《江苏地区猪嵴病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
．？．—苗、．心＇义．－．＞．；痛只＞豕－＇．－＂■一．‘：分类号．学号Ｍ１２０＾２＿二＾＇＇－一ｆ．＇＊？、？ＵＤＣ－－＇：密级？这４，＾壤叫大Ｉ洛蒂ＹＡＮＧＺＨＯＵＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＩｊ＾Ｖ三卢’项壬学隹冷文＼‘记弯（学术型）麟江苏地区猪峭病毒感染流行病学调查和全基因姐遗传进化分析．＂濤＂＇户杨振，指导教师姓名：金文杰副教授秦爱建教援，扬州大学，江苏扬州，２２５００９申请学位级别：硕壬学科专业名称；预防兽医学论文提交日期１５２０１５：２０年６月论文答辩日期：年６月４日学位授予单位：扬州大学学位授予日期２０１５：年６月３０日答辩委员会主席：郭爱珍教授％誦年６月今－玄：古－一＇．至＇若、．一＊．．．＾＇Ｖ－占—ｖ：Ｃ心、、、Ｉ＾：．．去庐＞ｅＶ．忠亡；，， 江苏地区猪峭病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析Ｃｏｍｐｌｅ化ｇｅｎｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｕｓｉｎｉｎｈｃｔｅｄｉｓｊｆｒｏｍＪｉａｎｓｕｐｇｐｇｇＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ，硕：ｔ生：杨振导师：金文杰副教授秦爱建教授杨州大学２０１５年６月 区猪啼病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析杨振：江苏地江苏地区猪峭病毒感染流行病学调查和全基因细慶传进化分析摘要猪峰病毒（ＰｏｒｃｉｎｅＫｏｂｕｖｉｍｓ，ＰＫＶｓ）是小ＲＮＡ病毒科（Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）赠病毒属（ｋｏｂｕｖｉｍｓ）的成员，于２００８年首次发现。在世界多个国家的猪群中均发现了该病毒，越来越多的证据表明该病毒与猪腹泻疫情有关。猪腹泻病影响和危害我国养猪生产和养猪，自２０１０年Ｗ来业发展，我国大部分省份爆发了＾水样腹泻、脱水、呕吐为特征的哺乳！仔猪病毒性腹泻疫情，这其中病毒性腹泻疫，发病率和死ｔ率高，给养猪业带来巨大损失＇？？情引起养猪业的普遍关注。在腹泻猪群中检测到了猪峰病毒，并且猪峭病毒可能会导致仔猪腹泻。猪赠病毒目前尚未实现体外分离，对该病毒的研究大多是对其分子流行病学的调查研究。在ＰＫＶｓ的基因结构中，３Ｄ基因猪嗚病毒最保守的基因，其编码的蛋白在病毒增殖的一种非结构性的病毒特异性蛋白动物机体内和感染的细胞培养液中发现的，被称为病毒感染相关蛋白。ｖｎ基因是赠病毒基因组中最具可变性的区域，编码的蛋白是衣壳蛋白中暴ＲＮＡ病一Ｐ露最多的免疫显性蛋白，同小毒科其他病毒样Ｙ１基因编码的蛋白可引起宿主机体产生免疫反应，是崎病毒的抗原位点，是微ＲＮＡ病毒分属的重要依据。－ＰＣ民检测方法本研究建立了针对ＰＫＶｓ３Ｄ基因和ＶＰ１基因的ＲＴ，对犯基因和ＶＰ１基因进行基因特征分析并对注苏地区猪峭病毒进行全基因组测序分析，旨在通过对江苏地区猪群中猪峭病毒的分布流行情况进行分子流行病学调查，了解该病毒在猪群中的感染状一况，丰富猪崎病毒的流行病学数据，为防治猪腹泻疫情提供定的参考。１猪略病毒３Ｄ基因ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立＾＇ｅｏｂｕｖ一根据猪赠病毒（Ｐｏｒｃｉｎｋｉｒｕｓ，ＰＫＶｓ）３Ｄ基因保守序列设对特异性引物，建－ＰＣ民方法立了检测猪棉拭样本中的猪崎病毒的民Ｔ，该方法能特异性的检测猪峰病毒，而对其它病原如猪流行性腹泻病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｍｓ，ＰＥＤＶ）、ｐ猪传染性胃肠炎病毒（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓ化ｌｅｇａｓｔｒｏｅｎｔｅ加Ｓｖｉｒｕｓ’ＴＣＥＶ）、猪Ａ群轮状病毒（Ｏｒｏ叩Ａｐｏｒｃｉｎｅｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＧＡ ２扬州大学硕击学位论文ＲＶＣｌａｓｓｃａｓｗｎｅｅｖｅｒｖｒｕＳＦＶＲ）、猪盈病毒（ｉｌｉｆｉｓ，Ｃ）、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒（ＰｏｒｃｉｎｅｅｄｕｃｉｖＲｅｓｉｒＳｒｉｒｕ，ｏｒｃｎｅｃｒｃｏｖｒｕｓＰＣＶｐｒｏｔｅａｎｄｐａｔｏｒｙｙｎｄｏｍｅｖｓＰＲＲＳＶ）、猪圆环病毒（ｐｉｉｉ，）、猪大肠杆菌则不能检出．，用该方法能检测的浓度为０１２６３，灵敏度高ｐｇ，可用于对江苏地区猪群中猪崎病毒的检测。２猜腹泻病原混合感染检测及猪晴病毒３Ｄ基因和ＶＰ１基因特征分析－ＰＣＲ检测方法对２０用建立的猪嚼病毒３Ｄ基因艮Ｔ１２年８月至２０１３年１２月从江苏１３个地区４６个猪场采集的３９６份猪腹泻肛拭样本进行检测。结果显示猪场阳性率和病料阳性率分别为８０．４％和４５．７％，表明猪峭病毒广泛存在于江苏地区猪群中。随机选取１９份病料进行猪？峰病毒３Ｄ基因分析。１９个猪崎病毒３Ｄ基因的核昔酸和氨基酸相似性分别为８８．０％１００％６９？￣和．４％１００％，而与其它峭病毒的核昔酸和氨基酸相似性分别为６９．６％７８％２７．８．８和一？％５６．９％。进化树分析显示不同地区的猪峭病毒３Ｄ基因处于同分支，说明江苏地区猎哨■＇一定的地理限制。１８５份病料经检测发现含有２种及两种Ｗ上其它病原，其中有６８；病毒没有份ＰＫＶｓ病料检测阳性的样本有３１份检测到其它病原，说明在江苏地区猪崎病毒与其它病原发生混合感染。使用设计的针对猪峭病毒ＶＰ１基因的特异性引物，对２０１４年８月至２０１５年２月从江苏地区采集的９１份腹哲仔猪棉拭样本和份临床健康仔猪棉拭样本进行检测，腹泻仔猪猪峰病毒感染率６４．８％（５９／９１）；临床健康仔猪感染猪峭病毒感染率为１９．８％口５／１２６）。随机选取２８个ＶＰ１基因测序分析显示，２８个ＶＰ１基因的氨基酸同源性为８０％？？１００％．３．６。，核巧酸同源性为７９％１００％进化树分析显示，２８个ＶＰ１基因分为四个群，其中腹辑猪感染的猪崎病毒ＶＰ１基因分布在四个不同的群；所有临床健康猪群感染的猪峭病毒ＶＰ一１基因分布在同个群并显示较近的基因同源性。结果表明江苏地区腹泻猪群中流一行的猪嚼病毒表现定的基因多样性，而临床健康猪群中则不然。这种差异可能与猪峭病毒的潜在致病性有关。３猪峰病毒全基因组的测序与基因遠传进化分析根据ＧｅｎＢａｎｋ公布的ＰＫＶｓ全基因组序列，设计１２对针对ＰＫＶｓ全基因组的特异性引物，２－－ｏ对从江苏地区检测的株ＰＫＶｓ进行全基因测序分析。ＪＳ０１ＣＨＮ检测自腹泻仔猪ｌ，除去ｐｙ’Ａ８２－（）基因组全长为１４ｎｔ，开放阅读框（ＯＲＦ）基因全长为７４７０化５ＵＴＲ长度为５７６ｎｔ，与参’一ＪＳ－－－考毒株比较发现０１ＣＨＮ的ＶＰ１基因编码的氨基酸第２３７位插入个氨基酸３ＵＴＲ基，在一因的８－－Ａ１０位插入个胸腺嚼瞎。ＪＳ０２ａＣＨＮ来自临床健康仔猪，除去ｐｏｌｙ（）基因姐全长为 杨振：江苏地区猪峰病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析１＿８１２１ｎｔ，在其２Ｂ编码区缺失３０个氨基酸，这是首次发现感染健康ＰＫＶｓ的２Ｂ区的氨基酸缺失，送可能是ＰＫＶ谜化过程中变异的结果。序列分析发现，两株ＰＫＶｓ全基因序列与参考－－序列编码区氨基酸和核巧酸同源性分别为９４．３％９６．４％和８７．８％８９．３％，而与其它曠病毒则°’’￣￣５６－－为．２／Ｖ６５．１％５９．０％６６．１％。５ＵＴＲ３ＵＴＲ与其它ＰＫＶｓ核巧酸和和同源性为一９５－－。－－－－．１％９７．０％和８９．Ｐ／Ｄ９７．０％进化树分析显示ＪＳ０２ａＣＨＮ和ＪＳ０１ＣＨＮ处于同分支并和－ＰＫＶｓ较近－。对ＰＫＶｓ全基因组进０１ＣＨＮ行重沮分析发现，化存在潜在的重组事件，这可能是全基因组不同基因片段拼接导致的结果，为了解ＰＫＶｓ的重组特点，需要对更多的全基因序列进行测序分析。－ＰＣＲ３ＤＶＰ关键词：猪哨病毒，ＲＴ，１基因，进化树分析基因，，氨基酸同源性，核昔酸同源性，生物信息学 ４扬州大学硕±学位论文Ｃｏｍｐｌｅｔｅｅｎｏｍｅａｎａｌｓｉｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｙｅｉｄｅｍｉｏｌｏｏｆｔｈｅｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｕｓｉｎｐｇｙｐｇｉｎ化ｃｔｅｄｉｓ化ｏｍＪｉａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａｐｇｇ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓｍａ－－Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓｅｓａｒｅｌｌｎｏｎｅｎｖｅｌｏｅｄｖｉｒｕｓｅｓｗｉ化ｓｉｎｌｅｓｔｒａｎｄｅｄ，ｐｇ，－ＲＮＡｗｏｓｉｔｉｖｅｓｅｎｓｅｅｎｏｍｉｃｉｔｈｉｎｔｈｅ拉ｍｉｌＰｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅｅｎｕｓｋｏｂｕｖｉｒｕｓ．ｐｇｙ，ｇＴｈｅｖｉｒｕｓｗａｓｆｉｒｓｔｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎ２００８ｉｎｆｅｃａｌｓａｍｐｌｅｓｏｆｄｏｍｅｓｔｉｃｉｓｉｎＨｕｎａｒ，ｐｇｇｙａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｖｉｒｕｓｗａｓｄｅ１；ｅｃ１；ｅｄｉｎｍａｎｙｃｏｕｎｔｒｉｅｓ．ＳｉｎｃｅＤｅｃｅｍｂｅｒ２０１０，ｏｕｔｂｒｅａｋｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｗａｔｅｒｄｉａｒｒｈｅａｄｅｈｄｒａｔｉｏｎａｎｄｖｏｍｉｔｉｎｈａｖｅｙｙ，ｙ，ｇｏｃｃｕｒｒｅｄｉｎｓｕｃｋｌｉｎｉｌｅｔｓｉｎ１０ｐｒｏｖｉｎｃｅｓｉｎＣｈｉｎａｗｉｔｈａｍｏｒｂｉｄｉｔｏｆ８０％ｔｏｇｐｇｙ１００％ａｎｄ５０％ｔｏ９０％ｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ｏｕｔｂｒｅａｋｓｈａｖｅｃａｕｓｅｄｓｅｖｅｒｅｅｃｏｎｏｍｉｃｌｏｓｓｅｓａｎｄｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｓｏｃｉａｌｅｆｆｅｃｔｓａｎｄｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｗｅｒｅｄｅｌｅｔｅｄｉｎｍｏｓｔｏｆ出ｅｓｅｐｄｉａｒｒｈｅａｉｓ．ＰＫＶｓｈａｖｅｄｅｔｅｃｔ；ｅｄｉｎｍａｎｃｏｕｎｔｉｅｓａｎｄｓｏｍｅｒｅｏｒｔｓｓｕｅｓｔｅｄｐｇｙｐｇｇ化ａｔ化ｅｖｉｒｕｓｍａｙｒｅｌａｔｅｔｏｏｒｃｉｎｅｄｉａｒｒｈｅａｌ．ｐＡ’ｔｒｅｓｅｎｔＰＫＶｓｃａｎｔｂｅｃｕｈｎｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏ化ｅａｔｈｏｅｎｉｃｉｔｏｆＰＫＶｓａｎｄｉｔｓ，ｐ；ｐｇｙｒｏｌｅｉｎｉｄｉａｒｒｈｅａｌｄｉｓｅａｓｅｉｓｎｏｔｗｅｌｌｕｎｄｅｒｓｔ；ｏｏｄ．ＭｏｓｔｒｅｏｒｔｓａｂｏｕｔＰＫＶｓｗｅｒｅｐｇｐｆｂｃｕｓｅｄｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ也ｉｓｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅ３Ｄｅｎｅｗａｓｕｓｕａｌｌｕｓｅｄｇｙｔｏｄｅ１；ｅｃｔ化ｅＰＫＶｓ．３ＤｅｎｅｉｓｔｈｅｍｏｓｔｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｒｅｉｏｎｏｆＰＫＶｓｉｔｓｃｏｄｉｎｇｇ，ｇｐｒｏｔｅｉｎｉｎａｎｉｍａｌｖｉｍｓｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎ比ｅｂｏｄａｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｉｎｃｅｌｌｃｕｌ山ｒｅｓｆｂｕｎｄｐｙａｖ－ｉｍｓｓｅｃｉｆｉｃｉｔｏｆｎｏｎｓ让ｕｃｔｕｒａｒｏｅｉｎｋｎｏｗｎａｓａｖｉｒａｌｉｎｆｅｃｉｏｎｒｅｌａｔｅｄｐｙｌｐｔｔ，ｒｏｔｅｉｎｓ．ＴｈｅＶＰ１ｅｎｅｏｆ也ｅＰＫＶｓｉｓ化ｅｍｏｓｔｖａｒｉａｂｌｅｒｅｉｏｎｉｎ化ｅｃａｓｉｄｅｎｅｐｇｇｐｇｏｆ化ｅｖｉｒｕｓａｍｏｎＰＫＶｓ化ｅｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｓｍａｈａｖｅａｃｌｏｓｅｇ，ｇｙｐｇｙ＾ｏｆｌｔｉｉｄｉａｈｅａ．Ｉｎ化ｉｔＵｉｎ化ｔｈｅｉｅａｏｎｓｈｉｗｉ化ｐｒｒｓｓｕｄｙ）ｃｒｅａｓｅｅａｗａｒｅｎｅｓｓｐｇ，ｓｉｔｕａｔｉｏｎａｎｄｔｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｆｉｉｒｔｈｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓａｂｏｕｔｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｗｅａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ３Ｄｅｎｅａｎｄｐ，ｇｇ 杨振：江苏地区猪晴病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析＾ＶＰ１ｅｎｅｏｆＰＫＶｓａｎｄｔｗｏｓｉｘａｉｎｓＰＫＶｓｗｅｒｅｓｅｕｅｎｃｅｄｔｈｅｃｏｍｌｅｘｇｅｎｏｍｅｇｑｐｕｓｉｎｇｉ打ｆｅｃｔｅｄｐｉｇｓｆｒｏｍＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ．Ｗｅｈｏｐｅ化ｉｓｓｔｕｄｙｃａｎｅｎｒｉｃｈｔｈｅｅｉｄｅｍｉｏｏｉｃａｌｓｕｒｖｅｄａａｏｆＰＫＶｓａｎｄｈｅｆｏｒｌｅａｒｎｉｎｅｒｅｌａｉｏｎｓｈｉｐｌｇｙｔｌｐｇｔｈｔｐｂｅｔｗｅｅｎＰＫＶｓａｎｄｉｓｄｉａｒｒｈｅａ．ｐｇ＊ｖｅｏ－ｋｃｔ１．ＤｅｌｍｅｎｔｏｆＲＴＰＣＲ化！ｄｅｉｏｎｏｆＰｏｒｃｉｎｅＫｏｂｕｖｉｒｕｓｐＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄａａｉｒｏｆｒｉｍｅｒｓｗａｓｄｅｓｉｎｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅ３Ｄｅｎｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｙ，ｐｐｇｇ＂－ｉｅｉｏｎｏｆＰＫＶｓａＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎＰｏｌｍｅｒａ化Ｃｈａｉｎ民ｅａｃｔｉｏｎＲＴＰＣ民ｇ；ｐｙ（）ｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔ－ｉｏｎｏｆＰＫＶｓｗａｓｄｅｖｅｌｏｅｄ．ＵｓｉｎｔｈｅＲＴＰＣ民ａｓｓａ化０ｐｇｙ，ｓｅｃｉｆｉｃｆｒａｍｅｎｔｏｆ２１７ｂｗａｓａｍｌｉｆｉｅｄ拉ｏｍｆｅｃｅｓｓａｍｌｅｏｆ化ｅＰＫＶｓｏｎｌｎｏｔｐｇｐｐｐｙ，ｆｒｏｍＰＥＤＶ，ＴＧＥＶ，ＧＡ民Ｖ，ＰＲＲＳＶ，ＣＳＦＶ，ＰＣＹａｎｄＥｓｃｈｅｒｋｈｉａｃｏｌｉ．Ｔｈｅ－ｓｅｎｓ扣ｖｉｔｏｆ化ｅ民ＴＰＣ民ｗａｓ０．１２６３ｆｏｒ化ｅＰＫＶｓｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ．ＴｈｅｎｅｗｌｙｐｇｙｄｅｖｅｌｏｅｄｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔＰＫＶｓｆｒｏｍｃｌｉｎｉｃａｌｓｅｃｉｍｅｎｓｏｆｉｓｉｎｐｐｐｇＪｉａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ．ｇ，２．Ｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃ化ｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ３ＤｅｎｅａｎｄＶＰｌｅｎｅａｎｄｐｇｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｏｉｎｆｅｃｔｉｎａｔｈｏｅｎｓｉｎｄｉａｒｒｈｅｉｃｉｓｉｎＪｉａｎｓｕｇｐｇｐｇｇＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ，Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄ３９６ｓａｍｌｅｓｆｒｏｍｄｉａｒｒｈｅｉｃｉｓ〇打４６ｉｆａｒｍｓｉｎ＊ｎａｎｓｕｙ，ｐｐｇｐｇｇ－－－ＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａｗｅｒｅａｎａｌｚｅｄｂＲＴＰＣ民．