微生态制剂断奶安的稳定性及放大工艺初步研究

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1、分类号密级UDC单位编号10733甘肃农业大学硕士学位论文微生态制剂断奶安的稳定性及放大工艺初步研究AnInitialStudyofDUANNAIANProbioticsforitsStabilityandScaling-upProcess梁红雁指导教师姓名蒲万霞研究员（兰州畜牧与兽药研究所兰州730050）吴润教授（甘肃农业大学动物医学院兰州730070）学科专业名称预防兽医学研究方向微生物制药论文答辩日期2015年6月2日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席刘永生研究员评阅人郑继方研究员

2、马小军副教授2015年6月ClassificationNo.:Secrecylevel:UDC:Schoolcode:10733GansuAgriculturalUniversityADissertationfortheMaster’sDegreeAnInitialStudyofDUANNAIANProbioticsforitsStabilityandScaling-upProcessPostgraduate:LIANGHong-yanAdvisor:Prof.PUWan-xiaSpeciali

3、ty:PreventiveVeterinaryScienceResearchField:MicrobialPharmaceuticsSubmittedTime:June,2015Address:Lanzhou,China,730070甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要摘要本研究进行了用于防治断奶仔猪腹泻的微生态制剂断奶安的稳定性及扩大工艺试验研究，为该制剂的质量控制标准制定及规模化生产奠定了基础。1.进行了发酵菌种的稳定性试验。采用传统生化方法及26SrDNA分子生物学方法对诱导前后的菌种进

4、行鉴定，并运用直接计数法对诱导后的菌株在一定时间内的生长曲线、pH变化以及凝聚性进行测定。结果表明该菌株驯化前后形态、生理生化特性及分子生物学特性表现一致，没有发生变异；诱导后菌株在72h内呈稳定增长趋势，pH值逐渐降低，凝聚值F1=0.243,表明该制剂发酵结束时悬浮细胞数较多，不易沉淀，进入胃肠道后不会因凝聚成团而影响其益生功能。2.完成了断奶安的耐受性试验。将断奶安置于pH2-4的模拟人工胃液中3h，其活菌数量在不同pH环境中均大于100%；断奶安在浓度为0.1-1%的模拟人工肠液中生长良

5、好，在浓度为0.3%、0.6%、1%的胆盐环境中存活率分别达到100%、90%、77%以上；将断奶安培养在NaCl浓度为10-24%的培养基中48小时，其在NaCl浓度为10-16%的培养基中生长良好，在NaCl浓度为22%的高渗透压环境仍能存活，断奶安可以耐受58℃10min，64℃5min。试验结果表明，微生态制剂断奶安在规定的耐受范围内有较高存活率且符合益生菌制剂在肠道发挥益生功能所需的菌含量，表明该制剂具有用于预防动物疾病的基本条件,同时也为其以后的临床应用及规模化生产提供了理论依据。3

6、.采用7cmSDS-PAGE与毛细管高效液相色谱、Q-exactive质谱相结合的方法进行了断奶安发酵液分泌蛋白定性检测。用Mascot软件在数据库UniProtknowledgebase(Swiss-Prot/TrEMBL,www.expasy.org)和GeneOntology(GO)Database(http://www.geneontology.org/)进行检索，Blast2GO软件进行蛋白的生物信息学分析。结果发现，对照组组中共鉴定到肽段68个，蛋白组47个，断奶安组共鉴定到肽段24

7、1个，蛋白组121个。原始数据中鉴定到有注释的蛋白共计109个，其中对照组特有蛋白11个，断奶安组特有蛋白63个，两组共有蛋白35个。生物信息学GO注释及KEGGpathway表明，断奶安发酵液较对照组中不仅蛋白含量较丰富，且参加的代谢通路也较多。同时，生物信息学分析发现，发酵液中普遍存在较高的碳水化合物代谢和能量代谢，还参与影响了少量生物学通路等，且断奶安组有唯一具有电子载体活性和转运子活性的蛋白质，可能行使着生物调控、刺激反应和定位进程等功能。44.微生态制剂的扩大培养条件优化。利用正交试验

8、设计L9(3)的方法，分别对菌株的摇瓶i甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要培养条件及发酵罐培养条件进行优化。经过摇瓶的培养，确定其基本培养条件为：接种量1%，温度为25℃，pH为6，摇床转速110r/min；在10L发酵罐中研究装液量，接种量及转速对菌株发酵过程的影响，综合考虑发酵效率以及成本等问题，控制恒定发酵条件为pH为6，25℃,DO值小于5%等条件相同的情况下，优化出发酵罐菌株生长量最大的生产工艺：8转速200r/min，接种量5%，及装液量4.5L，发酵液中活菌数可达到2.80×1