短序列增强子和alu重复序列影响基因表达的实验研究和生物信息学分析

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1、授予单位代码10089参,学号或申请号20121018多"Ml,7HebeiMedicalUniversity博士学位论文科学学位短序列增强子和Alu重复序列影响基因表达的实验研究和生物信息学分析研究生：马志红导师：吕占军教授王秀芳教授专业：免疫学二级学院：基础医学院2015年4月河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研宄所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公幵和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署

2、名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研宄生签名导师签章：二级学院领导盖章>/5年今月>丨日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人己发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。—年十月>/曰录巾翅s1英文摘要8英文缩写18研究论文短序列增强子和Alu重复序列影响基因表达的实验研究和生物信息学分析弓丨言19第一部分短序列增强子及其衍生

3、序列对GFP基因表达的影响前言21材料与方法22结果37酬40赚45讨论50如吉51参考文献52第二部分Alu重复序列影响GFP报告基因表达的实验研究前言55材料与方法55结果59m63赚69i寸i仓70^72参考文献72第三部分a珠蛋白基因簇中SINE重复序列生物信息学分析前言77材料与方法78结果78酬81随87i寸i仓90崎91参考文献91仓99综述一RNA活化基因表达的研究进展100综述二RNA在转录水平影响基因表达的研究进展109辦射117个人简历118中文摘要短序列增强子和Alu重复序列影响基因表达的实验研究和生物信息学

4、分析摘要目的：顺式作用元件是位于DNA分子中调节基因表达的序列，对基因表达调节有重要的作用，但是这些顺式作用元件的功能及调节基因表达的作用机制大部分仍然未被阐明。研究顺式作用元件调控影响基因表达的作用机制，对于研究生物表观遗传、分化、衰老和肿瘤发生等生物学现象具有重要的意义。增强子是一种活化基因的顺式作用元件，能够增强基因表达，在调节基因表达过程中发挥着重要作用。基因表达调节是当前生物学中的一个焦点问题，与衰老，分化，肿瘤发生等多种生物学现象相关。为了更深地理解这些生物学现象,必须阐明基因表达调节的机制。虽然基因表达调节机制非常复杂

5、，但是可以用简化的系统进行研究。为了研究短序列增强子活化基因的作用机制，我们在前期工作中建立了一个简化的研究系统：利用Alu元件抑制GFP报告基因表达，用绿色荧光蛋白表达系统研究短序列DNA及其衍生序列的增强子活性。本研究室在前期工作中，由14个拷贝的Alu同向串联（Alu×14）插入到pEGFP-C1质粒中GFP报告基因的下游，从而构建C1-Alu×14质粒。我们发现将C1-Alu×14质粒瞬时转染HeLa细胞后，Alu×14序列对GFP报告基因表达具有显著抑制作用；短序列AA（5′-GTGAAATAAATGCAAATAAAGT）

6、插入C1-Alu×14质粒中GFP基因和Alu×14序列之间构建的C1-AA×2-Alu×14质粒瞬时转染HeLa细胞后，短序列AA可以部分解除Alu×14序列对GFP报告基因表达的抑制作用，表现出一定的增强子活性。在本研究中，我们重点研究的是AA序列及其突变序列调节GFP报告基因表达的作用机制及增强子序列的结构对基因表达所产生的影响。Alu元件是人的主要短散布核元件（SINE），有一百多万拷贝，大约占全部人类基因组的十分之一，在生物进化过程中SINE一直是强制存在，因此多数学者认为SINE具有重要的生物学功能。然而，至今为止多数A

7、lu元件的生物学功能仍未阐明。许多证据表明Alu元件属于沉默子，其1中文摘要可以抑制基因表达。在细胞核中AluRNA作为转录协同抑制物，是反义转录组中最多的部分，具有以顺式作用或者反式作用的方式下调正义表达的可能性。我们的前期研究表明Alu元件通过触发染色质紧密包装抑制GFP报告基因表达。虽然认为Alu元件属于沉默子，但是在看家基因和高表达染色体中，Alu元件含量却十分丰富，这个矛盾现象长期困扰着生物学家。为了研究基因组中Alu元件的生物学意义，我们做了一些关于Alu元件的实验研究和生物信息学分析。方法：1DNA模板及引物的合成。委

8、托北京赛百盛基因技术有限公司合成携带适当的核酸内切酶识别位点的引物及DNA模板。本论文中所用到的引物及DNA模板的名称和具体序列参见论文的附表。2表达载体的构建。2.1AA及其衍生序列相关表达载体的构建。设计带有合适的2个限制性内切酶