Ｏ打ｅｈｕｎｄｒｅｄｅｉｈｔｏ打ｅｉｓ任ｏｍ３７，，ｙｙｇｙｐｇｆａｒｍｓｔｅｓ１：ｅｄｐｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒＰＫＶｓ．Ｐｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆ化ｅ３Ｄｅｎｅ仔ｏｍ１９ｙｇｙｇ－￣ｉｓｏｌａｔｅｓｓｈｏｗｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆ８８．０％！００％ａｎｄ６９．４％１００％ｆｏｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌｗｈｉｌｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｔｏｉｓｏｌａｔｅｓｏｆｏｔｈｅｒ，ｐｙ，ｙ〇－ｋｏｂｕｖ￣？ｉｍｓｅｓｗａｓ㈱．６％７８．８％ａｎｄ２７．８／〇５６．９％ｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．Ｏｎｅｈｕｎｄｒｅｄ，ｐｙｅ－ｉｈｔ円ｖｅｓａｍｌｅｓＣＯ打ｔａｍｅｄｔｗｏｏｒｍｏｒｅｗｈｏｅｎｓａｎｄ３１化８ＰＫＶｓｏｓｉｔｉｖｅｇｙｐｐｇ，ｐｓａｍｌｅｓｔｅｓｔｅｄｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒｏ也ｅｒ出ａｒｒｈｅｉｃａｔｈｏｅｎｓＣＯ打ｆｉｒｍｉｎｔｈｅｅｘｉｓｂｎｃｅｏｆｐｐｐｇ，ｇＰＫＶｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｃｏｉｎ拓ｃｔｉｏｎ．Ｉｎａｎｏｔｈｅｒｓｔｕｄｙ，９１ｓａｍｐｌｅｓ任ｏｍｄｉａｒｒｈｅｉｃｐｉｇｓ〇ａｎｄ－１２６ｓａｍｌｅｓｆｒｏｍｈｅａｌ化ｉｓｗｅｒｅａｎａｌｚｅｄｂＲＴＰＣ民６４．８／＾５９／９１ｐｙｐｇｙｙ，（）ｄｉａｒｒｈｅｉｃｉｌｅｔｓａｎｄ１９．８％２５／１２ｎｏｒｍａｌｉｌｅｔｓａｒｅｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒＰＫＶｓ．２８ｐｇ（巧ｐｇｐｐｏｓｉｔｉｖｅｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｓｅｌｅｃｔｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅＶＰｌｇｅｎｅ，ｔｈｅ ６扬州大学硕ｄｒ学位论文〇－－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｈｏｍｏｌｏｓｈｏｗｅｄ巧．６％１００％ａｎｄ８０．３％１００／｛）ｇｙ，ｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．ＰｈｏｅｎｅｔｃａｎａｌｓｉｓｒｅｖｅａｅｄｔｈａｔａＰＫＶｓｓｔｒａｉ打ｓｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｐｙｙｌｇｉｙｌｌｌｉｎｔｏ４ｃｌｕｓｔｅｒｓ．１５ｓｔｒａｉｎｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｏｓｅｓｕｆｆｅｒｉｎｇｄｉａｒｒｈｅａｐｉｇｓｓｅｇｒｅｇａｔｅｄｉｎｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｒａｎｃｈｅｓ，ａｌｌ化ｅＶＰ１ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｌｙｈｅａｌｔｈｙｐｉｇｓｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏ过ｂｉｒｏｕ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ出ａｔ化ｅＶＰ１ｅｎｅｓｈｏｗｅｄｇｇｐｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｉｓｔｈｏｓｅｗｉｔｈｄｉａｒｒｈｅａｂｕｔｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅａｍｏｎｃｌｉｎｉｃｈｅａｌｔｈｙｇｐｇｇｐｉｇｓｉｎ？ｎａｎｇｓｕｒｏｖｉｎｃｅｐ３．ＣｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｉｎＪｉａｎｓｕｒｏｖｉｎｃｅｐｇｑｐｇｐＢａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｅｕｅｎｃｅｓｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｔｒａｉｎｓ，ｔｗｅｌｖｅａｉｒｓｏｆｑｐｐ．ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ化ａｍｐｌｉｆｙ化ｅ出ｆｆｅｒｅｎｔｒｅｇｉｏｎｓｏｆ化ｅｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｅｎｏｍｅ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｔｗｏｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｓｐｇｙ，ｐ，ＪＳ－Ｏｌ－ＣＨＮａｎｄ－０２ａ－ＣＨＮｗｈＪＳｉｃｈｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｄｉａｒｒｈｅａｌａｎｄａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃｉｌｅｔｓｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．了ｈｓ化ｑｕｅｕｅｓｏｆｔｈｅｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｗａｓａｎａｌｚｅｄｕｓｉｎｔｈｅｐｇ，ｐｙｙｇ－－－ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｆｔｗａｒｅａｃｋａｇｅ．ＴｈｅｆｕｌｌｌｅｎｔｈｅｎｏｍｅｏｆＪＳ０２ａＣＨＮｗｈｉｃｈｐｇｇ，ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｈｅａｌｔｈｙｐｉｇｌｅｔｓ，ｉｓ８１２１ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ｎｔ）ｌｏｎｇｗｉｔｈｏｕｔｔｈｅｐｏｌｙＡｔａｉｌ．ｒｅｗａｓａ３０－ａｍ－－－－Ｔｈｅｉｎｏａｃｉｄｄｅｌｅｔｉｏｎｉｎ２ＢｃｏｄｉｎｒｅｉｏｎｏｆＪＳ０２ａＣＨＮａｓｉｔｉｓｇｇ，ｔｆｉｒ巧－－ｌｉｉｉｉｉｈｅＫｐｏｒｔｔｈａｔａ３０ａｍｉｎｏａｃｉｄｄｅｅｔｏｎｎｏｒｃｎｅｋｏｂｕｖｒｕｓｏｆａｓｍｔｏｍａｔｃｐｙｐｉｌｅｔｓｉｎｄｉｃａｔｉｎｔｈａｔｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｍａｈａｖｅｅｏｒａｈｉｃａｎｄｈｏｓｔｐｇ，ｇｐｙｇｇｐ－ｒｅｎｃｅｓ－出ｆｆｅｉｎｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｅｖｅｎｔｓｗｅｒｅ拓ｕｎｄｉｎｓｔｒａｉｎＪＳＯｌＣＨＮｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｉｌ约ｓｗｉｔｈ化泪ｒｈｅａ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅｗｅｓｕｅｓｔｔｈａｔ＾ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｍａｐｇ，ｇｇｙｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＰＫＶｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｔｏａｄｄｒｅｓｓｔｈｅｓｅｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓｉｎｆｕｔｕｒｅｓｔｕｄｉｅｓ，ｖｉｒｕｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｍｏｒｅｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰＫＶｆｉｅｌｄｉｓｏｌａｔｅｓｓｈｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｎｄｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆＰＫＶ．ｒｓ民Ｔ－ＰＣＲ３ＤｌＰｈｏｅｎｅＫｅｗｏｒｄｓ；；Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｕ，ｅｎｅ，ＶＰｅｎｅｌｔｉｃｙ，ｇｇ，ｙｇａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｈｏｍｏｌｏｇｙ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｈｏｍｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ 杨振：江苏地区猪峨病毒感染流行病学调查和全基因绝遗传进化分析１—目录摘要１Ａｂｓｔｒａｃｔ４胃录７符号说明．８一９第篇：ｊｔ献综述第一章猪病毒性腹辑９第二章猪赠病毒１５参考￥：２３：献第二篇试验研究３０一第章猪嘴病毒３Ｄ基因ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立３０１材料与方法３０２ＲＴ－ＰＣＲ方法的建立３２３结果３５＾４讨论３７；３８参考：＾：献第二章猪腹泻病原漏合感染检测及猪峭病毒犯基因和ＶＰ１基因特征分析巧１材料与方法巧２ＰＫＶｓ３Ｄ基因和ＶＰ１基因的测序分析４２３结果．．．４２４舰５３参考文献５５第Ｈ章江苏地区猪曠病毒全基因姐的遗传进化分析巧１材料与方法巧２目的基因片段的测序分析６３３结Ｓ６４４魏７３参考：＾献７４全诚结７６研究生期间发表论文７７致谢７８扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书７９ ８扬州大学硕壬学位论文符号说明缩写英文名称中文名称化ＶｓＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ猪崎病毒ＡｉＶＡｉｃｈｉｖｉｒｕｓ爱知病毒ＢＫＶＢｏｖｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ牛赠病毒ｃＤＮＡｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＤＮＡ互补ＤＮＡＤＥＰＣｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ焦憐酸二乙醋ｄＮＴＰｓｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅＨ磯酸脱氧核糖核巧ＤＴＴｄ伽ｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ二硫苏糖醇ＥＤＴＡｅｔｈｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ乙二胺四乙酸ｙＧＡＲＹＧｒｏｕｐＡｐｏｒｃｉｎｅｒｏｔａｖｉｒｕｓ猪Ａ群轮状病毒ＰＥＤＶｏｒｃｉｎｅ）ｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｍｓ猪流行性腹泻病毒ｐｑＴＧＥＶｔｒａｎｓｍｉｓｓ化ｌｅａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓｖｉｍｓｏｆｓｗｉｎｅ猪传染性ｇ胃肠炎病毒ＰＲＲＳＶＰｏｒｃｉｎｅＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ猪繁殖与呼征病毒ｙ释障碍综合ＣＳＦＶＣｉｌｓｗｉｆｉ．ｌａｓｓｃａｎｅｅｖｅｒｖｒｕｓ猪癌病毒ＰＣＶｐｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ猪圆环病毒Ｅｉｉｉｉ．ｃｏｌｉＥｓｃｈｅｒｃｈａｃｏｌｂａｃｔｅｒａ埃希氏大肠杆菌ｋｂｋｉｌｏｂａｓｅｐａｉｒ千碱基对Ｌｌｉｔｅｒ升ｍｉｎｍｉｎｕｔｅ分钟ｍｇｍｉｌｌｉｇｒａｍ毫克ｍＬｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ毫升ｍｏｌ／Ｌｍｏｌｅ／ｌｉｔｅｒ摩尔／升ｎｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ核昔酸ＯＲＦｏｅｎｒｅａｄｉｎｆｒａｍｅ开放阅读框ｐｇＣＤＳＣｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ编码序列－ｍｅｒａｓｅＲＴＰＣＲｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｌ沈ａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ反转录多聚酶链式反应ｐｙＦ／ＲＦｏｒｗａｒｄｒｉｍｅｒ／Ｒｅｖｅｒｓｅｒｉｍｅｒ上游引物／下游引物ｐｐｍｒｅｖｏ山ｔｉｒｐｉｏ扫ｐｅｒｍｎｉ胞猜每分钟Ａｍａｍｉｃｉｌｌｉｎ氨弔青霉素ｐｐＲＮＡｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ核糖核酸ＲＴ－ＰＣＲ－ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎｏｌｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ反转录聚合酶链式反应ｐｐｙＵＴＲｓｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｓ非编码区ＶＰｖ－ｇｉｒａｌｒｏｔｅｉｎｅｎｏｍｅｌｉｎｋｅｄ病毒末端结合蛋白ｐｇＳｓｅｃｏｎｄ秒ｉｍｉｃｒｏｒａｍ微克＼ｇｇＬｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ微升ｐ 杨振：江苏地区猪踏病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析９＿第一篇文献综述第一章猪病毒性腹泻１猪病毒性腹泻病毒腹辑是猪群经常发生的疾病，因腹泻引起的机体脱水会导致猪死亡而产生巨大经济损Ｗ失。导致猪腹箱的病原是多样的，包括多种病毒、细菌化及寄生虫等因素。但病毒是主要的因素。引起猪病毒性腹泻的病原包括猪流行性腹損病毒（ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃ出ａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓ，？￡０＼０、猪传染性胃肠炎病毒（打抑５１１如５化１６３３３化０６１化〇乂扣３，１０５＼０、猪八群轮状病毒（Ｇｒｏ呼Ａｐｏｒｃｉｎｅｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＧＡＲＶ）、猪癌病毒（Ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｍｓ，ＣＳＦＶ）、猪伪狂犬病毒（ＰｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓＶｉｍｓ，ＰＲｏＶ）及猪细小病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＰＰＶ）等，但目前引起猪病毒性腹泻病的病原主要为猪Ａ群轮状病毒（ＧｒｏｕｐＡＰｏｒｃｉｎｅｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＧＡＲＹ）、猪流行性腹泻病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ巧ｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｍｓ，ＰＥＤＶ）及猪传染性胃肠炎病毒一（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｖｉｍｓ，ＴＧＥＶ），同时还有些新发病毒也可能引起猪的腹泻，ｇ４—７如猪嘴病毒（ＰｏｒｃｉｎｅＫｏｂｕｖｉｒｕｓＰＫＶｓ）和ＰｏｒｃｉｎｅＢｏｃａｖｉｍｓ，ＰＢｏＶ。但目前，，博卡病毒（）ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ和ＧＡＲＶ这三种病毒危害最为严重，对各种年龄阶段的猪群都易感，但对仔。２０１０年１０月开猪的危害最大，病死率最高自始，新生巧猪病毒性腹涅在东南亚多个养猪国家流行，并且波及到中国东南部１０多个养猪大省，并呈现高发病率、高死亡率的形势，死亡仔猪超巧１００万头，严重危害我国养猪业健康发展，给中国养猪行业造成了巨大的经８济损失。