜烂、肠道发白或透明等，不及时隔离治疗会导致全部死亡。本研究的目的是分离和鉴定日本海马溃疡症的病原。从患有溃疡症的濒死日本海马的皮肤溃烂部位、肝脏等分离病原菌；通过形态特征、生理生化特征及16SrDNA基因系统发育分析对病原菌进行分类鉴定；通过药敏试验来确定该病原菌对抗生素的敏感性；通过人工

3、感染试验来确定该菌对日本海马的致病性；从病变日本海马分离得到两株优势菌分别为HM16和HC2；综合菌株HM16和HC2的形态、生理生化特征及16SrDNA系统发育分析等方面的试验结果，分别确定HM16为弧菌属(Vibriosp.)细菌和HC2为假单胞杆菌属（Pseudomonassp.）细菌。人工感染试验证实HM16和HC2均为日本海马的病原菌，HM16和HC2对日本海马的半23数致死剂量（LD50）分别为7.9×10cfu/g（鱼）和1.6×10cfu/ind（鱼）。HM16对头孢他啶、菌必治、链霉素、氯霉素和红霉素等表现出强敏感性；HC2对氨苄青霉素、羧苄青霉素、氧哌嗪青霉素、复达欣

4、、菌必治、新霉素和氧氟沙星等表现出强敏感性。从健康日本海马（H.japonicus）肠道内分离获得对其肠炎病病原菌HC2具有显著拮抗作用的菌株，优化其产生抑菌活性物质的发酵条件，为海马生物防治奠定基础。采用点种法并以日本海马肠炎病病原菌HC2为指示菌，对从健康日本海马肠道内分离的56株细菌进行体外拮抗试验。根据菌株的形态特征、生理生化特征和16SrDNA系统发育树分析对其进行鉴定。通过最优培养基成分的选择、培养基组分的正交试验优化和单因素试验来确定优化发酵条件。从日本海马肠道内筛选出一株拮抗菌，编号为HS17。综合该菌的形态、生理生化以及16SrDNA系统发育树分析等方面的试验结果，确定

5、菌株HS17属于芽孢杆菌属(Bacilussp.)。该菌生长的最佳碳源、氮源和磷酸盐分别为蛋白胨、麦芽糖和KH2PO4；其最佳发酵配方和发酵条件为蛋白胨(20.0g/L)、麦芽糖(10.0g/L)、KH2PO4(1.5g/L)、NaCl(10.0g/L)和MgSO4·7H2O(0.2g/L)，初始pH为7.0，接种量为3%，装瓶量为30mL/100mL，转速为180r/min，培养时间为48h。通过发酵条件优化后菌株HS17对病原菌HC2的抑制效果更加明显。组织病理学研究表明：病变日本海马的表皮完全脱落，结缔组织结构严重变形，并产生大量酸性物质；尾部溃烂部位，软骨严重损伤，肌肉浓缩，细胞

6、核出现凝聚，且产生大量酸性物质；皮肤的色素层脱落，且分散在真皮层的黄色色素i细胞和红色色素细胞消失；肝脏内血管破裂，出现红细胞浸润现象，并出现大量空泡，肝细胞之间出现断裂，肝细胞破坏，细胞核游离，且肝细胞产生大量酸性物质。关键词：日本海马，皮肤溃烂，肠炎病，拮抗菌，组织病理学iiAbstractUlcerdiseasewillalwaysoccurstotheculturedHippocampusjaponicus,whichcouldtriggerskinulcers,erosionoftheliverandintestinalwhitish.MeanwhileH.japonicusc

7、ouldalldiewithouttimelytreatment.Thepapermailyresearchthepathogenicbacteria.WeisolatedthepathogenicbacteriafromdyingH.japonicus'slesionsitesandclassifiedpathogenbacteriabyit’smorphological,physiologicalandbiochemicalch