骨髓间充质干细胞通过tsg-6促进糖尿病小鼠角膜上皮再生的机制研究

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1、分类号：R772.2密级：UDC：617学校代码：11065博士学位论文骨髓间充质干细胞通过TSG-6促进糖尿病小鼠角膜上皮再生的机制研究杜显丽指导教师谢立信教授学科专业名称眼科学论文提交日期2015.10.19论文答辩日期2015.11.21答辩委员会主席蒋华教授摘要目的：随着糖尿病人群增多，糖尿病性角膜病变也逐渐成为眼科常见病，其发病机制与炎症反应紊乱、干细胞功能障碍等诸多因素相关。骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）是一类具有抗炎及免疫调节作用的成体干细胞。本课题通过移植BM-MSCs至链脲佐菌素（STZ）诱导的I型

2、糖尿病小鼠球结膜下，研究BM-MSCs促进糖尿病小鼠角膜上皮再生的分子机制。方法：1.通过腹腔注射STZ建立I型糖尿病小鼠100只，建模14-16周后使用；采用骨片种植法分离小鼠原代骨髓间充质干细胞并传代培养。2.糖尿病小鼠角膜上皮刮除后行球结膜下BM-MSCs移植，并以正常小鼠及PBS注射糖尿病小鼠做对照。每日通过裂隙灯观察角膜上皮愈合情况，免疫荧光检测地高辛（Dil）标记的BM-MSCs在角膜中的归巢、角膜中Ly-6g（+）中性粒细胞比例和抗炎因子肿瘤坏死因子α刺激蛋白-6（TSG-6）的表达分布情况;Ki67染色观

3、察角膜上皮细胞的分裂、增殖；进一步通过ELISA分析TSG-6在角膜上皮刮除前、后表达量的差异。3.进一步检测TSG-6结膜下注射对糖尿病小鼠角膜上皮再生的影响。裂隙灯观察角膜上皮修复情况；免疫荧光检测炎症因子环氧化酶-2（COX2）、中性粒细胞标记物Ly-6g染色情况；巨噬细胞CD68/CD206标志物表达及比例情况；qRT-PCR定量检测创伤后期角膜中炎症因子的表达情况。结果：1.BM-MSCs移植糖尿病小鼠角膜上皮再生速度明显快于对照糖尿病小鼠，并在角膜浅基质层发现少量BM-MSCs归巢，且角膜上皮细胞分裂、增殖较

4、对照糖尿病小鼠更活跃；BM-MSCs移植组角膜中的中性粒细胞显著少于对照糖尿病小鼠；角膜上皮损伤后，正常小鼠角膜中TSG-6的表达量显著上调，糖尿病小鼠较正常小鼠显著降低，而BM-MSCs移植可显著恢复TSG-6的表达。2.球结膜下注射TSG-6可显著促进糖尿病小鼠角膜上皮的损伤修复，抑制角膜中性粒细胞的侵润，下调COX2的表达；qRT-PCR结果显示TSG-6可显著降低糖尿病小鼠角膜中的炎症因子诱导性一氧化氮合酶（iNOS）、COX2的表达；而促进抑制炎症的细胞因子IL-10及精氨酸酶（Arg-1）的表达。3.流式细胞

5、术检测发现，与正常小鼠相比，糖尿病小鼠角膜损伤后，迁移到角膜中的CD45阳性的免疫细胞数量显著上升，且促炎的M1型巨噬细胞（CD45(+)/F4/80(+)CD86(+)）比例显著增加，而促修复的M2型巨噬细胞（CD45(+)/F4/80(+)CD206(+)）比例显著减少；BM-MSCs移植或TSG-6结膜下注射可显著抑制糖尿病小鼠角膜损伤后免疫细胞的侵润，且提高M2型巨噬细胞的比例。结论:1.BM-MSCs移植显著促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复：BM-MSCs可归巢至角膜损伤部位，提高角膜中TSG-6的表达，抑制中性

6、粒细胞侵润，促进糖尿病小鼠角膜上皮细胞分裂、增殖，促进角膜上皮修复。2.TSG-6显著促进糖尿病小鼠角膜上皮修复：TSG-6可抑制中性粒细胞的侵润，降低炎症因子的表达，促进抑炎因子表达，促进角膜上皮修复。3.糖尿病小鼠巨噬细胞功能异常：角膜上皮损伤后，角膜中的巨噬细胞致炎性M1型比例升高，促修复的M2型比例下调；而BM-MSCs移植和TSG-6结膜下注射可显著改善M1/M2巨噬细胞的比例。博士研究生杜显丽（眼科学）指导教师谢立信教授关键词：糖尿病性角膜病变；间充质干细胞；肿瘤坏死因子α刺激蛋白-6AbstractPurp

7、ose:Diabetickeratopathyhasbeenafrequentlyencountereddiseasewiththeincidenceofdiabetesincreasedyearbyyear;Itspathogenesisisassociatedwithmanyaspectssuchasdisordersofinflammationandstemcellsfunction.Themesenchymalstemcells(MSCs)areonekindofadultpluripotentstemcells

8、withanti-inflammatoryandimmuneregulationfunction.ThroughsubconjunctivaltransplantationofMSCstothestreptozocin(STZ)-inducedtype1diabeticmice,thisstudyresearched