１．１病原特化１．１．１猪流行性腹泻病毒（ｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｍｓＰＥＤＶ）ｐｐ，猪流行性腹泻病毒巧ＥＤＶ是是有囊膜的单股正链ＲＮＡ病毒，属于冠状病毒科）ｏ’Ｃｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ冠状病毒属（Ｃｏｒｏｎａｖｉｍｓ成员。其基因组全长约２８ｋｂ，包含５端帽子结构（））’Ａ（ｃａｐ）和３端ｐｏｌｙ尾，有至少７个开放阅读框（ＯＲＦ，编码纤突蛋白巧）小膜蛋白化）（）），，膜糖蛋白（Ｍ）Ｗ及核衣壳蛋白（Ｎ）４个结构蛋白和复制酶多聚蛋白ｌａ和比，Ｗ及ＯＲＦ３蛋白’（ＯＲＦ３）３个非结构蛋白５－，几种蛋白在基因组上排列的顺序为复制酶－’９１１－－－－－－＝－＝Ｍ－（ｌａ／化）ＳＯＲＦ３ＥＮ３（图１）。该病毒在４。ｐＨ５．０９．０或者巧。ｐＨ６．５７．５时较稳＂定ＰＥＤＶ没有血凝性。 〇扬州大学硕±学位论文ｉＰＥＤＶ的细胞培养相对比较困难，１９８４年，我国学者宣华用猪胎肠单层细胞首次成巧ｉ４的在体外分离到了ＰＥＤＶ。１９８８年，Ｈｏｆｆｍａｎ等在Ｖｅｒｏ细胞中加入膜酶并成功分离到了ＰＥＤＶｉｓ。我国李树根等人在Ｖｅｒｏ细胞培养液中加入膀酶，用ＰＥＤＶ感染Ｖｅｒｏ细胞，经一过代即可产生明显的细胞病变ｅｒｏ－，并且成功适应Ｖ细胞的ＰＥＤＶ可在ＳＴ和ＰＩＣ１５细Ｗ胞上继续増值。另外，韩国和日本的学者也报道了ＰＥＤＶ在Ｖｅｒｏ细胞上的分离培养特？１７性。ＰＥＤＶＧｅｎｏｍｅｙ’３０Ｃ１０１５扣２０巧比１Ｉ？Ｉ１１Ｘ＂ＡＷＡＣ（巧＂ＯＲＦＳ？魄■＊＊＊＊＊＊＊＂＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＂＾％，ｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉｉＢＦＭｉＰ，一．．．＂二：图１ＰＥＤＶＣＶ７７７结构和基因组模式图Ｓｏｎ２０１２（引自ｇ等，）ｃｈｅｍａ＊Ｆｉ．１Ｓｔｉｃ１化化ｎｔａｔｉｏｎｏｆ化ｅＰ巨ＤＶｅｎｏｍｅｂａｓｅｄｏｎ化ｅＣＶ７７７Ｓｏｎｅｔ．１ｇ巧ａｌ２０２ｇ（ｇ，）１．１．２猪传染性胃肠炎病毒（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓ化ｌｅａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓｖｉｍｓＴＧＥＶ）ｇ，猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）在病毒分类委员会的官方网站上被归类于冠状病毒科Ｃｏ（＂ｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、冠状病毒属（Ｃｏｒｏｎａｖｉｍｓ）成员。其基因组结构为单股正链有囊膜的ＲＮＡ病毒，３２８６ＫｂｘｋＤ片段长度为．，平均分子量大小为６．８ｌ〇整个基因组共有７个基因，其排列顺序，＇ｉ－－－－－－－－－ＯＲＦ－为５ｌａＯＲＦ比Ｓ３ａ３ｂｓＭＭＮ７３。ＴＧＥＶ的４个主要结构蛋白为纤突糖Ｓ蛋白、小膜（）９Ｉ（ｓＭ）蛋白、膜结合（Ｍ煙白和核衣壳（Ｎ）蛋白（图２）。ＴＧＥＶ病毒粒子形态多样，呈圆或？？楠圆形Ｗ及不规则形状，直径大小约为９０２００ｍｎ１４２８ｎｍ，，长约表面有纤突，末端呈球Ｍ一一状。有些病毒粒子在用憐鹤酸负染后可见到个无特征的透明核必，在其内部具有个２１串珠样的丝状物。’ＴＧＥＶ无耐热特性－－－，病毒在冻存状态下较为稳定。细胞培养病毒在２（ＴＣ、４０Ｃ、８０’’‘Ｃ一。条件保存年，滴度无明显降低３７Ｃ放置４ｄ全失去感染力５６Ｃ４５ｉｎｉｎ或６５，则完；在’Ｃ２２ｌＯｍｉｎ就可全部灭活。 杨振：江苏地区猪晴病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析ｎ＿ＲｅｙｎｏｌｄｓＤＪ等人通过体外实验证明了ＴＧＥＶ可Ｗ在猪睾丸细胞或猪甲状腺细胞２３（Ｓｗｉｎｅ化ｓｔｉｃｌｅ，ＳＴ）上增殖。ＴＧＥＶ野毒株在最初分离后对细胞不容易适应，在实验一室研究中，常用的分离增殖ＴＧＥＶ的细胞系是ＳＴ细胞，适应ＳＴ细胞后的病毒效价提高较快，其次是ＰＫ１５细胞系，还有研究表明，ＴＧＥＶ对猪甲状腺细胞和唾液腺细胞也较敏感气：ｋｅｔｒｏｔｅｍｉｇｙｃｏｐ图２ＴＧＥＶ的模型图（引自ＲｉｆａｕｌｔＳ，１９９７）Ｆｉ．２ＴｈｅｍｏｄｅｉｆｆｌｇｌｏｆＴＧＥＶ（ＲａｕｔＳ，１９９７）１．１３ＡＧ乂Ｐｏｒｃｉｎｅ民ｏｔａｖｉｍＧＡＲＶ．猪群轮状病毒（ｒｏｕｓ）ｐ，２５猪Ａ群轮状病毒是呼肠孤病毒科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）轮状病毒属（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）的病毒成员。在电－ｍ镜下，病毒粒子无囊膜，呈车轮形状，直径约为７５ｎｍ１００ｎ，完整的轮状病毒粒子具有双２６层衣壳。到目前为止，根据抗原性质和序列的多样性，轮状病毒分为四个血清群，ＩＰＡ２７群、Ｂ群、Ｃ群和Ｅ群。四个群中，Ａ群的流行范围最为广范，是导致幼畜急性腹湾的主要２８２９’一引起仔猪腹泻的９０％左右病原之，占轮状病毒。ＲＶ的基因组由１１个双股ＲＮＡ基因片２９－３。段组成０．６Ｋｂ．３邸不等，总共编码１２种蛋白其中，ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、，片段大小从ＶＰ４、ＶＰ６、ＶＰ７是ＧＡＲＶ基因组编码的结构蛋白，ＶＰ４和ＶＰ７是病毒的外膜蛋白，结构蛋、白ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３是病毒的核屯蛋白。Ｎｓｐｌ、Ｎｓｐ３、Ｎｓ的、Ｎｓｐ４、Ｎｓｐ５、Ｎｓｐ６为ＲＶ基３Ｐ４一因组编码的非结构蛋白图）。Ｖ蛋白是种具有受体结合功能的非糖基化膀蛋白酶敏３１３２感住蛋白，ＶＰ６是群和亚群病毒的抗原蛋白，在ＶＰ７蛋白上有细胞韋的细胞抗原測３３位点，根据ＶＰ４和ＶＰ７的抗原特性，ＲＶ可Ｗ分为Ｐ亚型和Ｇ亚群，Ａ群轮状病毒总共有７个３４Ｐ亚群和１０个Ｇ亚群。ＧＡ民Ｖ对外界各种理化因素具有很强的抵抗力，较为稳定。病毒在常温下保存７个月仍 １２扬州大学硕击学位论文－有传染力。对乙酸、氯仿和去氧胆酸钢等有较强的耐受性，对酸碱（ｐＨ３９）Ｗ及瞒蛋白酶的’作用有抵抗力，使用这些试剂处理能保持毒力不减。但在５６Ｃ处理３０ｍｉｎ后能使其感染力下降。据报道，ＧＡ艮Ｖ的有些毒株具有血凝性，对人０型、豚鼠Ｗ及大鼠的红细胞可凝集３５具有凝集作用。一愈若ＳｍｉｃｍｒａｌＰｉｃｔｒｉ扭？其、側，＾＇。———时建．１一七娜＾ＶＰ了１说化（Ｐ）＾ｊ［图３猪轮状病毒电镜图和结构蛋白模式图（张贺伟，導）Ｆｉｇ．３Ｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆ艮ｏｔａｖｉｍｓ（１３０００Ｘ）ａｎｄＳ杜ＵＣ化ｒｅｏｆＧＡＲＶ％ＧＡＲＹ最祝能在经过膜蛋白酶处理过的猪原代肾细胞上生长。后来，病毒在非洲猴３７－０４肾细胞系ＭＡ１上能成功增殖，但是在适应细胞的过程中需要用膜蛋白酶处理。１．２流行病学３８３９Ｖ’猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤ于１９７１年在英国首先被发现，），随后在欧洲的多个国家３９开始流行开来，然后在亚洲国家，如中国、韩国、日本、泰国Ｗ及越南等国家爆发大流行给养猪业带来巨大的经济损失。近期该病在美国大规模爆发，我国在１９８０年就有４５该病发生的报道，自２０１０年至今，我国又爆发了大规模的ＰＥＤ，仔猪致死率极高，死亡率可达９０％，各个年龄段、全季节猪均会发病，给我国养猪业造成不小的影响。ＰＥＤＶ只对感染猪，并且各种年龄阶段的猪都能感染并发病。带病猪通过消化道传染给其它猪只。病、毒在肠绒毛上皮及肠系膜淋己结部位聚集，通过粪便排出后，对周围环境饲料、饮水、。ＰＥＤ交通工具等造成污染，进而传染到未感染猪，造成大面积的腹涅多发生于寒冷的季－节０１０８０％１００，尤其是Ｗ冬季发生最多。在中国，从２年口月爆发的仔猪腹泻至今己造成４６－％的发病率，死亡率为５０％９０％不等。陈强等２０１０年对福建规模化猪场腹泻仔猪ＰＥＤＶ的４７检测发现阳性率为１８．７５％。霍金耀等对采集于河南、河北、安徽和山西４省份的８２家猪场４８的病猪粪便样本进行检测发现ＰＥＤＶ阳性率高达６２．２％（５１／８２）。２０１１年甘海霞等对广西规４９模猪场采集的２１６份粪便样品检测表明ＰＥＤＶ阳性率为２７．７８％；２０１２年华南农业大学对１２７份从广东、广西、四川、江西、江苏、福建６个省份的４８个猪场采集的样本检测发现，Ｐ 杨振：江苏地区猪峭病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析＾ｓ０４３－ＥＤＶ阳性率为．〇。２０１１ＴＰＣ民１２％年，刘孝珍等使用胶体金从及民方法对国内０个省个直辖市的巧个发生严重腹泻的养猪场进斤检测，统计结果表明的９个猪场单独感染ＰＥＤＶ占，１６ＰＥＤＶ３３总猪场数的．３６％。２１９７３份病料单独感染总病料数的．３３％６份病料中；有，有，占５１１份病料与ＴＧＥＶ、ＧＡ民Ｖ发生漏合感染占总病料数的２７．８５％。在国外，２０，许多国家有关于ＰＥＤＶ的报道尤其是亚洲和欧洲。自１３年５月ＰＥＤＶ在美国首次爆发Ｗ来，己经导致７００万头猪死亡，波及１６个州的６．口万家养猪场，据报道这次爆５２发的ＰＥＤＶ毒株与中国毒株较为相近。政府为此设立了％２０万美元的专项资金用于预防控。制猪传染性腹辑（ＰＥＤＶ）和猪的新型冠状病毒病在日本，１９９３年到１９９４年爆发的ＰＥＤＶ导致５３１４０００头猪死亡２０１４年ＰＥＤＶ已导致７万头猪死亡。，猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）能导致２周左右哺乳巧猪发生严重腹泻，给世界范围５４的养猪业带来不小的损失。１９巧年，美国依利诺斯州对ＴＧＥＶ有首次的记载。，Ｄｏｙｌｅ和Ｈ山Ｃｈ１．６ｉｎｓ两位学者在９４５年首先化道了美国该病，但直到１９４年才确定该病的病原ｇ是冠状病毒。随后，在１９７化和１９８０ｓ，ＴＧＥＶ在多个国家有发现的报道，引起了世界各国家的高度重视，包括英国、日本、中国、比利时、非洲及澳大利亚。我国在６０年代发现了ＴＧＥＶ的流行在我国多地区报道了该病的发生，该病毒能与轮状病毒、流行性５５腹泻病毒发生混合感染，并且流行的趋势加剧，严重危害养猎业的发展。本病的主要传染源是病猪和带毒猪，可引起各种年龄的猪发病，但Ｗ１０日龄下的哺郭仔猪发病和死５６亡率最高，可达１〇〇％。一ＴＧＥＶ的￣１２爆发和流行有明显季节性，般于冬季和春季多发，发病高峰为月份。猪只的直接接触促进了病毒传播。母猪通过其孰汁给仔猪哺郭时传染给仔猪，也能通过呼。吸道在猪群中传播，另外发病后康复猪是发，带有病毒粪便可通过口、鼻在猪群中传播２５病猪场主要传染源，因为其带毒的时间可达８周。５７６９，轮状病毒最先是于巧年从小牛体内发现，猪轮状病毒感染猪群很常见目前，许２５—多养猪国家均有猪轮状病毒的感染的报道。国外的研究学者对猪的血清学监测发现７７％５８１００％的成年猪是染了猪Ａ群、Ｂ群、Ｃ群的ＲＶ。何孔庙１９９４年对我国华东地区猪血清中ＧＡＲＶ５９ＡＲＶ抗体的检测发现猪群抗体阳性率为６８．３％。国外学者研究发现，在腹泻猪中Ｇ感染约－°－－占１４％４４．％６．６．８％，其中１３周龄的仔猪的感染率为３０２，高于４周龄仔猪的１４ｒ。猪轮状病毒会通过粪－口的途径在猪群中传播并呈现一定的地方流行性。通过自然感染ＧＡＲＶ的猪Ｙ的一可产生并分泌针对病毒的抗体，并且对同种ＧＡＲ感染具有定的免疫力。抗体可经郭汁 １４扬州大学硕去学位论文由母猪传给新生斤猪。１３．临床症状和病理变化这兰种病毒都可Ｗ引起猪的严重腹泻，其中ＰＥＤＶ的主要临床症状是水样腹湾，或者Ｗ在腹泻的同时伴有柩吐。呕吐多发生于进食后。猪的年龄越小，出现的发病症状就越严３￣４ｄ５０％－重。１周龄内新生仔猪发生腹泻后内会严重脱水而死亡，死亡率可达１００％。断奶猪或母猪经常表现为厌食、精神不振、伴有持续约１周的腹泻，而发病猪愈后会生长？。１％％１发育不良育肥猪在感染后都发生腹泻，死亡率３，周后康复；成年猪发病症状￣３４ｄ后轻，大部分仅表现喔灶，重者水样腹泻，发病即可橡复正常。病死猪可见小肠扩张，内有黄色液体，肠系膜充血，淋巴结水肋，小肠绒毛缩短。组织学变化，见空肠肠绒２５６２’毛显著萎缩。ＴＧＥＶ发病仔猪的典型临床是突然呕吐，然后急剧的水样腹泻，腹湾物呈黄、淡绿或重急剧下降乱￣白色。发病猪脱水殖＾，进食减少、消瘦，在２５４，体，精神萎靡，被毛粗一－％日内死亡，周龄Ｗ下的哺郛巧猪死亡率为５０１００，随着日龄的増加死亡率降低：而。。发病后自愈的仔猪生长发育受阻，体重增重缓慢，有的甚至变成僵猪病死猪脱水明显主要病变在胃和小肠。病猪的胃内充满凝乳块，胃底粘膜充血或出血，小肠肠壁变薄，含０有气泡和凝乳块，充满黄绿色或白色液体。－－、１５日龄猪接种ＧＡＲＶ的发病最严重，潜伏期１２２４ｈ，感染后的猪厌食不安，偶尔－呈水样且含有絮状物呕吐。严重者ｌ４ｈ后。发生大量腹泻，粪便颜色为黄色到白色，，并－５天－－腹泻可持续３，而后７１４天粪便逐渐恢复正常。病猪发生脱水，在腹泻发生２５天后－。有的猪会出现死亡，死亡率可达５０％１００％随日龄的增加死亡率降低，１４日龄Ｗ上的猪很少出现死亡。剖检可见胃壁弛缓，里面含有凝乱块和乳汁，小肠粘膜弥漫性或条状出血，２５肠壁变薄，肠粘膜易脱落。组织学检查发现小肠绒毛缩短变平。１．４诊断和防治＝对Ｈ种病毒的诊断不能仅仅依靠临床的观察和病理组织学，因为种病毒引起的腹湾。症状无法直接区分除了通过发病特点对病因做巧步判断外，目前已有许多实验室方法用－于检测Ｈ种病毒，包括ＲＴＰＣ民技术，血清学诊断，电子显微镜法、免疫组化法、ＥＬＩＳＡ、分离病毒レ、聚丙締敌胺凝胶电泳、反向间接血凝试验、核酸探针、乳汁凝集反应义及巧光５３抗体法检查病毒抗原等。 杨振：江苏地区猪赠病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析＾－ＰＣ民方法灵敏在上述检测方法中，民Ｔ、省时的，可直接对发病猪的粪便进行快速检一些年里－额！特异性高，操作简便，在过去的，对民ＴＰＣ民方法的１，敏感性和修改使该方法－－更加实用。基于该法建立起来的环介导等温扩増法（ＲＴＬＡＭＰ）比传统的ＲＴＰＣ民方法５３更为灵敏。电子显微镜法可１＾直接观察到病毒粒子的形态从及立体构型，可有效进行病原判断，但ＴＧＥＶ和ＰＥＤＶ是同属病毒无法对其形态进行区分，免疫电镜法则解决了运个问题。针对病原建立起来的ＥＬＩＳＡ方法不仅可Ｗ检测抗原还可Ｗ检测抗体，目前用一ＥＬＩＳＡ方法检测ＰＥＤＶ抗原抗体己经成为国际贸易指定的诊断方法之。市场上使用的检测试纸条也可Ｗ快速的对病原进行检测。目前针对Ｈ种病毒并无特效药，加强饲养管理是减少猪群发病的关键。在ＰＥＤＶ在欧洲刚爆发的时候，人们刻意的让怀孕母猪暴露在病死仔猪的脏器环境下刺激机体产生免一疫，定程度上延缓了爆发的速率，但该法引起了其它病原如ＰＲＲＳＶ和ＰＣＶ２的并发。一在国外，，些免疫因子可用于对腹泻病的治疗如抗ＰＥＤ乂的卵黄免疫球蛋白和接受免疫的牛初郭可Ｗ有效增强仔猪对病毒的抵抗力。利用Ｅｃｏ＂表达产生的能中和ＰＥＤＶ的小鼠单克隆单链抗体（ｓｃＦｖ）可阻止ＰＥＤＶ感染细胞，因此用此抗体可预防ＰＥＤＶ对动物５３体的感染。第二章猪略病毒１猪峰病毒猪晴病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ，ＰＫＶｓ）是小ＲＮＡ病毒科（Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）崎病毒属６３－ｋｏｂｕｖｉｒｕ。２００７ｒｃ：民的方法在腹泻猪（ｓ）的成员该病毒于年由匈牙利学者用ＲＴ群的粪便６４Ｍ６６６７６８６９中首先检测发现，随后在中国、日本、韩国、己西和荷兰、美国、捷克及泰７１国等国家被相继检测发现。猪腹泻病影响和危害我国养猪生产和养猪业发展，自２０１０年ｌ、，我国脱水、呕吐为特征的哺乳仔猪病毒性腹湾疫情ｔｉ来大部分省份爆发了Ｗ水样腹泻，发病率和死亡率高，给养猪业带来巨大经济损失，这其中病毒性腹泻疫情引起养猪业的普４６６５７２遍关注。２００８年，虞结梅等人在我国的猪群中首次发现了ＰＫＶｓ，随后在我国的河南、Ｍ７３７４７５河北、四川、湖北气上海、甘肃等地猪群中均捡测发现了该病毒的存在，鉴于其在猪群中的高感染率一，越来越多的证据表明该病毒与猪腹泻疫情有定的关联，这种潜在的。引起猪腹泻的新型病毒，引起了人们广泛的关注尽管目前尚不确定ＰＫＶｓ是否与当前的疫情有关，但鉴于其相对较高的阳性检测率，有必要对其在猪群中的感染情况进行相应的调 １６扬州大学硕主学位论文７６查。２０１４年在江苏地区也有ＰＫＶｓ发现的报道。本研究采集了２０１２至２０１４年间江苏省部分－，县域发生腹湾疫情的猪场仔猪粪便样品，通过ＲＴＰＣＲ方法对腹泻仔猪中ＰＫＶｓ进行检测一ＫＶ并进行序列测定与分析，Ｗ了解ＰＫＶｓ在江苏省部分县域的流行情况，进步丰富Ｐｓ流行病学调查的相关数据。１．１病原学特征１．１．１猪峭病毒的发现Ａ一爱知病毒８４６／８８株（ＮＣ００１９１８）于１９９１年由日本学者在个严重腹泻病人的粪便中７８７９检测发现随后该病毒在北非欧洲和南美国家被相继检测发现。２００３年，日本学者，Ｙａｍａｓｈｉｔａ等人用可能污染了牛粪便的Ｈｅｌａ细胞培养物感染Ｖｅｒｏ细胞，经传代发现Ｖｅｒｏ细胞产生了明显的ＣＰＥ，并在电镜下观察到了该病毒的形态（图５），进而确定分离到了牛嚼病８１６８２－１（７８８、、毒，命名为Ｕ株ＡＢ０８４）到目前为止，牛哨病毒在泰国匈牙利意大利８３—些国家被检测发现和韩国。