人参有效成分合成关键酶基因克隆及表达量与生态因子和总皂苷关系研究

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1、分类号：Q938.1单位代码：10193密级：公开学号：2012104硕士学位论文人参有效成分合成关键酶基因克隆及表达量与生态因子和总皂苷关系研究Cloningofkeyenzymegenesforactiveingredientsofginsengsynthesisandtherelationshipstudyofexpressionlevelswithecologicalfactorsandtotalsaponins作者姓名：侯双利学位类别：理学硕士专业名称：生态学研究方向：植物生态学指导教师：韩梅教授所在学院：中药材学院二零一五年五月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在

2、导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校

3、有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日国家自然科学基金项目（31270371）人参药效成分形成与积累的生理生态机制研究NationalNaturalScienceFoundationPro

4、ject(31270371)ResearchonPhysiologicalandEcologicalMechanismforFormationandAccumulationofGinsengEffectiveComponents摘要人参是我国非常名贵的中药材之一，其有效成分人参皂苷的含量随栽培地域环境的变化差异较大。研究人参皂苷合成关键酶基因表达与皂苷含量和主要生态因子的关系，可为阐明人参皂苷合成的的生理生态机制提供理论依据。本文对人参HMGR、SS和SE基因进行了克隆及表达分析，测定了人参总皂苷含量，并分析了关键酶基因表达量与总皂苷和生态因子的关系。主要研究结果如下：1.以五年生人参根

5、组织为试验材料，采用RT-PCR方法对人参HMGR、SS及SE基因进行克隆；利用生物信息学技术对各基因核苷酸序列及氨基酸序列进行分析。结果表明，HMGR基因全长片段大小为1750bp，开放阅读框长1722bp，编码573个氨基酸；HMGR编码的蛋白包含2个跨膜区域及5个保守结构位点。SS基因全长片段大小为1256bp，开放阅读框长1248bp，编码415个氨基酸；SS编码的蛋白包含2个跨膜区域和2个保守结构位点。SE基因全长片段大小为1636bp，开放阅读框长1611bp，编码536个氨基酸；SE编码的蛋白含有4个跨膜区域及5个保守结构位点。2.以五年生人参根组织为试验材料，建立人参GA

6、PDH基因实时荧光定量RT-PCR方法。将PCR扩增获得的人参GAPDH基因片段连接到pMD20-T载体上构建重组质粒，经1/10梯度稀释后，以SYBRGreenⅠ为荧光染料制作标准曲线，同时进行熔解曲线分析，并对反应的特异性、灵敏性和重复性进行检测。结果表明，该方法检测GAPDH基因的最72低拷贝数为36拷贝/μL，在较广的范围内（36～3.6×10拷贝/μL）有良好的线性关系（R＝0.9964）；熔解曲线结果表明扩增产物为特异性单峰，其Tm值为（84.57±0.01）℃；5个不同浓度对照品组内试验变异系数为0.54%～2.77%，组间试验变异系数为2.60%～4.39%。该方法具有灵

7、敏、特异、快速及重复性强等优点，为进行人参功能基因表达的定量分析奠定了方法学基础。3.以五年生人参根组织为试验材料，对人参HMGR、SS及SE基因表达量与总皂苷含量进行测定，并对各基因表达量与生态因子和总皂苷的关系进行分析。结果表明，HMGR、SS和SE基因表达量从盛花期至红果期逐渐升高，在果熟期表达量有所下降，但仍具有较高的表达量；总皂苷含量从盛花期至果熟期逐渐升高，说明人参生长后期是其质量形成的关键期。在海拔300m～800m的