应用mdck细胞表达流感减毒活疫苗（laiv）和应用鸡胚检测病毒滴度方法学验证的研究

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1、分类号：单位代码：研究生学号：密级：公开含林大学硕士学位论文应用细胞表达流感减毒活疫苗和应用鸡胚检测病毒滴度方法学验证的研究作者姓名：孙文专业：制药工程研究方向：生物制药指导教师：滕利荣教授培养单位：吉林大学生命科学学院年月应用细胞表达流感减毒活疫苗和应用鸡胚检测病毒滴度方法学验证的研究作者姓名：孙文专业名称：制药工程指导教师：滕利荣教授学位类别：理学硕士答辩日期：年月日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发

2、行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的硕士学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期年月日摘要本研究采用微载体，以细胞作为流感病毒生产基质，探索了型流感病毒以及型流感

3、病毒最适增殖条件。采用正交设计的方法，考察胰酶浓度、病毒培养液以及病毒感染复数对微载体上细胞生长的流感病毒滴度的影响。通过以上研究，确定了胰酶终浓度为病毒培养液病毒感染复数为作为流感病毒最佳培养参数。为了考察生物反应器表达流感病毒的重复性，釆用上述培养参数行了两次实验，及型流感减毒株均在接种后小时达到病毒滴度峰值，到达峰值时，及型流感病毒滴度均值可分别达到±及±，并且此浓度胰酶对细胞无明显损伤。市售流感疫苗主要以鸡胚为基质生产，但是鸡胚中存在的卵清蛋白可能引起过敏反应，病毒在鸡胚连续传代后，病毒容易发生变异，

4、使其不能与人群中的流行毒株完全匹配。为此世界卫生组织鼓励生产厂家开发以哺乳动物细胞为基质生产的流感疫苗。本实验以细胞为生产基质，选择微载体培养方式，通过正交实验设计，以期实现缩短培养时间、提高生产效率、提高病毒产量的目的，为大规模流感疫苗生产提供了依据。流感减毒活疫苗（系在鸡胚中生产，并按照比例将型型（和型流感减毒活疫苗株配制成三价疫苗。本研究初步建立了采用细胞培养流感减毒活疫苗的工艺参数。当采用哺乳动物细胞生产流感疫苗时，由于病毒株已经适应了哺乳动物的生长条件，细胞法检测结果可能与鸡胚法存在差异。因此，本研

5、究验证了鸡胚法（检测以细胞为基质生产的流感减毒活疫苗滴度的适用性。对其专属性、线性、准确度、精密度、重复性、耐用性等方面进行了方法学验证。结果表明，方法具有高度特异性，同种型别中和抗体均可以有效地中和同种流感病毒，并且异种中和抗体不干扰病毒滴度的测定，制剂辅料对流感病毒滴度检测结果无影响；方法线性良好，在线性范围内，三种型别病毒的线性回归系数（在之间；日间精密度的值在之间，平均回收率在之间。采用方法检测以细胞为基质生产的三价流感减毒活疫苗病毒滴度，具有较高的可信性，能够满足流感疫苗生产厂家评价疫苗效力的需求。

6、对于了解每种型别病毒稳定性、免疫原性具有重要的意义。为了考察鸡胚法（及细胞法（检测以细胞为基质生产的流感病毒滴度的相关性，本研究分别釆用及两种方法检测、以及三种型别流感病毒滴度。结果表明：法测定、以及型流感病毒滴度平均值±口分别为±、±及±法测定结果分别为±、±及±两种方法检测结果间未见无显著性差异表明可以作为流感病毒滴度测定的替代方法。关键词：流感减毒活疫苗，微载体，分析方法验证AbstractMadin-Darbycaninekidney(MDCK)cellsusingCytodex?3microcarr

7、ierbeadsculturesystemswereestablishedtoproduceA/17/California/2009/38andB/56/Brisbane/60/08influenzavirusinthisstudy.ThecultureconditionssuchasconcentrationofTPCK-Trypsin,pHandmultiplicityofinfection(MOI)wereinvestigatedusinganorthogonalarraydesign.Bythisme

8、ans,weestablishedoptimalparametersforcultureconditions:pH7.2and0.1MOI.Weperformedthetestforthreetimestoconfirmtherepeatabilityoftheparameters.Bothvirusesreachthetoptiterafter72hoursofculture,andwiththe