而在我国，目前没有关于牛峭病毒分离的报道，对该病毒８４的研巧也只是针对部分基因片段的研究，但不能排除在我国牛群中无牛峭病毒的感染，尤其是其可能引起的并发症值得引起人们的重视。国園屬爾薩画Ａｖｅ－ｉｃｈｉｉａＬＨｓｔ油ｎＰＶｉ５０ｎｍ图４２％蜡鹤酸负染２分钟的爱知病毒、牛啼病毒和１型脊髓灰质炎病毒电镜图片（引自Ｙａｍａｓｈｉ化等，２００３）Ｆ－－ｉ４ＥｅｃｒｏｎｍｉｃｒｏｒａｏｆＡｉｃｈｉｖｒｕｓＵ１ａｉｎａｎｄＰＶ１ｎｅａｔｉｖｅｌａｎｅｄｗｉｈ２％ｇ．ｌｔｇｐｈｉｓｔｒｓｔｉｔ，ｇｙｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃａｃｉｄＨ７．２ｆｏｒ２ｍｉｎ．ｐ（ｐ）２００８年，匈牙利的Ｒｅｕｔｅｒ等人用针对杯状病毒Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ的特异性引物２８９／２９０对（）ｐｐ２００７－年从匈牙利东部的猪场采集的１５份１健康猪粪便样本进行ＲＴＰＣ民检测时发现了６一ＰＫＶｓ。条约１００他们检测时发现所有样品在琼脂糖凝胶电泳结果中都有１咕左右的杂条。６化－、３Ｄ带将其测序并与爱知病毒（Ａ８４贿卿牛崎病毒（Ｕ１株）的３Ｃ区域比较发现核昔酸 杨振：江苏地区猪略病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析１７一－７３－和氨基酸序列同源性分别为％７９％和６９％７０％。进而确定了该毒株属于略病毒属的个－－新发现种，命名为猎嚼病毒Ｓ１ＨＵＮ（ＥＵ７８７４５０），随后他们对该病毒的全基因组进行测序－－８２１０ｎｔ。２００９分析，确定Ｓ１ＨＵＮ的基因组全长为年，中国学者虞结梅等人在检测杯状病一８５ｂＡ８４６－毒的时候发现个Ｈｐ的杂条带，测序后发现与爱知病毒（／８８株巧日牛峭病毒（Ｕ１株）的３Ｄ区核酸同源性分别为７０％和７３％。与爱知病毒和牛畴病毒的ＶＰ０区核昔酸和氨基酸同６５６９％，源性分别为，７１％和６６％６９％，进而确定在中国首次发现了猪晴病毒，命名为－Ｙ－。、１ＣＨＩ（ＧＵ２９２％９）随后，猪哨病毒在日本韩国、巴西、荷兰、美国、捷克、泰国Ｗ８５及东非猪群中被相继检测发现，越来越引起人们的重视，但目前该病毒尚未被分离纯化。？＿ＵｎａＭ？－＜．Ｐａ－ｌｇａＥＶ１０３０ＳＸＧＡｅ？〇１＜ＦＪＯ０７ｉＴｉ）？Ｕｎ？ｓ？ｎ？．ｉ｛ｌＥＶ１０ＳＮ１２５｜Ａｆ４１４５７２）—Ｊｌ？ｓｖｅ１段，Ａ＂前Ｍ，Ｌｍｗｍｋ惟＇ＡＣ乂４２ｒｉＭｗｔＶ４２，７Ｓ０」ｒｗＡ｜ＰＶＰ￡々口Ｅ８ＶＩＪ＾＊Ｈ？８５ＶＢＥＶ－１ｖ＞ＧＳｇ７＜〇００２１４＜ｊ＊￣１、、ｒｉｎ■？ａｅ：ｉＢＥ－ｗｔ（Ｄ〇ｙｔ３ｍ＞，ＶＨ？ｔｉＩ巧Ｖ￣ＡＳ￡Ｖ￣Ａ，巧巧巧）Ｈ乂．，ＩＥＯＳＶＤ７０Ｊ６，Ｗ。脚。Ｊ－ｖｓｎ■Ｈｇ／ｅｃ＾＞ＨｃｙＩＩ＇Ｐ．ａｏｎｅＭＭｈｙＩＩ■＂Ｉ■■■＾Ｗｙ￣￣ｅ？ＦＥ８；气ｅＨＲＶ（ｐ｛＞７ＭＷｉ￣Ｗ４－ｔＲＳＭＯＳ｜ＨＲＶ．ＨＶ４，ｆＩ＂；■ｒｖ＾ＨＲＣＮＡＴＫ５１Ｅｒｒ２７？？ＶＸ（ｒｃ？—Ｖ■ＰＳＶ－１１３：ＡＦ４娩１３）Ｖ如ＳＳ－，ＳＶ２：．３６３（Ａ々８４ｎ？）．ＳｉｙｅｆａＭａｒＶ＇Ｔ－ｉ价ＯＡ—ｎＡＳ（Ａ＆＆Ｗ２巧」Ｉ？－〇，４？．？ＲＳＷ？ＰＶ９Ｃ３化４，！Ｐ防２７４）〕巧护Ｉ￣ｋ－＊Ｉ－ＨｉＪ８？ＰＶ３ｎ．Ｃ５Ｆ＜ＯＳ５＊＾Ｕ）－ｊ｜，ｂ■ｉｉｖｍｉｔｔＤＷｏａ，Ｊ‘ｋｇａ，Ｒ＿３ＴＶｃ：＂ｉ府」广Ｉｒ＊－Ｏ？ｓｉＰ＇ＡｉＣｔ．ＳＳＳ４０４Ｂｆｔ１６Ａ（Ｓ）—？－化心階ＭＷ！ＬＪｈｉｒｗ＂■ｗｗＷ，？Ｓ？｛ＰＶ－２ＭＭ９Ｆ（ＨＱ６＊Ｓ３＊２＞■圓Ｉ？ＢＰｖ－：ＳＫ怖（ＨＯ＾ＳＷ＞Ｗ＿＞．￣－■Ｉ｜（７＼－１７８９／．４口５口巧）Ｚ山ＷｒｉＴ？ｍ？Ｖ—．８ＲＡ，５口，Ｌ■百－ＢＡＶ２Ｋ，一￣－，ｋｈｔｎｉｒ—；？１ＦＷＯｖ。ｇｙ｜＊。。３８２８｜Ａｐｆｖｓｐ＾图５小ＲＮＡ病毒科病毒ＰＩ衣壳蛋白」系统进化树。红框表示猪啼病毒，苗：ｒｒＬＰ：红点表示新发现的小ＲＮＡ病毒。溫进；ｙ引？二二尸（Ｉ？－ｉｕｆＢａ５Ｗｔ＾ｌＩＦＪＳ５５０Ｓ）ＩＩ＂＂■？Ｋ〇ｓｖ々２２防扩Ｍ３８班ｎＴＨ：Ｃｏｗｉｒａ＊Ａ尸１、ＩＨ？ｃ＂１＇，Ｗ＼＼ＨＣＳ、ＣＷ３８Ｋ？＞白ＩＬ１Ｖ，Ｚｊｉ１＊＂＂＊ｉ＇！一３巧巧巧）＿乂Ｆｉｇ．５Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆ化ｅＰＩ－Ｔ淵；，。３－本７。＿Ｉ—曲＂ｖｒ■ｃａｓ．Ｔｉｐｉｄｓｏｆｉｃｏｍａｉｕｓｅｓｈｅｉｐ’，，参ｗｅｉｌ．＇ｓ站ｕＨＷＳ（ＧＱ巧扣」？１１１，１１＊￣ｈｓｅｃｉｈｌｉｈｔｅｄｉｎｉｉｐｉｅｓｒｏｏｓｅｄＩＳａｐｐｇｇ心ｍ伽－Ｋｄｍ如ｒ曲ｂｏｘ．民ｅｄｄｏｔｓｍｏｓｔｌｙｉｎｄｉｃａｔｅＣ紙漂］咖ＩＡ￡Ｖ．１ＣｓｆｅｗｆｃｔＡＪＳＪＳｉｎｉ〕ＴＷｔｗｏｖＡｔ＂？－Ｉ－化？？ＩＢＡＶＭＭ１７５ｉＷ１＊７〇？）ａｌｏｖｔｍ＊＿＿＿Ｉ３ｐｎｅｗｃｏｍａｖ—揚ｉｉｒｕｓｅｓＬ－加ｐ＿ｊ＞卿＊：巧戸，此＇＊Ｊ？Ｐ－Ａｍｔａｍａｖｉｆｉ？ｒｗＡｎｗｍｗｌＶ！愤曲．。胁１４２６４０｝３￣－＊ＩｅＶＭＭｒ？ＥｔＰＳ〕ｅｅ￡ｐｃｏｎｕｖ？ｗ？ｒＩＬＪＩＨＰａＶ－１ＨａｔＴｔｅ！ｉ０２？７１？—■＿—ＡＷ々＂细１１■．的々。化ｆＳ？７？ａＩＬＶ１」￣■■日Ｈ＊ｖｃｗ巨巧Ｗ巧饼ｒ■｜＇■．＾．ＯＨＡＶＩ巧５巧２巧０２２６５４１）Ｊｔ础巧打化｝Ｌｉ｜、ＯＨ＊Ｖ￣ＳＷ々５５９７１０Ｏ欲側」１．１．２猪峭病毒的分类地位ｉｃｏｒａａｖｉｒｉｄａｅ）峭病毒属成员，小ＲＮＡ病毒科（ＰｃｏｍａｖｉｒｉｄａＰＫＶｓ是小ＲＮＡ病毒科（Ｐｉｅ）的病毒是微小、单股正链的ＲＮＡ病毒。根据国际病毒分类委员会（ＩＣＴＶ）２０１３年的报告（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｔｖｏｎＫｎｅ．ｏｒｇ／ｖｉｍｓＴａｘｏｎｏｍｖ．ａｓｐ），小ＲＮＡ病毒科包含２６个属：Ａｐｈ化ｏｖｉｒｕｓ，Ａｕａｍａｖｉｒｕｓ，Ａｖｉｈｅｐａｔｏｖｉｒｕｓ，Ａｖｉｓｉｖｉｒａｓ，Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ，Ｃｏｓａｖｉｒｕｓ，口ｉｃｉｐｉｖｉｍｓ，Ｇａｌｌｑｉｖｉｒｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ，Ｅｒｂｏｖｉｍｓ，Ｈｅｐａｔｏｖｉｍｓ，Ｈｕｉｍｉｖｉｍｓ，Ｋｏｂｕｖｉｒｕｓ，Ｍｅｇｒｉｖｉｒｕｓ，Ｍｉｓｃｈｉｖｉｍｓ，Ｍｏｓａｖｉｍｓ，Ｏｓｃｉｖｉｒｕｓ，Ｐａｓｉｖｉｒｕｓ，Ｐａｒｅｃｈｏｖｉｍｓ，Ｐａｓｓｅｒｉｖｉｒｕｓ，艮ｏｓａｖｉｍｓ，Ｓａｌｉｖｉｍｓ， １８扬州大学硕壬学位论文＿Ｓａｐｅｌｏｖｉｒｕｓ，Ｓｅｎｅｃａｖｉｒｕｓ，Ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ和Ｔｒｅｍｏｖｉｒｕｓ。１９９９年ＩＣＴＶ将爱知病毒和牛雌病毒一。归为小ＲＮＡ病毒科的个新的属，即哨病奉属２００８年，ＰＫＶｓ被首次检测发现，ＰＫＶｓ与其它峭病毒（爱知病毒和牛崎病毒）各自的：多聚蛋白（ｏｒｏｔｅｎ的基因同源性为ｌｙｐｉ）５６％和６４％Ｐ１衣壳５４．９％６３．１％２Ｃ基因ｐ；和；，，，〇６８／〇和７７％３Ｃ基因，Ｗ％和６３％犯基因，７０％和８１％这符合ＩＣＴＶ病毒分类的标准，并且根据小ＲＮＡ病毒科所有病毒的Ｐ１衣壳蛋白序列和３ＣＤ多肤序列进化树分析发现（图５，６），ＰＫＶｓ与牛崎病毒和爱知病毒处于较近的分支，因此２０１１年ＰＫＶｓ被归类于崎病毒属，并与爱知病毒（Ａｉｃｈｉｖｉｒｕｓ）、牛崎病毒（Ｂｏｖｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ）同属于赠病毒属。在ＩＣＴＶ上爱知病’＇毒，牛峭病毒和ＰＫＶｓ分别被命名为公兩Ｍｚｃ／ｈｗＶｍｓＣ。＿—？心ｎａｓａｉｔｗ－ｏａｇｖ，０３，巧必０７３巧广ｌＭｓＷｉｒｅＳ６６（Ｗ３？７６ＷｌｊａＶ１３１■■■站？ＵｒｖｔｓａｇｒＭ巨Ｖ．Ｎ１巧（ＡＦ４Ｗ３７３）１＊—ＩＩ巧ｖ々ＣＶ々３Ｎａ＞ｅｙｉｈ＆ｇ８３＞—．＇ＶＡＣＶ－ｊＩ—■■＞＾＼２Ｆｆｅ？ＷＯ〇ａ（ＡＶａ？１７６０）ｐ—Ｉ．ＩｉＶ－ＣＰＶａｎｘｗ１ＩＨＥＭＭｖ（Ｊ０２２８＂Ｉ－ＩＨＥＶＯＥＶＣＴＯ成巧订ＷＤ００８２（？＿＂／？＇＇－主？＊＂＂４ＳＥＶ－Ｓ巨４Ｖ－５＊ＢＡＦ３Ｊ０７５Ａ乂，Ｓ４１７１ＪＶＫ（巧ＩＰＥＶ￣ａＰＥＶ￣ｅＬＫＧｒｔ１｛Ｕ７ＭＦ３６３Ｓ３＞Ａ４＊￣Ｉ＊－ＶＧＨ■■■？Ｂ￡ＶＢ￡ＶＳｔｆ７田ＯＷＷ＿＿Ｉ１（＇眼？０８ＥＶ．巧１（ＯＯＤ９２７７０），，？巨，８（０Ｏ４Ｔ３４於）—’ＩＩＡ－Ｆ５１、保、ＭＲＶＡ１２０６０＜Ｗ１＂一■＊１．￣ＣＩＨＲＶＷｖ々１Ｗ巧＞１正巧７７２Ｔ９＞＿■＊？．？ｉＢＯｉｖＶ＊ＩＰｑＰＡ任肝２７１５，＂］？ＢＣｒａｉｖｎ＊Ｓ／ＵＡ＊１雜ＰｒｓｏｏｐｙＢ０３１，Ｒ７２７１４４）ｐ＿＿＾」｜■巧乂－１ＴＷＣＣＡ｛Ａ々ｅ３０３３；文。＊＇从々＂Ｉ］７ＰＳＶ－Ｊ１Ｖ１３（ＡＦ４０＆Ｓ１３）．１１，．如，如＊。＂，ｉ－－八＾Ｓ於，ＳＶ２２Ｍ３ＷＯＭ７议）」ｐ，？８ａｔＰＶ－３ＴＶＣ５ＦＷ０５９ＳＵＳＨＬ）￣￣｜ｂ＂ｉｅｏｍａｖｉｒｕ：３Ｉ？Ｂａ．ｐｔＰＶ３ＴＶＣ２１ＦＩＭ０５Ｋ３４５１」ＩＩ？—Ｌ—Ｊ８－Ｃ＆５９５３尸？ＰＶ１Ｎ１ＭＨＱ４０）Ｌｃ’ＢＭＰｖ－？ｓＫ＂＂ｉｗ５Ｗ３！」６Ｄ多图小民ＮＡ病毒＾科病毒３ＣＡＥ－ｎＡｗｏｓＶ１Ｃ＊＃＞ＣＪ２Ｍ＜７３＞］＂ｒｆｒｗＩ［＇＇１■—■＂■Ｈ？ｖ．，ＨｈＷ＂（ＭＷ７０７＞ＪＢｅａｗｉｒｗ？ｐｍ－ｗ一，、产—Ｉ－ｉ，ｉｌ＂ｔｉ／Ｉ興□Ａ＾？？ｎ＾？ｖ…ｗＬ’ａＷ（ｓｌｐｉｃ〇？＞ＴＭｃ肤蛋白系统进化树。红：框表不三二：瓦＾貫款Ｉ兰原２Ｔ岩凯猪蜡病毒，红点表示新发现的－Ｉ－０Ｍｔｖ１６７１２ＡＰ３２７９２０（）－：：：Ｉ二：》—？？？？冰ＲＮＡ病毒。引自ＣＴＶ，２０１１ｐ（）做．；．：；口為編品ｉｈｌｅｎｅｉ化ｔｈＦｇ．６Ｐｏｔｃｅｏｆｅｙｇ—Ｃ：：Ｐ－ＳｒｆｅｉｊＬＵｏｌｔｄｅｓ０１ＩｐｙｐｐＩ￣ｉｃｏ饥ａｖｉｒｕ％ｓｈｅｓｅｃｉｅｓ＾諸ｙ；ｐ．ＴｐＬ？１Ｖ３Ｈ？Ｔ＜２—．‘＊ｉｖ，－Ｍ巧ｗ帕岭的《拠＂ｉ。］ｐｒｏｐｏ化ｄｉｓｈｉｇｈｌｉｇｈ化ｄｉｎａｒｅｄ￣—，足巧口ＵＸ巧ＢＶ．１Ｐ９６８７１）Ｉ—＇１Ｃ片？＊Ｏ？Ｗ＞Ｔｆ【、－，：ＩＬｇＲＳ，ＰｊＶ７６ｆＡＦＷ１Ｗ３，？＊」１ｔ＊—…－１＇３７泌…’１呼．ｔｌｄａｔｅ．＾三！Ｌ＂…ｂｏｘ民ｅｄｄｏｓｍｏｓｔｙｉｎｉｃＢＲＳＶ－１ＥＣ１１＜ＥＵ２３６Ｓａ４＞邮？？，．＇￣也＿Ｉ—ｒｎｅｗｃｏｍａｖｉ．ｎ＾ｓ＾ｖ：２ＸＴｉｒｕｓｅｓＰｊｐＩｉＥＭＶ－１Ｐ巨ＲＶ（ＤＣｇＴ２￡７ａ＞」ｅＭ？：Ｖ－ｌＲ＜Ｍ８＞８ｇ１，—Ｉ）ｎ一…—。伽／＂，■Ｃ＾＾＾ｖ，ＴｖｔｇＱＯｖａ細值ａ」ｆ－－ＩＩＳＷ１ＯＷＯＯｌ（００６４１２５７）］Ｊ＇ＭＷＣｉ如＂ｔ？—，ｙ＇ＨＣｏＳＶＡｉ＞ｔ巧（ＦＪ４说脚）＞ｏ＂ＬＨＣ５ＶＡ２６３４４＜Ｒ？３？（０ＷＩ■■＂，．ＬＩ？ＨＣ〇ＳＶ－ｅｉ２２６３ｌＦＪ４Ｓ？０７ｉＣＯＷｉｆＵ＊＇＇／Ｈｉ？ＨＣ０Ｓ－Ｏ１ＳＯＯ？ｒＦ．Ｍ３８ＶＯＳ｝－ａＥＩ？＜ＨＣＳＹＥ１ＡｌＳａ＂出８，向巧ＳＯ证，■－—？ｒｔ－＿Ｔｔ＊ＰＶｌ〕ｔＭｉｅＵｅｉｅｏｒｎａｖｉｒａｉｃＯｐ１１３．．猪峭病毒的基因结构一ＰＫＶｓＲＮＡ－同其它嚼病毒属成员样，８．２Ｓ．４此，，是单股正链病毒病毒基因组全长其’－－－－－ｄ全基因组结构排列顺序为ＶＰ５ＵＴＲＬ蛋白结构蛋白非结构蛋白斗ＵＴ民Ａ）ｔａｉｌ。其ｇｐｙ（中０ＲＦ编码１个多聚蛋白，经过酶解，产生１个前导蛋白Ｌ（Ｌｅａｄｅｒ），３种结构蛋白；ＶＰ０、ＶＰ３和ＶＰ１和７种非结构蛋白：２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ和３Ｄ（图８）。根据生物信息学分析预测的峭病毒的多聚蛋白裂解位点位于谷氨酸（Ｑ）和多数的氨基己酸（Ｇ）、丙氨酸 杨扳：江苏地区猪崎病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析（Ａ）或丝氨酸（Ｓ），部分为组氨酸（Ｈ）、半脱氨酸（Ｃ）或苏氨酸（Ｔ），这与其它小ＲＮＡ病毒的蛋白质裂解位点相似。与晦病毒属病毒不同的是，其它微ＲＮＡ病毒如马鼻病口蹄４毒、肝炎病毒的基因组缺少编码前导蛋白的基因，疫病毒基因组具有编码个结构蛋８６－白的（ＶＰ１ＶＰ４）。————，，琳节巧坂忠５；Ａ１３（）ｎ２ＡＶＭ編．…麵‘—田１Ｗ川誦Ｉ酵…１ＷＩＭ－１剛１ｎｉｎｗ？－？ｗｗｍｉ—■ＷＭＭ胃誦幽ＭＩＲＷ麵賴爾４１帽■■■ＩＩ—ＷＨＩＷＩ－Ｉ？１川ＩＩＩＩＩＩ断￥皆ｙｃ言ｙｒａｉｐｒｏｔｅｉｎｓＮｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｒｏ從ｍｓ图７小ＲＮＡ病毒科病毒基因组结构示蠢图ａａｒｅｌ，２０１２）（引自Ｔｐｐ尊ｈ＇Ｆｉ．７Ｓｃｅｍａｔｉｃｒｅｉｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｉｃｏｍａｖｉｒｕｓｅｎｏｍｅｏｒａｎｉｚａｔｉｏｎｇｐｐｇｇ＇＇一’＇＇嘴病毒基因沮５端＾共价形式连接个病毒蛋白蛋白＾？３（／相化〇始１／口），在多，￡数动植物病毒中都存在。ＶＰｇ在病毒核定位和稳定病毒基因组结构等方面具有重要功能，在病毒入侵宿主过程中，，与病毒基因复制的起始有关键的功能其因酶解形式体现不同的＂，，’ｎ比Ａ－功能。ＰＫＶｓ的５ＵＴＲ全长５７６ｔ，ｉｃｈｉｖｉｍｓ（７４４Ｕ１（８０８ｎｔ）的５ＵＴＲ短在其５邮和，ＵＴ民二级结构前１０８个核昔酸与其它崎病毒非常相似，与爱知病毒的同源性可达到８６％，该区域形成的茎环结构域（Ｓ＾Ａ、８心：６和８以（：）在嚼病毒之间有很高的相似性，与病毒粒８６’’子形成和ＲＮＡ复制有关。５ＵＴＲｓ的３，可能是晴病毒属成员特有的结构在端有内部核糖体进入位点（ｉｎｔｅｒｎａｌｒｉｂｏｓｏｍａｌｅｎｔｒｙｓｉｔｅｓ，ＩＲＥＳＩＶ），该位点可发现与猪提留申病毒（ｐｏｒｃｉｎｅ化ｓｄｉｏｖｉｍｓ和Ｉ型鸭肝炎病毒（Ｄｕｃｋｈｅａｔ扣ｓｖｉｍｓｌ）具有较多的通用元件并具有较高的）ｐ８６一基因同源性，但爱知病毒和牛峭病毒则没有。Ｌ蛋白是编码区基因编码的第个蛋白质，－Ａ由个氨基酸组成，比Ｕ巧日８４６／８８各长８个和２５个氨基酸，在峭病毒属成员中Ｌ蛋白同８８源性最低。峭病毒Ｐ１多聚体蛋白基因编码病毒的结构蛋白ＶＰ０、ＶＰ３，目前功能尚不明确和ＶＰ１，峭病毒与其它小ＲＮＡ病毒的差别之处在于其缺少ＶＰ０切割位点。有研巧表明，ＶＰ１基因是嗚病毒基因组中最具可变性的区域，编码的ＶＰ１蛋白是衣壳蛋白中暴露最多的免疫显性蛋ＲＮＡ病毒科其他病毒一，ＶＰ１基白，同小样因编码的蛋白可引起宿主机体产生免疫６８９Ａ病’一。Ａ蛋白有反应，也是小ＲＮ２，因此是崎病毒的抗原位点毒分属的重要依据个保一守的结构ｏ－／（Ｍｔｉｆ），这个结构由ＨｂｏｘＮＣ蛋白巧ＷＡＬ和ＮＣＸＨＦＶ）Ｗ及个跨膜结构－ｒｅｖ２Ｂ域组成，是调控病毒复制和细胞增殖的细胞蛋白（Ｈｌ０７）家族所特有。ＰＫＶｓ的基因８６全长５８５ｎｔ，编码１９５个氨基酸（ａａ），比爱知病毒和牛赠病毒长，目前其蛋白功能不清楚。但是有研究报道在ＰＫＶｓ不同毒株的２Ｂ蛋白会有３０个氨基酸的缺失，这个缺失与ＰＫＶｓ的致一一病性是否有关有待进步的研究。２Ｃ区是Ｈ种峰病毒最保守的区域，在２Ｃ区发现个保守 Ｍ扬州大学硕壬学位论文的氨基酸元件ＧＸＸＧＸＧＫＴ（ＧＰＰＧＴＧＫＳ），该元件存在于小民ＮＡ病毒解旋酶的核昔酸结合域。３Ａ和犯基因编码的蛋白分别是９０和３４个氨基酸，其中３Ｂ和ＶＰｇ的氨基酸序列相同，由ＶＰ在病毒基因复制的起始阶段起关键作用一于ｇ，因此ＰＫＶｓ的３Ｂ蛋白的功能有待进步的研究－Ａｃｒｕｓ３Ｄ。猪晴病毒的犯蛋白比Ｕ１和ｉｈｉｖｉ的长。蛋白在病毒增殖的动物机体内和感Ｗ－染的细胞培养液中发现的种非结构性的病毒特异性蛋白，被称为病毒感染相关蛋白。３Ｄ区中含有ＲＮＡ聚合酶中的Ｈ个结构保守的氨基酸元件ＫＤＥＬＲ、ＹＧＤＤ和及ＦＬＫＲ。Ｈ’’８６－－种崎病毒的３ＵＴ民区基因同源性较低，推测的３ＵＴ民由Ｈ个ｄｓ发卡茎组成。２猪峭病毒的流行病学自２００８年ＰＫＶｓ发现来，该病毒在多个国家的猪群中被检测发现，根据多个国家的研Ｔ－ＰＣ民检究结果表明，无论是在临床上无腹泻症状的猪群还是在腹泻的猪群中，经Ｒ测，ＰＫＶｓ的感染率都很高ＰＫＶ碰全世？，界猪群中的流行率从１６．７％９９．０％分布。在匈牙利，一２００７某健康猪群的粪便样品中和２００８，检测到的ＰＫＶｓ阳性率分别为６５％（３９／６０）和９１５３．３％３２／６０。在中国ＰＫＶｓ于２００８年从小于１，（），巧的健康猪群中被检测发现虞结梅等人从３２２份临床健康的猪粪便中检测到９７份ＰＫＶｓ阳性病料（３０．１２％），随后从１１６份腹泻猪粪６５便中又检测到４５份ＰＫＶｓ阳性病料，阳性率为３８．８％。在日本，２０１０年健康猪群中的ＰＫＶｓ６６阳性率为４５．４％。巧／２９３）；韩国的研究学者发现２０１０年韩国本地健康猪群中ＰＫＶｓ阳性率为１９．３％１６／８３，而腹泻猪群中的感染率为８４．５％７１／８４２００９Ｖｓ（）（严；年泰国腹辑猪群中的ＰＫ＂感染率达到９９．０％巧７／９８。２０１２年，美国健康猪群和腹辑猪群中的ＰＫＶｓ感染率２１．７％和）９３８５２１．９％；２０１３年，检测的非洲东部猪群中的ＰＫＶｓ感染率为１３．１％（３３／２５１）。在这些数据说明ＰＫＶｓ在多个国家的腹泻猪群和临床健康猪群中都普遍存在。ＰＫＶｓ不仅存在于感染猪群的粪便中，在血清中也能检测到ＰＫＶｓ，对己西猪群中的哺乳仔猪、保育猪和生产母猪粪便样品进斤了ＰＫＶｓ检测，结果阳性率为５３％６１／１１５），阳性（感染猪主要是仔猪；同时，对己西不同日龄（３ｄ、２１ｄ、３６ｄ、６０ｄ、７５ｄ、］８０巧的猪采集６８３０份血清进行ＰＫＶｓ检测，结果检出２３份阳性，总阳性率达７６．