痤疮丙酸杆菌（pa）抗体预防胸膜肺炎放线杆菌（app）感染及pa与app共同抗原表位的筛选与鉴定

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1、痤疮丙酸杆菌（PA）抗体预防胸膜肺炎放线杆菌（APP）感染及PA与APP共同抗原表位的筛选与鉴定Thepreventionofanti-PropionibacteriumacnesantibodytoActinobacilluspleuropneumoniaeinfectionandthescreeningandidentificationofcommonepitopesbetweenthetwobacteria作者姓名：马秋月专业名称：预防兽医学指导教师：雷连成教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月6日本

2、研究由“国家自然科学基金”(No.31172351)资助ThisresearchwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.31172351)中文摘要痤疮丙酸杆菌（PA）抗体预防胸膜肺炎放线杆菌（APP）感染及PA与APP共同抗原表位的筛选与鉴定猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae，APP）是一种革兰氏阴性小球杆菌，能够造成猪传染性胸膜肺炎，对世界养猪业造成巨大的经济损失。APP分为15个血清型，

3、由于主要的血清型之间缺乏交叉免疫保护导致疫苗研究进展缓慢。痤疮丙酸杆菌（Propionibacteriumacnes，PA）是一种广泛存在于人或动物体表、体腔及病灶中的革兰氏阳性短棒状杆菌，具有佐剂作用，能够刺激机体单核巨噬细胞系统及炎性因子的释放，对抗多种病原菌的感染。本课题组在前期系统筛选APP主要血清型之间的差异基因过程中，意外地发现PA与APP之间存在很强的交叉免疫反应，PA可以预防APP感染。PA对APP感染的特异性预防作用是以体液免疫为主的，PA免疫后刺激B细胞产生的IgG抗体能够显著提高小鼠的存活率，

4、抗体水平越高，保护效果越好。但是PA的抗体通过何种方式发挥作用，以及究竟是哪些表位诱导产生的抗体来预防APP感染尚不清楚。为阐明PA抗体在预防APP感染过程中的作用方式，寻找PA与APP之间具有交叉免疫保护作用的共同抗原表位，促进猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研究，本研究首先分别构建中性粒细胞、巨噬细胞损耗小鼠模型，给予足量PA抗体后用APP攻毒，测定小鼠保护率、肺部细菌定植量以及肺脏病理变化，评价PA抗体在预防APP感染过程中对中性粒细胞和巨噬细胞的依赖性，阐明PA抗体在预防APP感染过程中的作用方式。随后构建PA全

5、基因组噬菌体随机展示文库，以APP1高免血清做为固相靶分子对构建的文库进行筛选；对筛选到的蛋白进行B细胞表位预测，并与APP1进行比对，寻找与APP1同源率高的表位进行合成；以PA高免血清及APP1高免血清对合成的多肽进行筛选，筛选得到的多肽与KLH偶联后免疫小鼠，ELISA检测免疫后IgG水平、各抗血清与PA及APP的血清学反应以及IL-4、IFN-γ++水平，流式分析脾脏中CD4/CD8T细胞的比例，并测定APP1攻毒后各免疫组小鼠存活情况，综合分析表位肽的免疫效果以及预防APP感染的能力；之后将筛选出的具有保

6、护效果的共同抗原表位肽联合免疫小鼠，APP1及APP5分别攻毒后，评价共同抗原表位肽保护小鼠对抗不同型APP感染的能力。实验表明抗PA的IgG能够显著促进巨噬细胞对APP的吞噬作用，吞噬效果与抗APP的IgG相似；巨噬细胞损耗的小鼠，无论是否给予PA抗体，均不能有效对抗APP感染，PAI抗体预防APP感染过程中必须依赖巨噬细胞；而中性粒细胞无论损耗与否，PA抗体均能够保护小鼠对抗APP的感染，PA抗体在预防APP过程中不依赖于中性粒细胞。构建PA全基5因组噬菌体展示文库，库容量为10，应用该文库筛选得到10个PA与

7、APP共同抗原蛋白；对筛选到的抗原蛋白进行B细胞表位预测并与APP1进行比对后，获得6个与APP1同源率高的表位，分别为A2、Ba1、Ba2、Bb4、Bb5及C1；除A2外，其余五个表位均与抗PA高免血清及抗APP1高免血清有特异性反应。五个多肽免疫小鼠后抗体水平均有所增加，多肽Ba1、Bb5及C1抗血清与PA及APP抗原具有特异性反应，而多肽Ba2、Bb4没有特异性反应；免疫荧光显示，Ba1、Bb5抗血清能够较好地识别APP1。多肽Ba1、Bb5、C1免疫后小鼠的IL-4水平上升，而仅Ba5免疫的小鼠IFN-γ水

8、平上调，表明Bb5诱导Th1/Th2++混合免疫应答，Ba1、C1倾向于Th2免疫应答；多肽Ba1、Bb5免疫后CD4/CD8T细胞的+比值高于对照组，CD4T细胞占优势，体液免疫起主导作用；APP1攻毒后，多肽Ba1、Bb5对小鼠的保护率均为80%。多肽Ba1、Bb5联合免疫小鼠后，对APP5型攻毒小鼠的保护率为90%，对APP1型攻毒小鼠的保护率为80%