髓细胞瘤相关A和K亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性

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1、学号：201473027密级：博士研究生学位论文髓细胞瘤相关A和K亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性专业：作物保护学研究方向：分子病毒学研究生：梁雄燕指导教师：方守国教授杨玉莹教授论文起止日期：2014年9月至2018年4月学号：201473027密级：博士研究生学位论文髓细胞瘤相关A和K亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性专业：作物保护学研究生：梁雄燕指导教师：方守国教授杨玉莹教授论文起止日期：2014年9月至2018年4月BiologicalCharacteristicsoftheIsolatesofAvianLeukosisVirusSubgroup

2、AandKAssociatedwithMyeloidAvianLeukosisMajor：CropProtectionGraduateStudent：XiongyanLiangSupervisor：Prof.ShouguoFangProf.YuyingYangSchoolofAgriculture,YangtzeUniversitySeptember,2014toApril,2018摘要禽白血病病毒(Avianleukosisvirus，ALV)是一种重要的致瘤性反转录病毒，可以引起鸡的多种肿瘤，严重威胁养殖业健康发展。鸡源禽白血病病毒包括A~E，J和K

3、7个亚群。不同亚群的禽白血病病毒常常具有不同的致病性和致瘤谱，A、B亚群病毒主要诱发经典的鸡淋巴细胞瘤，J亚群病毒主要诱发鸡髓细胞瘤，尽管有时它们也诱发其他类型的肿瘤。近20年来，我国报道和研究了大量的ALV-J引起的髓细胞瘤和血管瘤型禽白血病。然而，对其他亚群的禽白血病的相关报道则相对较少，目前尚未见关于ALV-K诱发的肿瘤病变报道和ALV-A诱发髓细胞瘤的自然病例报道。本研究对湖北某蛋鸡群和某地方品种鸡群的肿瘤病鸡进行了病理学观察、病原分离鉴定和病毒全基因特征分析。在此基础上，通过反向遗传操作技术，拯救出基因背景清楚的病毒并研究病毒的致病性和致瘤特征

4、，通过转录组测序分析，了解ALV-A诱发鸡髓细胞瘤的机制，结果如下：1.自然病例病理学观察及病原检测对病鸡进行了组织学观察和病原学检测。ELISA结果显示，商品蛋鸡场和地方品种鸡自然病例的泄殖腔拭子均呈ALVP27阳性；病理组织学观察显示，来自商品蛋鸡场和来自地方品种鸡养殖场的病鸡均为髓细胞瘤混发淋巴细胞瘤。用ALV-A/B/J的特异性引物进行Multi-PCR检测，蛋鸡病料中扩增出与ALV-A对应的核酸片段，但地方品种鸡病料未扩增出片段。以ALV-env的通用引物进行PCR，从地方品种鸡病料扩增出了相应的片段，测序显示扩增出的env与ALV-K原型株J

5、S11C1高度同源。2.病毒分离鉴定与分离株培养特性取两个鸡群中病变典型的病鸡肝脏组织，制备组织悬液接种DF-1细胞进行病毒分离培养，分别以抗ALV-A的单抗AF3、抗ALV-J的单抗JE9和抗ALV-KSU的单因子血清为一抗进行间接免疫荧光试验。结果，以AF3为一抗，用蛋鸡肝脏组织悬液处理的DF-1细胞和以抗ALV-KSU单因子血清为一抗，用地方品种鸡肝组织悬液处理的DF-1细胞呈亮绿荧光，表明从蛋鸡中分离的病毒为ALV-A，命名为HB2015012；从地方品种鸡中分离的病毒为ALV-K，命名为HB2015032。体外培养试验表明，HB2015012和

6、HB2015032与ALV-J参考毒株HB2010001和HB2015029复制特性相似，且HB2015032可以感染荆江麻鸭鸭胚原代成纤维细胞（DEF）。3.病毒分离株基因组特征测序结果显示，HB2015012和HB2015032的前病毒基因组全长分别为7735bp和7703bp，二者均具有典型的C型反转录病毒结构。序列分析显示，HB2015012和HB2015032的gag和pol基因核苷酸序列均相I对保守，但HB2015032的pol基因区域（前病毒基因组第5345位碱基）发生了一个C-T突变，提前形成了一个TAA终止密码子，使得其pol基因编码的

7、蛋白与J亚群禽白血病病毒一样，相对于其他亚群的毒株短22aa；HB2015012和HB2015032的UTR+LTR区核苷酸序列与ALV-J相应区域高度相似，二者的3’UTR+LTR区均包含有完整的DR1，E原件，U3，R和U5区，且U3区均具有2个CAATboxes、2个Yboxes、2个CArGboxes和2个PREboxes及1个NFAP-1和TATAbox，几乎含有ALV-J原型株HPRS-103U3区所有的调控序列，另外HB2015032的E原件中（前病毒基因组7250位与7251位碱基间）相对与HPRS-103基因组的7388位碱基处具有1个

8、碱基缺失，形成了一个仅在蛋鸡血管瘤型ALV-J毒株中存在的与血管内皮细胞分化相关