７％（２３／３０），阳性感染猪分，布在不同年龄段的不同类型的猪群中，但所有猪群中峭病毒感染率最高的是哺郭仔猪说明幼龄动物对ＰＫＶｓ易感，这可能与幼龄动物的免疫力差有关，另外，感染后的母猪会通过Ｍ奶水，血液，气溶胶，尿液。韩国的学者研究发现，无论猪，唾液等将病毒传染给仔猪６７群临床上表现正常或表现腹泻，ＰＫＶｓ在３周龄Ｗ下仔猪群感染率最高，ＰＫＶｓ感染率会随一７９７９着猪年龄的増加而降低，这可能也是幼龄动物ＰＫＶｓ阳性率高的原因之。日本、美国 杨振：江苏地区猪啼病毒感染流行病学调查和全基因纽遗传进化分析２１的研究人员做了相同的研究，研究结果共同证实了ＰＫＶｓ在不同品种、不同年龄的猪群中都普遍存在。研究人员还发现，ＰＫＶｓ不会在猪体内持续存在，但感染后的猪群会再次感染同一ＰＫＶ。株猪峭病毒，说明动物机体内产生的针对ｓ的免疫力不是持久存在的大部分ＰＫＶｓ主要是通过粪便检测到的，但目前无法确定动物的肠道是否就是ＰＫＶｓ复制的主要器官，ＰＫＶ一６８ｓ是否在其它部位复制后通过血液循环转移到肠道排出需要进步确认。一９４另外，韩国的学者发现他们检测到的株牛崎病毒ＣＰＦ４２９３（ＨＱ２３４９１０）与２００９年００９－从日本检测到的ＰＫＶｓ基因同源性较近，而该株ＰＫＶｓ（Ｈ０２３／２／ＪＰ）与牛赠病毒（Ｕ１）６６一同源性很相近。这个结果提出了个问题，就是在自然界中峭病毒是否会在猪牛之间进９５９６９７９８行种间。近年来，在猫，狗、骗蜡Ｗ及山羊的体内也有关于嚼病毒的报道，这些峭病毒与已经确定的崎病毒属成员基因同源性相差较大，这些病毒是新发现的病毒还是动物一一体内本身直存在的种病毒，亦或是通过不同物种中间传播变异而来的病毒目前不得而’’细。＇在中国多个地区都有ＰＫＶｓ检测的报道。Ｗａｎｇ等人在中国上海Ｈ个猪场采集小于４２＂日龄和大于１２周龄的猪群肛拭子样品，ＰＫＶｓ检出率为４９．３％和１９．５％姬国彪等采集河南；地区８４个猪场１５０份猪腹泻样品和２３份无症状猪的粪便样品，对ＰＫＶｓ的感染情况进行监测，结果显示检测样品ＰＫＶｓ总阳性率为８２．１％（１４２／１７３），猪场ＰＫＶｓ总阳性率为８２．１％（６９／８４）１Ｗ犯基因的１１、２０１２２７个省１２６４４８；张莎等对２０年期间来自市个猪场的病料共计份进行了检测，ｌｉＵ周查ＰＫＶｓ的流行情况。结果显示在４４８份病料中，共有１１２份为ＰＫＶｓ阳性，病料阳性率为２５．０％，而在检测的１２６个猪场中，共有５１个猪场显示ＰＫＶｓ阳性，猪场阳性率为ｉｍ４０．４８％ｈｅｎ等人对从四川地区采集的１份儉样本检测发现ＰＫＶｓ的感染率为Ｗ％。Ｃ７３１０２Ｗ７／１６３，、等地也有ＰＫＶｓ检测发现的报道，这些数据说明ＰＫＶｓ巧），另外在福建广西在中国多个地区己经广泛存在，这种广泛的流行率上是否与发生在中国多个地区猪腹泻疫情有关一，需要进步的监测。３猪峰病毒的检测ＰＫＶｓ目前没有成功分离的报道ｓ－ＰＣＲ方，对ＰＫＶ的实验室检测最常使用的方法是ＲＴ法。日本学者通过爱知病毒单克隆抗体建立的ＥＬＩＳＡ的方法可Ｗ在粪便中灵敏的检测出ＡｉＭｉＶ。，此方法病毒分离为敏感，但市场没有商业化检测试剂盒面市另外，研巧者通过泌Ｓ－ＰＡＧＥＥＬＩＡ检测方法等得到了牛峭病毒部分蛋白，建立了Ｓ，也为峭病毒的研究提供一ＷｉＭｉｗ了进步的依据。ＸｉｎｑｉｏｎｇＬｉ和ＣｈａｎｇｌｏｎｇＬｉ分别各自建立了针对ＰＫＶｓ的３Ｄ区基因 當扬州大学硕＋学位论文－ＬＡＭＰ检测方法的ＲＴ，有较高的检测灵敏度。田野２０１３年利用表达的ＰＪＣＶｓ的ＶＰ１蛋白建立了检测感染猪群血清中ＰＫＶ航体的ＥＬ投Ａ方法为检测血清中ＰＫＶｓ感染状况提供了一种新的思路。４猪嘴病巧的分离－Ｃ－日本学者已经报道爱知病毒能引起ＢＳ１和Ｖｅｒｏ细胞产生病变，但是在人宫颈癌细胞（Ｈｅｌａｃｅｌｌ）、人恶性巧胎横纹肌瘤细胞（ＲＤｃｅｌｌ）、人胚肺细胞（ＨＥＬｃ姐）则不能产７７生细胞病变，接种乳鼠，无致病作用，牛峭病毒也能在Ｖｅｒｏ细胞上生长并产生细胞病变Ｗ效应（Ｃ祀）。但迄今为止，尚未见ＰＫＶｓ体外培养成功的例子。Ｙｕ等人使用ＲＤ细胞接ＰＫＶｓ阳ＣＰＥ。ＰＫＶｓ适应细胞限种性病料，经过连续三代培养后，没有出现找不到合适的６５一制了。ＰＫＶｓ的进步研究５猪峭病毒与宿主的关系一ｅｕｅ爱知病毒是目前确定的唯能引起人类急性胃肠炎的晴病毒属病毒。Ｒｔｒ等人报道一，例被诊断为感染爱知病毒的儿童除了有腹辑症状，还伴随有呼吸道症状和化旅性结膜炎。他们认为爱知病毒感染后可能是隐性感染，不表现出相应症状；或者爱知病毒感染１Ｍ一一可能有定的临床症状表现，但是些除胃肠炎之外的并发症状。由于该病毒在人体中一－存在并可能引起人的发病，具有定的公共卫生学意义。牛峭病毒经ＲＴＰＣＲ检测发现其在牛消化道是普遍存在的，但牛晴病毒致病作用目前并不清楚。ＰＫＶｓ能否真的引起猪腹泻目前无法确定，因为并没有分离到该病毒，没有动物实验确一定ＰＫＶｓ能否单独引起猪的腹湾。另个情况是临床健康的猪群中ＰＫＶｓ的感染率也很高另外，在腹辑猪体内检测到ＰＫＶｓ的同化通常会检测到ＰＥＤＶ，ＴＧＥＶ、ＲＶＷ及左．Ｃ０／傳能多１Ｗ种能引起猪腹湾的病原或潜在的致病性病原的存在。韩国学者对采集的１６７份不同年龄７１ｓ阶段的猪粪便检测发现，份ＰＫＶ阳性病料中６８份检测到有多种其它病原的漏合感染，包括ＰＥＤＶ，ＴＧＥＶ，ＧＡＲＶ，ＰＳａＶ，ＰＴｏＶ，Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｐ．，９２Ｅ．ｃｏｌｉ（ＬＴ，ＳＴａ＾ＳＴｂ），其中与ＧＡＲＶ混合感染最为普遍；东非的学者发现ＰＫＶｓ能与星状Ｍ病毒（ａｓｔｒｏｖｉｒａｓｅｓ）发生混合感染。这些数据说明因为动物体内病原菌的多样性，很难确一定ＰＫＶｓ与宿主腹泻的关系。但通过统计学研巧发现，ＰＫＶｓ与猪腹泻存在定的相关性。一６８Ｂ＝ａｒｒ人发现，在己西检测到的ＰＫＶｓ与猪腹泻有定的相关性（０．０００２）国的ｙ等ｐ；韩９２Ｐａｒｋ等人发现ＰＫＶｓ与猪的腹泻有直接的关系；Ｃｈｅｎ等对四川地区的猪群ＰＫＶｓ检测发现－５＂ＰＫＶ与猪腹泻有显著的关系＝＝Ｘｓ感染１７．１％ｐ３．５１〇ｎＶｅｒｍａ研巧发现在美国猪群Ｗ） 杨振：江苏地区猪啼病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析２３ＰＫＶｓ的感染率相当（２１．．９％和２１７％）中腹泻猪和临床健康，他们认为在猪体内可能存在两种类型的ＰＫＶｓ：致病性的和非致病性的，相比于临床健康猪群，病毒在腹湾猪群中存在一较多；ＰＫＶｓ或许只是种内生的常住性病毒（ｐａｓｓｅｎｇｅｒｖｉｒｕｓ）对宿主的致病性并没有关系；ＰＫＶｓ可能会导致猪的腹泻，前提是在其它致病性病原如猪轮状病毒（民ｏｔａｖｉｍｓ）或者９３一ＰＫＶ其它中病原存在的情况下才会表现出致病性。总么，需要进步研究ｓ的发病机制和一传播途径来进步确定其病原的角色，，目前越来越多的文献报道证实了猪峭病毒与猪的腹泻有直接的关系，随着对晴病毒研究的逐渐深入，该病毒在致猪腹湾病原中的地位将最终被确定。参考文献１ＪｏａｃｈｉｍＡ．足ＤａｕｓｃｈｉｅｓＡ．Ｅ打ｄｏａｒａｓｉ化Ｓｉ打ｓｗｉｎｅｉ打ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｅｒｏｕｓａｎ，ｇ，［ｐｇｇｐｄｍａｎａｇｅｍｅ打ｔｓｙ巧ｅｍｓ］．ＢｅｒｌｉｎｅｒｉｍｄＭｕｎｃｈｅｎｅｒｔｉｅｒａｒｚｔｌｉｃｈｅＷｏｃｈｅ打ｓｃｈｒｉｆｔ１１３，－１２９１３３２０００．（）２Ｍｏｘｌｅ民．Ａ－＆ＤｕｈａｍｅｌＧ．Ｅ．Ｃｏｍａｒａｔｉｖｅａｔｈｏｌｏｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｔｅｒｉｃｄｉｓｅｙ，，ｐｐｇｙＭｅｄＢ－ａｓｅｓｏｆｓｗｉｎｅｄｖＥｘｉｏｌ４８３１０１１９９９．．Ａ７３ｐ，（）ａｏｅｎｅ＊３ＳａｉｆＬ．Ｊ．Ｃｏｍａｒａｔｉｖｅｔｈｓｉｓｏｆｅｎｔｅｒｉｃｖｉｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏ打ｓｏｆｓｗｉｎｅ．Ａｄｖ巨ｘ，ｐｐｇｐｏ－％ｌ４７３４７１９９９ＭｅｄＢｉ．，（）４ＣｈｅｎｇＷＸ，Ｌ．Ｊ．，ＨｕａｎｇＣＰ，ＹａｏＤＰ，ＬｉｕＮ，ＣｕｉＳＸ，ＪｉｎＹ，足ＺＪ，Ｄ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ－ｉｏｎａｎｄ打ｅａｒｌｙｆｕｌｌｌｅｎｔｈｅｎｏｍｅｃｈａｒａｃ１；ｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌｏｒｃｉｎｅｂｏｃａｖｉｍｓｅｓ．ｇｇｐＰＬｏＳＯｎｅ５：ｅｌ３５８３（２０１０）．５ＭａｎｔｅｕｆｅｌＪ．足ＴｍｅｎＵ．Ａｎｉｍａｌｂｏｃａｖｉｒｕｓｅｓ：ａｂｒｉｅｆｒｅｖｉｅｗ．Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏ５１，ｙ，ｇｙ，３２８－３３４ｄｏ１ｉ：１０．１５９／０００１７３７３４２００８．，（）ｒｏｒｏｓｖｉｃｓｓｅｓ－ａｃｏｍ６民ｅｕ把Ｇ：ｒｅｈｅｎｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｅ．ＢＡ．衣ＰａｎｋｏＰ．Ｋｏｂｕｖｉｍ．艮，ｐ，，，－ｖｉｅｗｉ打ｍｅｄｉｃａｌｖｉｒｏｌｏ２１３２４１ｄｏｉ．ｍｖｓ：１０１００２／ｒ．６７７２０１１．ｇｙ，，（）Ｓｏ打Ｄａ－７ｅｌ．ｉｌｅｘｒｅｖｅｒｓｅｒａｎｓｃｒｉｉｏｎＰＣＲｆｏｒｒａｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｅｔｅｃｔ！ｇ，Ｓ．ｔＭｕｌｔｔｔ，ｐｐｐｏ打ｏｆｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓａｎｄｏｒｃｉｐ，ｐｇ，ｐｎｅｇｒｏｕｐ八ｒｏｔａｖｉｒｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｅ１；ｅｒｉｎａｒｙｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ：ｏｆｆｉｃｉａｌｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏ打ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｉａｎｓ，Ｉｎｃ１８２７８－２８１２００６．，（）８Ｃａｏ，Ｗ．ｅｔａｌ．Ｃｏｍｐｌｅｘｇｅ打ｏｍｅｓｅｑｕｅ打ｃｅｏｆｔｈｅｐｏｒｃｉ打ｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｖａｒｉａ打ｔＣＨ／Ｈ－１－ＮＸＸ４／２０１２．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏ８６１９４７ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．０２１３７１２２０１．ｇｙ，，（巧９Ｐｅｎｓａｅｒｔ，Ｍ．Ｂ．，Ｄｅｂｏｕｃｋ，Ｐ．底民ｅｙｎｏｌｄｓ，Ｄ．Ｊ．Ａｎｉｍｍｉｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｎｄｉｍｍｉｍｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｔｕｄｏｎｔｈｅａｎｔｉｅｎｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｂｅｔｗｅｅ打化ｅｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｙｇｐ－－ｌｉｋｅａｅ打ｔＣＶ７７７，ａｎｄｓｅｖｅｒａｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ１．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ６８４５５２ｇ，ｇｙ，（９８１．）１０Ｂｒｉｄ呂ｅｎＡ．ＤｕａｒｔｅＭ．ＴｏｂｌｅｒＫ．ＬａｕｄｅＨ．＆ＡｃｋｅｒｍａｎｎＭ．Ｓｅｕｅｎｃｅｄｅｔｅｒ，，，，，，，，ｑｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｉｉｃｌｅｏｃａｓｉｄｒｏ化ｉｎｇｅｎｅｏｆｔｈｅｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｏｅａｖｉｒｕｓｐｐｐｐｃｏｎｆｉｒｍｓｔｈａｔ化ｉｓｖｉｒｕｓｉｓａｃｏｒｏ打ａｖｉｍｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｈｕｍａｎｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ２２９Ｅａｎｄｐｏｒｃｉ打ｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｇｅｎｅｒａｌｖｉｒｏｌｏｇｙ７４Ｐｔ（ 扬州大学硕击学位论文＾９１７－９５１８０４１９９３．），（）１１Ｍ．ｉｌｌｅｒＭ．ＪＳｕｍｍａｒｏｆｃｕｒｒｅｎｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｔａｘｏｎｏｍａｎｄｃｌａｓｓｉｆｉｃａｉｏｎｏｆＶ，ｙ，ｙ，ｔａｒｉｏｕｓｍｉｃｒｏｂｉａｌａｇｅｎｔｓ．Ｖｉｒａｌｔａｘｏｎｏｍｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎｏｆｆｉｃｉａｌｐｕｂｃａｔｏ打ｏ－ｔｅＩｎｆｅｃｔＤｅｔＡｍ１１２１１３．ｌｉｉｆｈｉｏｕｓｉｓｅａｓｅｓＳｏｃｉｏｆｅｒｉｃａ６６６３９９ｙ，）（１２Ｐ．ｔ．．．．．ＣａｌｌｅｂａｕｔＩｎＣｏｎｒＶｉｒｏｌ４２０９８１ｇ１）（ｗｅｏｎｔｅｔｌ１３ＫＣ．Ｈ．ｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｒｏｈｌａｃｉｃｆｆｅｃｏｆｃｈｉｃｋｅｎｅｏｌｋｉｍｍｕ打ｏｌｏｂｕ，ｐｐｙｇｇｙｇｉｎｙＹａａｉｎｓｔｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓＰＥＤＶｉｎｉｌｅｔｓ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｇ）ｇｐｐ（）ｐｇｏｆｖｅｔｅｒｉ打ａｒｙｍｅｄｉｃａｌｓｃｉｅｎｃｅ／ｔｈｅＪａｐａｎｅｓｅＳｏｃｉｅｔｙｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｃｉｅｎｃｅ６２，９６－１９６４２０００．（）１４宣华，邢德坤，王殿派等．应用猪胎肠单层细胞培养猪流行性腹泻的研究Ｊ．中国［］－人民解放军兽医大学学报４３；２０２２０７１９８４。（）（）１５Ｈｏｆｍａｎ打ＭＷ．民．ＰｒｏａａｔｉｏｎｏｆＴｈｅＶｉｒｕｓｏｆＰＥＤｉｎＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ，ｐｇｃ－ｌｉｎｉｃａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２６：２２３５２２３９１９８８．（）１６李树根，李施力，霍燕琼等．．使巧细胞培养单层分屬猪流行性腹泻病毒闭ｍ．中－国兽医科技１０１。：２４２５９９１（）＊１７ＤＳＳ．．ＪＳＹａｎＪＳＯｈ．ＪＨＨａｎ．ａｎｄＢＫＰａｉｋ．Ｄｉ瓶ｒｅ打ｔｉａｔｉｏｎｏｆａＶｅｒｏｃｅｌｌ，，，，，，，，ｇａｄａｐｔ：ｅｄｐｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｆｒｏｍＫｏｒｅａｎｆｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｓｂｒｅｓ化ｉｃｔｉｏｎｆｒｐｙ．＊’ｍｏ－－ａｇｍｅｎｔｌｅｎｔｈｐｏｌｙｉｐｈｉｓｍａｎａｌｓｉｓｏｆＯＲＦ３．Ｖａｃｃｉｎｅ２１１７１８：ｌ８３３４２００ｇｙ（）口■３．）８Ｋｏｕｄｅ化ａＫ．Ｊ．ｅｔａｌ．Ｅｎｄｏ化ｅｌｉａｌｔａｒｅｉｎｏｆｃｏｗｅａｍｏｓａｉｃｖｉｍｓＰＭＶｖｉａｓ１，ｇｔｇｐ（Ｃ）ｕｒｆａｃｅｖｉｍｅｎｔｉｎ．ＰＬｏＳａｔｈｏｅｎｓ５ｅｌ０００４１７ｄｏｉ：１０．１３７１／ｏｕｍａｌ．ａｔ．ｌ０００４１７２ｐｇ，，ｊｐｐ（００９．）１９ＰｅｎｚｅｓＺ．ＧｏｎｚａｌｅｚＪ．Ｍ．Ｃａｌｖｏ巨？ｂｅｔａＡ．ＳｍｅｒｄｏｕＣ．ＭｅｎｄｅｚＡ．Ｓａｎｃｈｅ，，，，，，，，，，，，ｚＣ．．Ｍｏｌａ．ｌｍａｚａｎＦ．Ｅｎｕａｎｅｓ．ｅｅｎｏｍｅｓｅｕｅｎｃｅｏｔｒａｎｓｍｉ，Ｓ，Ｉ，Ａ，ＬＣｏｍｌ化ｆ，，ｊ，ｐｇｑｓ－ｓｅａｏｅｎｓｃｏｒ－ｃｉｂｌｇｓｔｒ化ｒｉｔｉｏ打ａｖｉｒｕｓＰＵＲ４６ＭＡＤｌｏｎｅａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏ打ｏｆ化ｅｕｒｄｕｅｖｐ－ｉｒｕｓｃｌｕｓｔｅｒ．Ｖｉｒｕｓｇｅｎｅｓ２３１１０５１１８２００１．（），（）２０ＧＳ．ＳＴｈｉｉｄＭＮＰＩＰＭ１９９５．ｅＣｏｒｏｎａｖｒａｅ．ｅｗＹｏｒｋｅｎｕｍｒｅｓｓｅｅｄ．，［］（）２－１吴时友，吴尹，猪传染性胃肠炎病毒ＴＧＥＶ）研巧进展．中国兽医杂志３９２：２９（（）３１２００３。（）２２兰喜．猪传染性胃肠炎病毒的分子诊断与免疫研究［Ｄ］．甘肃省：中国农业科学院（２００巧。２３Ｓ艮．Ｄ．Ｄ．Ｇ．Ｄ．Ｌｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｃａｎｉｎｅｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓａｎｄｏｒｃｉｎｅｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ，ｐｔｇａｓ吐ｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓｂｙｎｅ山ｒａｌｉｚａｔｉｏｎｗｉ化ｃａｎｉｎｅ，ｐｏｒｃｉｎｅａｎｄｆｅｌｉｎｅｓｅｒａ口．Ｙｅｔｅ］ｒ５－２９０ｉｎａｒｙｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：２８３１９８０．（）２４何，林继煌孔胚，还红华，等．猪传染性胃肠炎病毒弱毒株ＳＴＣ３细胞培养特性及８－９致病性研巧［Ｊ．００１。．３１｜中国兽屋科技巧）口）２５殷震，刘景华．动物病毒学［Ｍ］．北京：科学出版社１９９７。（２６Ｓｖｅ打ｓｍａｒｋ，Ａｓｋａａ，Ｊ．，Ｗｏｌｓｔｍｐ，Ｇ．＆Ｎｉｅｌｓｅ打，ＫＬＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｆｐｉｇｌｅｔｄｉａｒｒｈｏｅａｉｎｉｎ化ｎｓｉｖｅｌｙｍａｎａｇｅｄＤａｎｉｓｈｓｏｗｈｅｒｄｓ．ＩＶ．Ｐａｔｈｏｇｅ打ｉｃｉｔｙｏｆｐｏｒｃｎｅｒｏ化ｖｍｓＡｃｔａｔ３０１－ｉｉ．ｖｅｅｒｉｎａｒｉａＳｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ７７６１９８９．，（）２７ＳａｉｋｒｕａｎＷｅａｌｅｎｅｔｉｃｔｎｏｖｅｌｃｏｍｂｉｎａｔｉｓ１ｇ．ｔ．Ｇｄｉｖｅｒｓｉａｎｄｏ打ｏｆＧ４Ｐ９ａｎｄＧ９，ｙ［］１ｔ－１ｍ２５５２６２Ｐ９ｏｒｃｉｎｅｒｏａｖｉｒｕｓｓ化ａｉｎｓｉｎＴｈａｉｌａ打ｄＶｅ；ｅｒｉｎａｒｉｃｒｏｂｉｏｌｏ１６１［，］ｐｙｇｙ，ｄｏｉ：１０．１０１６／．ｖｅｔｍｉｃ．２０１２７２０１３．ｊ．０．０３６（） 江苏地区猪蜡病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析杨振：＾２８ＡＭ．，Ｆ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｖｉｒｏｌｏｇｙ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９９）．２９ＥｓｔｅｓＭ．Ｋ．＆ＣｏｈｅｎＪ．Ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｉｃａｌｒ，，ｇｇｅｖｅｗｓ５３４１０－４４９１ｉ９８９．，（）３０Ｅ巧ｅｓ，Ｍ．Ｋ．，Ｋａｎｇ，Ｇ．，Ｚｅｎｇ，Ｃ．Ｑ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｓ．Ｅ．＆Ｃｉａｒｌｅｔ，Ｍ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｒｏａｖｍ－ｔｉｒｕｓａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓＮｏｖａｒｔｉＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｓｉｕｍ２３８８２９６ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ．ｓｙｐｏｓｇ，；－９６１００２００１．（）３１ＧｏｒｚｉｌｉａＭＬ．Ｇ．ＫａｉｋｉａｎＡＺＣｈａｎｏｃｋ民Ｍ．Ａｎｔｉｅ打ｉｃｒｄａｔｉｏｎｓｈｉｓａｍｏｎｈｇ，，，ｐｇｇｐｓｕｍａｎｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｏｕｔｅｒｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎＶＰ４．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ－ＵＳＡ８７７７．：１５５１５９１９９０（）３２ＪｉａｎｇＢＭ，Ｓ．Ｌ．，Ｋａ打ｇＳＹ，ＫｉｍＪＨ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ１；ｈｅｓ１：ｕｒｃｔｕｉ：ａｌａｎｄ打ｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓｏｆａｐｏｒｃｉｎｅｇｒｏｕｐＣｒｏｔａｖｉｒｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｇ６４１７－１７ｙ：３１３８１９９０．（）３３Ａｈｍａｄｉａｎ，Ｓ．＆Ｓｈａｈｒａｂａｄｉ，Ｍ．Ｓ．ＭｏｒｈｏｌｏｇｉｃａｌｓＵｉｄｙｏｆ化ｅｒｏｌｅｏｆｃａｌｃｉｕｍｉｎｐｔｈｅａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｔｈｅｒｏｔａｖｉｒｕｓｏｕｔｅｒｃａｐｓｉｄｐｒｃｒｔｅｉｎＶＰ７．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ足ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｔｔＢ－ｒｉｏｏｃａｌＳｔａｉｎｏｍｍｉｓｓｉｏｎ７４１：ｏｆｆｉｃｉａｌｕｂｌｉｃａｉｏｎｏｆｈｅｌｉＣ２６６２７３９９９．ｙｐｇ，（）３４Ｐｅｄｌ巧Ｓ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｈａｓ巧Ｄ，ＭｃＣｒａｅＭＡ．ＤｅｆｉｎｉｔｉｏｎｏｆｔｗｏｎｅｗｇｒｏｕｐｓｏｆａｔｙｐｉｃａｔＴｈＪｏｕｏｆｅｎｅｒａｒｏ－１ｒｏａｖｉｒｕｓｅｓｌｏ６７：１３１１３１８６．．ｅｒｎａｌｇｌｖｉｇｙ７（９）３５．猪转状病专和传染性胃肠炎病寺核政免度的研究．博±论文（２００２。师东方）３６Ｔｈｅｉｌ，Ｋ．Ｗ．，Ｂｏｈｌ，Ｅ．Ｈ．及Ａｇｎｅｓ，Ａ．Ｇ．ＣｅｌｌｃｕｌＵｉｒｅｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｒｏ－－ｔａｖｉｒｕｓｒｅｏｖｉｒｕｓｌｉｋｅａｅｎｔ．Ａｍｅｒｉｃａｎｏｕｒｎａｌｏｆｖｅｔｅｒｉｎａｒｒｅｓｅａｒｃｈ３８１７６５１７６（ｇ）ｊｙ，８（１９７７）．ＢＫ＊３７ｏｈｌ，Ｅ．比，Ｔｈｅｉｌ，．Ｗ．＆ＳａｉｆＬ．Ｊ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｅｒｏｔｉｎｏｆｏｒｃｉｎｅｒｏｔａｖｉ，ｙｐｇｐｒｕｓｅｓａｎｄａｎｔｉｇｅｎｉｃｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉ也ｏｔｈｅｒｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｌｉｎｉｃａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ１９１０５－１１１１９８４．ｇｙ，（）Ｐｅｎｏｕｃｋｅｗｃｏｒｏ打ａｖ－３８ｓａｅｒｔＭ．Ｂ．＆ｄｅＢＰ．Ａ打ｉｒｕｓｌｉｋｅａｒｔｉｃｌｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｄ，ｐ，－ｉａｒｒｈｅａｉｎｓｗｉｎｅ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ５８２４３２４７１９７８．，ｇｙ（＾）３９ｅｓｓ民目ｏｌｌｗａｈｎＷ．ＰｏｓｉｓｃｈｉｌＡ．ＨｅｉｎｒｉｔｚｉＫ．＆ＢａｃｈｍａｎｎＰ．Ａ．ＣｕｒＨ．Ｇ？，，，，．，，，，ｐ［ｒｅｎｔａｓｐｅｃｔｓｉｎｔｈｅｅｔｉｏｌｏｏｆｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａｓｏｆｓｗｉｎｅ：ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓｗｇｙｉｔｈ化ｅｅｉｚｏｏｔｉｃｖｋａｌｄｉａｒｒｈｅａ（ＥＶＤ）ｖｉｍｓ．目ｅｒｌｉｎｅｒｕｎｄＭｉｍｃｈｅｎｅｒｔｉｅｒａｒｚｔｌｉｃｈｅｐ］４４５－４４９Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ９３１９８０．，（）４０ＴａｋａｈａｓｈｉＫ．ｋａｄａＫ．＆ＯｈｓｈｉｍａＫ．ＡｎｏｉＵｂｒｅａｋｏｆｓｗｉｎｅｄｉａｒｒｈｅａｏｆａｎｅ，，Ｏ，，－ｔ－ｗｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃｏｒｏｎａｖｉｍｓｌｉｋｅａｒｔｉｃｌｅｓｉｎ了ａａｎ．＞Ｊｉｈｏ打ｕｉａｋｕｚａｓｓｈｉ．Ｔｙｐｐｐｊｇｈｅａｎｅｓｅｏｕｒｎａ－Ｊａｐｌｏｆｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｓｃｉｅｎｃｅ４５，８２９８３２（１９８３）．ｊ４１ＫｗｅｏｎＣＨＫ．Ｂ．ＪｕｎＳＫｅｅＹＪｕｒＤＨＨｗａ打ＥＫＲｈｅｅＪＣＡｎＳＨ．Ｉｓ，，，，，，，ｇＴＨｇｏａｉｏｎｏｏｒｃｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓＤＶｉｎｒｅａｏｒｅａｎＶｅｔＲｅｓＶｌｔｆｐｉｐＫｏ，ＫＪ（ＰＥ）ｅＳｃ－２５４ｔｉ１９９３３３：２４９１９９３．，（）４２ｅ打Ｊｅａｌｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ打ａｎｄｈｌｏ打ｅｉｃａｎａｌｉｆｍｅｍｂｍｎ仁ｈ．Ｆ．ｔ．Ｍｙｅｔｙｓｓｏ，ｐｇｅｐｒｏｔｅｉｎｅｎｅｓｏｆｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓｉｎＣｈｉ打ａ．Ｖｉｒｕｓｅｎｅｓｇｐｐｇ－－－－ｉ３６３５５３６４ｄｏ：１０．１００７／ｓｌ１２６２００７０１９６７２００８．，，（）４３ＰａｒｋＳ．Ｊ．ｅｔａｌ．Ｓｅｕｅｎｃｅａｎａｌｓｉｓｏｆ化ｅａｒｔｉａｌｓｉｋｅｌｃｏｒｏｔｅｉｎｅ打ｅｏｆｏｒｃｉ，ｑｙｐｐｇｙｐｇｐｅｅｍｃｄａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｅｓｉｓｏａｅｄｉｎＫｏｒｅａ－打ｅ．ｓｅｎｅｓ５１ｉ：．ｉｄｉｉｌｔＶｉｍｇ３３２３３２ｄｏｌ０１０ｐ，，０７／－－－Ｓ１１２６２００７００９６Ｘ２００７．（）４４ＤｕＤＴＴ．Ｐｕｒａｎａｖｅａａ打ａｗｏｎ打ｕｗｅｃｈ民ｅｎｅｔｉｃａｒａｃ；ｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ．ＮＳＴｈ．ＧＣｈ１ｙ，，ｊ，ｇ 扬州大学硕壬学位论文ＰｏｒｃｉｎｅＥｐｉｄｅｍｉｃＤｉａｒｒｈｅａＶｉｍｓ（ＰＥＤＶ）Ｉｓｏｌａｔｅｓ行ｏｍＳｏ山ｈｅｒｎＶｉｅｔｎａｍｄｕｒｉｎｇ－２０ｔｓＴｈａ－２００９１０Ｏｕｂｒｅａｋｉｅｔｅｄ２０１１４：６４２０１１．ＪＶＭ１５５．．（）－４５．５２１２２１１９８２。蔡宝样．介绍几种新近发现的猪传染病ｍ畜牧与兽医：８（）（）４６ＬｉｎＹ．ｅｔａｌ．ＣｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎＷＵＨｌ．Ｊｏｕｒ，ｐｇｑｐ－ｎａ：．ｌｏｆｖｉｒｏｌｏ８６７０１０ｄｏｉ１０１１２８／ＪＶＩ．００７２５１２０。ｇｙ，，口巧４．４７陈强，曾丽莉，俞伏松，等．规模化猪场仔猪腹泻种病原的感染情况调查叫福２５１８－１３２０１０。建农业学报：（（））－４８霍金耀．２０１０２０１２，陈陆，赵军，等年华中地区猪流行性腹泻病毒流行毒遗传进化１２分析Ｃ．中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第次人兽共患病学术研讨会暨第［］－６届第１４次教学专业委员会论文集３１４３２０口０１２。）４９甘海霞，梁歳，韦显凯，等．２０１１年广西猪群猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎调查（１－１２ｉ２７２０１２。机．动物医学进展３３０）：５（）５０Ｌｉ，Ｚ．Ｌ．ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｄｅｒｉｚａｔｉｏ打ａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉＶｉ１－ｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓＰＥＤＶｆｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｓｉｎｓｏ山ｈＣｈｉｎａ．ｒｕｓｅｎｅｓ４５８１１８（）ｇ，５ｄｏｌｌ－－－ｉ：１０．１００７／ｓ２６２０１２０７３５８０１．，口巧５１刘孝珍，０１．．，刘胜枉冯力．２１年中国猪流行性腹泻病毒分子流行病学初步调查［Ｄ］，２０１。哈尔滨：东北农业大学（巧？ｔ？５２ＭａｄｓｏｎＤ．Ｍ．ｅａｌ．ＰａｔｈｏｅｎｅｓｉｓｏｆｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅＳ／，ｇｐｐ（Ｕｏｗａｉｎ－－ｏｌｄｗｅａｎｅｄ－Ｉ／１８９８４／２０１３３ｗｅｅｋｉｓｅｅｒｉｎａｒｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ４６０６８．Ｖｔｙ１７）ｐｇｇｙ，，１．１ｔｍｉｃ．２０ｄｏｉ：００１６／．ｖｅ．２０１４０９．００２１４．ｊ（）５３Ｓｏｎｇ，Ｄ．＆Ｐａｒｋ，Ｂ．Ｐｏｒｃｉｎｅｅｐｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｏｅａｖｉｒｕｓ：ａｃｏｍｐｒｅｈｅ打ｓｉｖｅｒｅｖｉｅｗｏｆｓｉｓａ打ｄｖａｃｃｉｎｅｅｎｅｓ－ｄｏｉｍｏ：ｌｅｃｕｌａｒｅｉｄｅｍｉｏｌｏｄｉａｎｏｓ．Ｖｉｒｕｓ４４１６７１７５１０．，，ｇ，ｐｇｙｇ，－－－２０２１００７／ｓｌ１２６２０１２０７１３１１）．（－４ＫｉｍＢ．Ｉｔｏｎｉｔｔｎｏｔｒａｓｓｅａｓｔ５．ｈａｅＣ．ｎｓｉＵｉｈｂｒｉｄｉｚａｉｆｂｒｔｉｈｅｄｅｅｃｉｏｆｎｓｍｉｉｂｌｒｏ，，Ｃ，ｙｇｅｎｔｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓｉｎｐｉｓａｎｄｃｏｍａｒｉｓｏｎｗｉｔｈ０化ｅｒｍｅ化ｏｄｓ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．民ｅｓ．６５ｇｐ－１３３３７．２００１．（），（，）５５３３１０－７０刘登存．中国兽医科技；６９．２００３。，赵华．猪传染性胃肠炎的防治机（）（）５６ＰａｔｏｎＤ．化ａｔａＧ．ＳａｎｄｓＪ．足ＭｃＧｏＩｄｒｉｃｋＡ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅａｓｔｒｏ，，，，，，ｇ－ＰＣＲｅｉＵｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓｂｙＲＴａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆｒｏｍｐｏｒｃｉｎｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｃｏｒｏ打ａｖｉｒｕｓ．－Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏｉｃａｉｍｅｔｉｉｃｘｌｓ６６３０３３０９１９９７．ｇ，（）５７ＭｅｂｕｓＣＡ，Ｕ．Ｎ．，ＲｈｏｄｅｓＭＢ，ｅｔａｌ．ＣａｌｆＤｉａｒｒｈｅａ（Ｓｃｏｕｒｓ）：民ｅｐｒｏｄｕｃｅｄｗＵｈａＶｉｒ＊ｕｓｆｒｏｍａＦｉｅｌｄＯｉＵｂｒｅａｋ．ＵｎｉｖＮｅｂｉａｓｋａＡｇｒｉＥＸＰＳｌ；ｎ民ｅｓＢｕｌｌ２３３１９６９．（）５８ＢｒｉｄｇｅｒＪＣ，ａ．Ｂ．Ｊ．Ｐｒｅｖａｌａｎｃｅｏｆａｎｔｉｂｄｙｔｏｔｙｐｉｃａｌａｎｄａｔｙｐｉｃａｌｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓｉｎｐｉｇｓ．Ｖ巧Ｒｅｃ１１６（２）：５０．ｙ９８５）．４－５９何孔巧何．江：６１６３１９９４。．我国动物轮状病毒研究概况苏农业科学，（）ａ－６０Ａｔ．ｅｃｔｉｏｎｆｒｏａｖｒｕｓａｎｉｅｎｉｎｄｉａｒｒｈｅｏｉｃａｎｄｎｏｎｉｉＤＪ０．Ｃ．Ｋ．．ＤＡ．Ｄ化ｏｔｉｔ，ｇ．ｄｉＮｉｉｔＰＴ４２４４９４４９６９９０ｉａｒｒｈｅｏｉｃｐｇｓｉｎｇｅｒａ．民ｅｖＥｉｅｖＭｅｄＶｅａｙｓｒｏｐ：．（）ｙ）６１Ｋｕｓａｎａ．ｅｔａｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｓｅｒｉａｌｒｏａａｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｅｉｄｅｍｉｃｄｉａｒｒｈｅａｖｉＫｌ．Ｉｇ，ｐｐｇｐｐａａｃｈａｒａｃｔｅｒｚａｉｏｓｏａｅｅｏｕｒｎａｏｆｖｅｅｉｒｕｓｉｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓａｎｄｐｒｔｉｌｉｔｎｏｆ化ｅｉｌｔ．ＴｈＪｌｔｒｎａｃａｓｃｅｎｃｅｔ－ｍｅｄ／ｔｈｅＪａａｎｅｓｅＳｏｃｉｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒＳｃｉｅｎｃｅ５４３１３３１８ｉｒｙｉｌｉｐｙｙ，１９９２（）．６２ＺｉｍｍｅｒｍａｎＪＪ，Ｋ．Ｌ．Ａ．，民ａｍｉｒｅｚＡ，ｅｔ，ａｌ．Ｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｓｗｉｎｅ［Ｍ］．１０化ｅｄ．ＩｏｗａＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（２０。）． 江苏地区猪啼病毒感染流行病学调查和全基杨振：因组遗传进化分析１２＿６３ＩＣＴＶＯｎｌｉｎｅＤｉｓｃｕｓｓｉｏｎＦｏｒｕｍｏｆｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉＵｅｅ０打Ｔａｘｏ打ｏｍｏｆ，ｙＶｉｒｕｓｅｓ，ＩＣＴＶ２０１２ＯｆｆｉｃｉａｌＴａｘｏｎｏｍｙ，ｈｔｔｐ：／／ｔａｌｋ．ｉｃｔｖｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ．６４民ｅｕｔｅｒ，Ｇ．，目ｏｌｄｉｚｓａｒ，Ａ．，Ｋｉｓｓ，Ｉ．及Ｐａ打ｋｏｖｉｃｓ，Ｐ．ＣａｎｄｉｄａｔｅｎｅｗｓｐｅｃｉｅｓｏｆＫｏｂｕｖ－ｉｒｕｓｉ打ｏｒｃｉｎｅｈｏｓｔｓ．Ｅｍｅｒｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１４１９６８１９７０ｄｏｉ：１０．３２０１／ｅｉｐｇｇ，，ｄｌ４１２．０８０７９７２００８．（）６５Ｙｕ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ．ＣａｎｄｉｄａｔｅｐｏｒｃｉｎｅＫｏｂｕｖｉｍｓ，Ｃｈｉｎａ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ－８２５１５８２３ｄｏ：１ｌ２００９ｉ０．３２０１／ｅｉｄ５０５．０８１５１８．，，（）６６Ｋｈａｍｒｉｎ，Ｐ．ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｋｏｂｕｖｉｒｕｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｓ化ｏｌｓａｍｐｌｅｓＣＯｅｃｔｅｄｆｒｏｍｈｅａｌｔｈｉｓｉｎＪａａｎ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｅｖｏｌｕｉｏｎ：ｏｕｒｎａｌｏｆｌｌｙｐｇｐ，呂ｔｊ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｉｄｅｍｉｏｌｏａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｅｎｅｔｉｃｓｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１０９５０９５ｐｇｙｙｇ，４ｄｏｉ：１０１／．ｍｅｅｉｄ．２０１０．０６．００１２０．１０６（１０．，ｊｇ）－６７ＡｎＤ．ｔ．Ｐｔ．ＪｅａｌｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｆｒｏｍｉｓｏｏｌｉｎＫｏｒｅａ．Ｖｉｍｓｅｎｅｓ４２２０８，ｐｇｇ，－－２／ｓｌ２６２－１９１１ｄｏｉ：１０．１００７１０１００５６２０１１．，（）６８ＢａｒｒＡ．Ｆ．，Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｊ．，Ａｌｆｉｅｒｉ，Ａ．Ｆ．，ｖａｎｄｅｒＰｏｅｌ，Ｗ？比＆ＡｌｆｉｅｒｉＡ．Ａ．Ｆｉｒｙ，，Ｓｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｋｏｂｕｖｉｒｕｓｉｎｆａｒｍａｎｉｍａｌｓｉ打ＢｒａｚｉｌａｎｄｔｈｉｅｅｔｈｅｒｌａｎｄｓＩｎｆｅｃｔｉｏｎＮ．，ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｏｕｒｎａｌｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｉｄｅｍｉｏｌｏａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｅｎｅｊｐｇｙｙｇ－ｃｓ．ｍｅｅｔｉｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１１８１１１ｄｏｉ：．６／ｉｄ．２．．２０１１．，１８１４，１０１０１ｇ０１１０６０２０（）ｊ’ａｎａ＊《９ＳｉｓａＺ．Ｗ．ｋａＴ．足ＳｉｆＬ．Ｐｉｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，，，，ｙ，ｇＱＯ，＊ｏｆｏｒｃｉｎｅｅｎｔｅｒｉｃｃａｌｉｃｉｖｉｍｓｅｓａｎｄｆｉｒ巧ｄｅ化ｃｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｅｓｉｎＵＳｓｐｐ－－－－ｗｉｎｅ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ１５８１５８３１５８８ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００７０５０１３１６１９５０１３．ｇｙ，，口）７０Ｄｕｆｋｏｖａ，Ｌ．，Ｓｄｇａｌｋｏｖａ，！？，ＭｏｕｔｅＨｋｏｖａ，民？，Ｍａｌｅｎｏｖｓｋａ，Ｈ．＆Ｐｒｏｄｄａｌｏｖａ，Ｊ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｏｆｐｏｒｃｉｎｅｓａｐｏｖｉｒｕｓｅｓｋｏｂｕｖｉｒｕｓｅｓａｎｄａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓｉｎａｓｍｔｏｍａｙ，，ｙｐｔｉｃｉｓ：ａｎｅｍｅｒｇｉｎｇｎｅｗｓａｏｖｉｒｕｓＧＵＩｇｅｎｏｔｙｐｅ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ１５８５４９ｐｇｐ，－－５５８ｄｏ／ｓ－－ｚｉ：１０．１００７００７０５０１２１５２８２０１３．，（）７１Ｋｈａｍｒｉ打，Ｐ．ｅｔａｌ．Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｉｎｐｉｇｌｅｔｓ，Ｔｈａｉｌａｎｄ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｃ－ａｓｅｓ１５２０７５２０７６ｄｏ１．１２２００９ｉ：０３２０１／ｅｉｄｌ５．０９０７２４．，，（）７２姬郭騰赵．，周峰，魏亚鹏，常洪涛，郑逢梅，王川庆．河南地区猪晴病毒分子检测，－和ＹＰ１基因遗传进化分析．中国预防兽医学报３６１：７３７６２０１４。（）（）７３Ｃｈｅ打，Ｌ．ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｏｒｃｉ打ｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓＶＰ１ｆｉＰ１ｗｉｏ打ｕｓｉｎｉ打ｆｅｃｔｅｄｉｓｒｏｍＳｃｈｕａｎｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ．Ｖｉｒｏｌｏｏｕｒｎａｌ０２８ｇｇｐｇ，，ｇｙｊ－－－１ｄｏｉ：１０１１８６／１７４３４２２Ｘ１０２８１２０１３．．，（）７４Ｗａｎｇ，Ｃ．巧ａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｉｎＣｈｉｎａ．－Ａｒｃｈ－－－ｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ１５７５７３５７８ｄｏｉ：１／ｓ０００１１１２０２０１．，０．１００７７０５５７ｇｙ，（巧７５ＦａｎＳｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏ打ａｎｄｃｈａｒａｃ化ｒｉｚｔｉｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｖａｒｉａｎｔｉｓｏｌａｔ．ａｏ打ｏ，ｐｅｒｏｍｓｕｃｋｌｉ打－ｄｆｉｌｅｔｉ打ＧａｎｓｕｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉ打ａＶｉｒｕｓｅｓ５２５６０ｄｏｉ：１０．２５４８．３３ｇｐｇｐ，，，９０／Ｖ５１０２５４８（２０１３）．７６杨振，赵振鹏，张笛，金文杰，秦爱建，等．江苏省屯个县域猪晴病毒感染的流行病－学调查．中国兽医科学４４（０４）：４３６４４０２０１４。（）ｓｅａ－－７７Ｙａｍａｈｉ化Ｔ．ｔｌ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｃｔｏａｔｈｉｃｓｍａｌｌｒｏｕｎｄｖｉｒｕｓｅｓｗｉｔｈＢＳＣ１ｃｅｌｌｓ，ｙｐ－ｆｒｏｍａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１６４９５４９５７ｐｇ，１９９１．（）７８Ｆｏｄｈａ，Ｉ．ｅ．ａ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆａｄｅｎｏｖｉｒｕｓａｎｔｉｇｅｎｓｉ打ｃｈｉｌｄｒｅｎｐｒｅｓｅｎｔｉ打ｇｗｉｔｈａｃｕｔｅ－ｄｉａｒｒｈｏｅａ．Ｍｅｄｅｃｉｎｅｔｒｏｐｉｃａｌｅ：ｒｅｖｕｅｄｕＣｏｒｐｓｄｅｓａｎ１：ｅｃｏｌｏｎｉａｌ６７２５６２５８２，（ ２８扬州大学硕击学位论文００７．）－Ｄ．Ｙ．ＭＡ７９．Ｏｈｅｔａ］ｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ化ｅｆｉｒｓｔｉｃｈｉｖｉｒｕｓｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｉ打Ｅ，ｅａｔｈＡｍｅｒ１－－－ｕｒｏｉｃａ．ＡｒｃｈＶｉｒｏｌ１５：１１９９１２０６ＤＯＩ１０１／ｓ００ｐｎｄｉｎＳｏｕ，．００７０７０５００５７０６－７２００（巧．８０Ｙａｍａｓｈｉｌ：ａ，Ｔ．ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃ化ｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｗｓｅｃｉｅｓｏｆｋｏｂｕｖｉｒｕｓｐｔｔｔｔＴｈ－ａｓｓｏｃ．ｉａｅｄｗｉｈｃａｌｅ．ｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｅｎｅｒａｌｖｉｒｏｌｏ８４３０６９３０７７２００３ｇｇｙ，（）８１ＫｈａｍｒｉＰ．ｉｌｉｈｄｉｒｒｈｅ．ｉｉｉｎ．ｅｔａｌＢｏｖｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓｅｓ行ｏｍｃａｔｔｅｗｔａａＥｍｅｒ打打ｆｅｃｔｏ，ｇｇｓｓｅａｓｅｓ１４－ｕｄｉ９８５９８６ｄｏｉ：１０．３２０１／ｅｌ．ｉｄ４０６０７０７８４２００８．，，（）８２ＤｉＭａｒｔｉｎｏＢ．ｅｔａ．ｏｅｃｕａｒｅｅｃｏ．ｓｌＭｌｌｄｔｔｉｏｎｆｂｏｖｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｅｓｉｎＩ化ｌＡｒｃｈｉｖｅ，ｙｏｆｖ－－－４－ｉｒｏｌｏ１５７２３９３２３９６ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００７０５０１２１３９ｚ２０１２．ｇｙ，，（）８３ＨＬＪＡＪｅｏｎＷ．ＤＪＴｈｔＪｅｏｕｎ．Ｙ．ｉｍ．．ＯｅｍＪ．Ｋ．＆Ａ打．．ｒｅｅｃｌｕｓｅｒｓｏｆｇ，，，，ｇ，，，，－－ｂｏｖｉｎｅｋｏｂｕｖｒｕｓｓｏａｅｄｏｒｅａ２００８２０１０ｉｒｕｓｅｎｅｓ４２４０２４０６：ｉｉｌｔｉｎＫ．Ｖｇｄｏｉ１０．１，，，－－－００７／ｓｌ１２６２０１１０５９３９２０１１．（）８４王茜常继涛刘云于力．牛崎病毒Ｖ巧蛋白的原核表达及巧步应用中国预防兽，，，３４７－１２０１２医学报（１１）：９０９０（）。８５Ａｍｉｍｏ．．ｅｔａｌ．ｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｋｏｂｕｖｉｒｕｓｅ，Ｊ０Ｍｇｓａｎｄａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓｉ打ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃｌｏｃａｌｐｉｇｓｉ打ＥａｓｔＡｆｒｉｃａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ－－－－１５９１３１３１３１９ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００７０５０１３１９４２ｘ２０１４．，，（）８６ＲｅｕｔｅｒＧ．ＢｏＷｉ之ｓａｒＡ．足ＰａｎｋｏｖｉｃｓＰ．Ｃｏｍｌ巧ｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅ，，，，ｐｕｅｎｃｅｓａｎｄｅｎ巧ｉｃｏｒａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓａｍｅｍｂｅｒｏｆａｎｅｗｓｅｃｉｅｑｇｇｐ，ｐｉｎ－ｓｌｈｉｆａｍｉｌｒｉｄａｅｈｉｖｅｓｏｆｖｉｌ０；ｅｅｎｕｓＫｏｂｕｖｒｕｓＰｉｃｏｍａｖｉ．Ａｒｃｒｏｏ１５４１０１１ｇ，ｙｇｙ，－８ｄｏ－－ｉ：１０．１００７００７０５００８０２８８２２００９．，／ｓ（）８７ＶＰ－：１２０２００梁秘张病毒末端结合蛋白ｇ的功能研巧进展．生物技术通报（４）６（９。）８８ＹｕＪ．Ｍ．ｅｔａｌ．Ａｎａｌｓｉｓａｎｄｃｈａｒａｃｋｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｅｎｏｍｅｏｆａｍｅｍｂ，ｙｇｅｒｏｆａｎｅｗｓｅｃｉｅｓｏｆｋｏｂｕｖｉｒｕｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉ１：ｈｓｗｉｎｅ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ１５６ｐｇｙ，７４７－７５１ｄｏ５－００－－２０ｉ１０．１００７／ｓ００７０１０９０７６１１．：，（）８９ＤｒｅｘｌｅｒＪ．Ｆ．ｅｔａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｏｆ３ｌｉｎｅａｅｓｏｆａｎｏｖｅｌＳａｆｆｏｌｄｃａｒｄｉｏｖｉｍｓｉｎｈｕ，ｇｍａｎｓ－．Ｅｍｅｒ打ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１１４ｄｏｉ：１／ｅｌｇｉ呂１４３９８０５１０．３２０ｉｄ４０９．０８０５７０２０，，（０８．）９０顿华．抗口蹄疫病毒３Ｄ蛋白单克隆抗体的制备及抗原新位点的鉴定．甘肃农业大学硕±论文２０１３）。（９１民ｅｕｔｅｒＧ．ＫｅｃｓｋｅｍｅｔｉＳ．＆ＰａｎｋｏｖｉｃｓＰ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉ，，，，ｐ－ｏｎｕｎａｒ．Ｅｍｅｒｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１６６９６６９８ｄｏｉ：１０．３２０１／ｅｉｄｌ６０４．０９０９３，Ｈｇｙｇｇ，，７２０１０．（）９２ＰａｒｋＳ．Ｊｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓｅｓｉｎｉｓｉｎＫｏｒｅａａｎｄ．，ｐｐｇ－ｔｈｅｉｒａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｄｉａｒｒｈｅａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ１５５１８０３１８１１ｄｏｉ：１０．１００７／，，－－－ｓ００７０５０１００７７４１口０１０．）－９３ＶｅｒｍａＨ．ＭｏｒＳ．ｄｅｌＧｌｉｌＭ．ｏａｌｅｎｉｃａｉｌ．ＫＡｂＹ．＆ＧＳ．Ｍ．Ｉｄｔｉｆｔｏｎａｎｄｍｏ，，，，，ｙ，－ｅｃｕｔｔ．Ｖ５ｌａｒｃｈａｒａｃｅｒｉｚａｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｉｎＵ．Ｓ．ｓｗｉｎｅｉｒｕｓｅｎｅｓ４６５５１ｐｇ，－－－５３ｄｏｉ：１０．１００７／ｓｌｌ２６２０１３０８７９ｌ２０１３．，（）９４Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｋ．，Ｓｏｎｇ，Ｄ．Ｓ．，Ｍｏｏｎ，Ｈ，Ｊ？及Ｐａｒｋ，Ｂ．Ｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａ打ｄｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃ化ｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｋｏｂｕｖｉｍｓｅｓｉｎｆｅｃａｌｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄ行ｏｍｄ 杨振：江苏地区猪峭病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析２９ｔｅｎｅｉａｒｒｈｅｉｃｃａｔｌｅｉｎＫｏｒｅａ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｉｃｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｏｕｒｎａｌｏｆｍｏｌｅｃ山ａｒｅ，ｇｊｐ－ｔｉｄｅｍｉｏｏａｎｄｅｖｏｌ山ｉｏｎａｒｅｎｅｉｃｓｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１１１１１ｄｏｉ：１０．１ｌｇｙｙｇ，７８１８２，０１６／．ｍｅｅｉｄ２０１１．０２１ｉｌｇ．．０９Ｏ．ｊ口）９５ＣｈｕｎｇＪ．Ｙ．ｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｌｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｅｓ．Ｖ，ｇ－－－－ｉｍｓｅｎｅｓ４７５５９５６２ｄｏｉ：１０．１００７／ｓｍ６２０１３０９５３８２０１３．ｇ，），（９６Ｌｉ，Ｌ．ｅｔａｌ．Ｖｉｒｕｓｅｓｉｎｄｉａｒｒｈｏｅｉｃｄｏｇｓｉｎｃｌｕｄｅｎｏｖｅｌｋｏｂｕｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｓａｐｏｖｉｒｕｓｅｓ．ＴｈＪｏｕｎａｏｆｅｎｅｒａｌｖｉｒｏｌｏ９２２５３４－２５４１－ｅｒｌｄｏｉ：１０１０９９／ｖｒ００３４６１２０１１ｇｇｙ．ｉ．．１０．，，（）９７Ｌｉ，Ｌ．ｅｔａｌ．Ｂａｔｇｕａｎｏｖｉｒｏｍｅ；ｒｅｄｏｍｉｎａｎｃｅｏｆｄｉｅｔａｒｙｖｉｒｕｓｅｓｆｒｏｍｉｎｓｅｃｔｓａｎｄｐ－ｌａｎｔｓｌｕｓｎｏｖｅｌｍａｍｍａｌｉａｎｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏ８４６９５５６９６５ｄｏｉ；１０．１１ｐｐｇｙ，，－２８／ＪＶＩ．００５０１１０口０１０．）９８Ｌｅｅｅ－Ｍ．Ｈ．ｔａｌ．ＫｏｂｕｖｉｒｕｓｉｎＳｏｕｔｈＫｏｒｅａｎｂｌａｃｋｏａｔｓ．Ｖｉｒｕｓｅｎｅｓ４５１８６１８，ｇｇ，９ｄｏ－－－ｉ：１０．１００７／ｓｌｌ２６２０１２０７４５６２０１．，（巧９９ＷａｎＬａｎＤ．＆ＨｕａＸ．ＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｆｒｏｍｉｓＵ）〇ｌｓｅｃｉｍｅｎｓｉｎＳｈａｇ，，，ｐｇｐ３５０－３５２－－－ｎｈａｉｈｉｎａ．Ｖｉｒｕｓｅｎｅｓ４３ｄｏｉ：１０．１００７／ｓｌ１２６２０１１０６４３３２０１１．ｇ，Ｃｇ，，（）１００姬郭彪．河南猪峭病毒分子流行病学调查、全基因序列分析、ＶＰｌ蛋白表达及其初步应用．河南农业大学硕古论文（２０１３。）１０１张莎．猪崎病毒流行病学调查及ＣＨ／ＨＺ／２０１１株全基因序列分析．东北农业大学硕±论文’２０１３。（）．１０２修金生，胡崇伟，陈如敬，等．猪峰病毒福建株全基因克隆及序列分析．中国人兽２９－共患病学报（１１）：１０７６１０７９（２０１３）．１０３．梁丹洁．广西猪晴病毒的感染状况调查与基因序列分析广西大学硕±论文口０１４。）１０４Ｙａｍａｓｈｉ化Ｔ．ＳａｋａｅＫ．ＩｓｈｉｈａｒａＹｏｍｕｒａＳ＆Ｕｔａａｗａｒｅｌｅｎｃｅｏｆ，．Ｉｓ．Ｅ．Ｐｖａ，，，，，，ｇ，ｎｃｍ＾ｅｗｌｉｓｏｌａｔｅｄｔｏａｔｈｉｃｓａｌｌｒｏｕ打ｄｖｉｒｕｓＡｉｃｈｉｓｔｉａｉｎｉ打Ｊａａｎ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｌｉｙ，ｙｐ（）ｐｎ－ｉｃａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ３１２９３８２９４３１９９３．ｇｙ，（）Ｌ－－－１０５ＬｉＸ．ＺｈｏｕＹ．ＪｉＨ．ＸｕＺ．＆Ｚｈｕ．Ｏｎｅｓｔｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏ打ｌｏｏｍｅ，，，，，，，，ｐｐｐｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｋ－ｏｂｕｖｉｒｕｓｒｎａｏｆｖｒｏｏｃａｅ：ｅ．．．Ｊｏｕｌｉｌｉｌｍｔｈｏｄｓ２０７１５ｄｏｉ１０－１０１６／．ｖｉｒｏｍｔ．２０１４０６０１ｇ，，ｊｊ２２０１４．（）１０６ＬｉＣ．ｅｔａ！．民ａｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏ打ｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｉ打ｆｅｃｅｓｂｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎ，ｐｙｐｐ－－ｍｅｄｌｏｏｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｒｏｌｏｏｕｒｎａｌｄｏｉ：１／ｐｐ．Ｖｇｙｊ１１７３１０．１８６１７４３，，－４２２Ｘ－１１７３２０１４．（）１０７田野．猪峭病毒ＶＰｌ基因克隆与表达及抗体检测ＥＬＩＳＡ方法的建立．扬州大学硕七论文（２０１３）。１０８民ｅｕｔｅｒＧ．ＢｏｌｄｉｚｓａｒＡａａｎｋｏｖｃｓｅｔｅｃｔｏｎｏｆＡｃｈｍｓｓｈｅｄ．Ｐ．及ＰｉＰ．Ｄｉｉｉｖｉ，ｐｐ，Ｇ，，，，出ｎｉ打ａｃｈｉｌｄｗｉｌ：ｈｅｎｔｅｒｉｃａｎｄｅｘｔｒａｉｎｔｅ巧ｉｎａｌｓｍｔｏｍｓｉｎＨｕｎａｒ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｇｙｐｇｙｖｏｏ－－－－ｉｒｌ１５４１５２９１５３２ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００７０５００９０４７３２００９．ｇｙ，，ｙ（）１０９ＹａｎＺｅｔａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｏｉｎｇ．，ｐ耗ｃｔｉｎｇｐａｔｈｏｇｅｎｓ＾打ｄｉａｒｒｈｅｉｃｐｉｇｓｉｎＪｉａ打ｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇ－－－－１５９３４０７３４１２ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００７０５０１４２２０４２２０１４．，ｙ，（） ３０扬州大学硕壬学位论文第二篇试验研究一第章猪峭病毒３Ｄ基因ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立＊一根据猪崎病毒（ＰｏｒｃｉｎｅＫｏｂｕｖｉｍｓ，ＰＫＶｓ）３Ｄ基因保守序列设ｉｉ对特异性引物，建－ＰＣＲ方法ＰＣＲ立了检测猪棉拭样本中的猪崎病毒的ＲＴ，同时对各条件进行优化，并用于对江苏地区猪群中感染的猪畴病毒的检测。１材料与方法１．１材料１．１．１病料来源和处理２０１２年口月从江苏某猪场采集的腹泻仔猪棉拭和肠道样品，样品来自显腹泻的ｆ巧＝仔猪。棉拭样本置经ＤＥＰＣ处理后无ＲＮＡ酶的１．５ｍＬ指形管，用８００ｌｘ祀ＳｐＨ７．２阵（）一レＰＢＳＨ＝１．５ｍＬ稀释；肠道样品研磨后加定量７，置经ＤＥＰＣ处理后的指（ｐ巧制成恳液‘－形管，７０Ｃ冻存。１．１．２主要巧剂和生物材料ＴＲＩｚｏ－Ｉ试剂贿自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；反转录酶Ｓ啤ｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ购自虹ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＤＥＰＣ购自Ｓｉｇｍａ公司；ｌ〇ｘＰ口Ｒ＾Ｂｕｆｅｒ、Ｍｄ］、ｄＮＴＰ为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓｇ公司产品；ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ为Ｔｈｅｒｍｏ公司产品；ＴａｑＤＮＡ聚合酶购自大连宝生物工程有限公司；猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪癌病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪大肠杆菌阳性模板由本实验室保存。１．１．３主要仪器超净操作工作台、ｌＯｉＬ、２（ＨｉＬ、２００ｉＬ和ｌＯＯＯＬ的微量移液器、４＾冷冻离也机＾ｊｕｅｎｄｏｒｆ－（Ｅ公司）酸电泳仪（助０ＲＡＤ公司）；微量电子天平ＨＡＮＧＰＩＮＧＪＡ２０（Ｂ；ｐｐ；核（）’°４Ｃｅｒｍｏ－７０Ｃ超低－８０Ａ离也机（Ｔｈ公司）；温冰箱（ＲＥＶＣＯ公司）；祸旋泡匀仪（ＸＷ），ＮＤ－ｌｉ１０００Ｓｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ紫外可见光度计（ＮａｎｏＤｒｏ），９６孔ＰＣＲ仪（ＡｐｐｅｄｐｐＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），凝胶成像系统（ＭｉｎｉＬｕｍｉ）。１．２方法 杨振：江苏地区猪岭病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析３】１２．１．引物设计根据根据ｅｎ－－ＨＵＮＧＢａｎｋ公布的猪峭病毒（ＰｏｒｃｉｎｅＫｏｂｕｖｉｍｓ，ＰＫＶｓＳ１ＮＣ０１１８２９）（）一ＰＫＶ参考株犯区基因序列设汁对ｓ引物７ｂ。，预期扩増产物大小约为２１ｐ１１－ＰＫＶ－３ＤＦ－－Ｓ：５ＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＴＧＴＴＴＴＧＡＴＧＣ３＇＇ＰＫＶＳ－３Ｄ－Ｒ－－：ＳＡＴＧＴＴＧＴＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＧＡ３１．２．２总ＲＮＡ的提取处理好的样品按Ａｘｙｇｅｎ试剂盒方法提取总ＲＮＡ：－１、取组织研磨液或粪便悬液３００曲于试剂盒提供的１．５ｍＬ离也管，加入４００ＬＢｕｆｆｅｒＲ口－Ｉ祸旋混匀后加入１５〇ＬＢｕｆｅｒＲＩＩ，祸１２０００瓜５ｍｉｎ；，ｎ旋震荡后ｇ离２、取上清转入到新的１．５ｍＬ离也管２５０漏合均匀后转入含有制备，加入曲异丙醇，、也ｕ管的２ｍＬ离屯管，６０００ｇ离Ｉｍｉｎ；弃滤液后加入５０〇ｎＬＢｆｆｅｒＷｌＡ，１２０００ｇ离也Ｉｍｉｎ；７０〇ｅ一弃墟液再加入ＭＬＢｕｆｒＷ２，１２０００ｇ离也Ｉｍｉｎ，重复次；３、弃滤液后１２０００ｇ离也Ｉｍｉｎ，将制备管转入新的经ＤＥＰＣ处理的１．５ｍＬ离也管，在制备膜中间加入３０曲经ＤＥＰＣ处理的ｄｄｗ。室温静置Ｉｍｉｎ后１２０００ｇ离也Ｉｍｉｎ，洗脱’Ａ－得到ＲＮ，将ＲＮＡ保存于７０Ｃ或立即反转录。１．２．３ＲＮＡ的反转录总ＲＮＡ的反转录程序和体系按Ｓｕｅｒｓｃｒｉｉｒｓ－ｔｒａｎｎｈｅｓｉｓｍ说ｐｐｔ阻ＦｔＳｄＳｙｔＳｙｓｔｅ明书进行，反应体系如下：反应组分体积总ＲＮＡ８ＬｈＲａｎｄｏｍＨｅｘａｍｅ巧５０ｎ／ｉＬ１ｊＬ（ｇｆ）｜ｄＮＴＰｓＭｉｘｌＯｍＭ１ｊＬ（）｜‘Ｃ一于６５反应５ｍｉｎ，置冰上至少分钟，依次加入下列组分；ｌＯＸＲＴｂｕｆｅｒ２咕ＭＣｌ２５ｍＭ）ＡｉＬｇ２（＼Ｏ．ＩＭＤＴＴ２ｉＬｉＲＮａｓｅＯＵＴＵ仲）ＩｊｉＬＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ．ＩｌｌＲＴ２００Ｕ／＾ｉＬ１（）冲 ３２扬州大学硕壬学位论文‘’’Ｃ反Ｃ反一２５应ｌＯｍｉｎ，５０应５０ｍｉｎ，８５Ｃ反应５ｓ，置冰上至少分钟，加入ｌ＾ＬＲＮａｓｅ‘‘３７Ｃ反应２０ｍ－ＨＵ／曲，ｉｎ，反应产物置２０Ｃ保存备用。口）２ＲＴ－ＰＣＲ方法的建立２．１ＰＣＲ扩増ＰＫＶｓ３Ｄ基因在ＰＣＲ管里依次加入模板叫Ｌ、ｌＯｘＰＣＲＢｕｆｅｒ２．５ｎＬ、２５ｍＭＭｇＣｂ１阵、２．５ｍＭｄＮＴＰ１、引物Ｆ和民各叫Ｌ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５ｉＬ、ＲＮａｓｅＦｒｅｅ組２〇１７，使总体系的冲ｊ冲’’‘’５？ＣｎＣｓＣ体积为２阵。ＰＣＲ反应程序为：Ｓ５５ｍｉ预变性；９５Ｉｍｉｎ变性、５５Ｃ４５退火、７２’’Ｉｍｉｎ延伸３５７２ＣｌＯｍｉｎ终延伸４Ｃ保存备用。阴性对照为ＲＮａｓｅＦｒｅｅ批２〇。，此处个循环；；ＰＣＲ结果用１．２％琼脂糖凝胶进行电泳分析。么２目的片段胶回收目的基因片段参照ＱＩＡｑｕｉｃｋ胶回收试剂盒说明书进行胶回收：（１）在紫外灯下切取目的片段胶块，置丰提前称取重量的２ｍＬＥＰ管，称重后记下差重即’＝为凝胶重量；加３倍凝胶体积（按１００ｍｇ１０〇ＭＵ十）的ＢｕｆｆｅｒＧ，置５０Ｃ水中待凝胶融化；Ｑ一ＢＯＯＯ（２）加入倍凝胶体积的异丙醇，ｒ：转入试剂盒提供的２ｍＬＥＰ管（附制备管）ｐｍ离也Ｉｍｉｎ；２、（３）弃去滤液，将制备管重置１１止６？管，加５００曲的８１近打（＾０，１３０００巧１１１离屯１１１１扯－也弃去滤液；加７００咕的ＢｕｆｅｒＰＥ，静置２５ｍｉｎ，ＤＯＯＯｒｐｍ离Ｉｍ虹；弃滤液后，１３０００ｒｐｍ一新的离也Ｉｍｉｎ；将制备管转移至１．５ｍＬ的指形管，加入５０如＾经ＤＥＰＣ处理的无菌水，’置－２０Ｃ保存备用。２．３目的片段的连接’－ＴＣ取２．２的胶回收产物与ｐＧＥＭＥａｓｙ载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，反应体系置４过－－２０Ｃ。：夜连接，连接后置保存备用连接体系如下３Ｄ基因胶回收产物３ｉＬ｜ＧＥＭ－ＴＥａｓ载体Ｌｐｙ１片２ＸＬｉｇａｓｅｂｕｆｆｅｒ５ｊｉＬＴ４ＤＮＡ连接酶１叫＾Ｔｏｔａｌ１０ｉＬ［ 杨振：江苏地区猪峰病毒感染潇行病学调查和全基因组遗传进化分析３３２．４连接产物的转化（１）ＣａＣｋ法制备感受态细胞。①取过夜新鲜培养的ＤＨ５ａ大肠杆菌菌液，按１：１００的比例转接种于不含氨节的ＬＢ’Ｃ液体培养基中，置于恒温谣床内３７２２５ｒ至对数生长期ｐｍ培养；°、②取出后冰浴ｌＯｍｉｎ，分装入无菌１．５ｍＬＥＰ管中各ＩｍＬ，经５０００ｒｐｍ４Ｃ冷冻离屯５ｍｉｎ后弃掉上清；每管各加２００叫＾预冷的化１Ｍ的ＣａＣｌ２，轻轻悬浮后冰浴３０ｍｉｎ，经４５００ｒｐｍ’４Ｃ冷冻离也５ｍｉｎ后弃掉上清；⑤每管各加ｌＯＯｉＬ预冷的含１５％高压灭菌甘油０．１Ｍ的ＣａＣｌ，重，ｆ２新轻轻悬浮细菌‘‘Ｃ置４Ｃ保存备用。整个过程要在冰上；制备的ＤＨ５ａ感受态细胞最好在４放置化后再用。（２）目的片段的转化①取出２．３的连接产物５阵加到制各好的１００阵ＤＨ５ａ感受态细胞中，用移液器轻轻‘５？吹吸混匀后冰浴３０ｍｉｎ；４２Ｃ热休克９０ｓ取出后立即置冰上２ｍｉｎ左右。振后加入９０（Ｌ；仙Ｉ’Ｃ无氨苹ＬＢ液体培养基，置于恒温摇床内３７１５０ｒ４５ｍｉｎｐｍ培养；、ｍ②取出后４５００ｒｍ离屯５ｉｎ，弃上清后加入２０〇ｎＬ含氨苯的ＬＢ液体培养基悬浮细菌；ｐ‘Ｇ－⑤取悬浮后的茵液涂布含ＩＰＴ（４０ｉ／ｍＬ）、Ｘａｌ（１００／ｍＬ）的ＬＢ平板，置３７Ｃ［ｇｇ帖细菌培养箱中培养至白色菌落出现。２．５阳性质粒的筛选与鉴定２．５．１质粒ＤＮＡ的提取细菌质粒提取参照ＡＸＹＧＥＮ质粒小量制备试剂盒提取：’Ｗ随机挑取ＬＢ培养板白色菌豁转接中至含氨节的ＬＢ培养基，３７Ｃ２２５ｒｐｍ过夜培养；ｌ－４ｍＬ１２０００ｘ离也Ｉｍ５０ＢｕｆｅＳｌ（含巧取培养过夜的菌液，ｉｎ，弃尽上清。加２ｒ，ｇ阳ＲＮａｓｅＡ）悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；３２５０Ｌ－加ＢｕｆｆｅｒＳ２，温和并充分地上下翻转４６次混合均匀使菌体充分裂解，．直至形（）ｎｒ－ｘ成透亮的溶液０ＢｕｆｅＳ３，湿６８，１２０００也１０ｍｉｎ；；加％曲和并充分翻转混合次，ｇ离４吸取步骤４中的离也上清并转移到制备管２ｍＬ离也管，１２０００ｘ也Ｉｍｉｎ，（）（置于，ｇ离弃滤液，将制备管置回离也管，加５００ＢｕｆｅｒＷｌ，１２０００ｘ也Ｉｍｉｎ，弃滤液；阵，ｇ离５将制备管置回离也管，加７００ＢｕｆｆｅｒＷ２，１２０００ｘ也Ｉｍｉｎ，弃滤液；Ｗ同样的（）阵，ｇ离ｕ一ｍＬｘ方法再用７００＾ＢｆｆｅｒＷ２洗涂次。弃滤液，将制各管畳回２离也管中，；ｌ２０００叫，ｇ ３４扬州大学硕去学粒论文离也１ｍｉｎ；’６－将制备管移入新的１．５ｍＬ离也管８０６５Ｃ的高压（），在制备管膜中央加６０咕己加热到’ｍｘ－灭菌的去离子水，室温静置Ｉｉｎ。１２０００也Ｉｍｉｎ，置２０Ｃ保存。，ｇ离２．５．２质粒ＤＮＡ的巧切鉴定’Ｃ使用ＥｃｏＲｌ对提取的质粒酶切鉴定，混匀后置３７酶切化。体系如下；质粒ＤＮＡ５片Ｌｄｄｗ１２，ＬｐＸ１０Ｔａｎｏｂｕｆｆｅｒ２ｐＬｇＥｃｏ民Ｉ１片ＬＴｏｔａｌ２０ｊｉＬ）２．．５．３阳性质粒的测序．．将含有鉴定为阳性的重组质粒的菌液送虹ｖｉｔｒｏｇｅｎ公号Ｉ进行测序，测序结果使用ＤＮＡＳｔａｒＬａｓｅｒｇｅｎｅ．ｖ７．１和ＭＥＧＡ５．０软件分析，并与ＮＣＢ让猪崎病毒相关序列Ｂｌａｓｔ比对，。测序正确的为阳性质粒，保存备用２－．６ＲＴＰＣＲ方法的优化么么１退火温度的摸索’‘’ＰＣ艮反应体系按２５阵反应体系，ＰＣＲ反应程序中退火温度分别为５０Ｃ、＾Ｃ、５４Ｃ、°’’‘５６Ｃ、５８Ｃ、６０Ｃ４Ｃ。，反应结束后保存备用么（５．２ＭＣｈ浓度的摸索：ｇ设反应体系中ＭｇＣｌ２工作浓度为０．５ｍＭ、ｌ．ＯｍＭ、Ｌ５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ，ｓｅ其它成分不变，最后用ＲＮａＦｒｅｅｄＨ２０补足２５咕。２．６．３引物浓度的摸索引物稀释后浓度为ｌＯｐｍｏｉ／＾ｉＬ。反应体系中工作浓度分别为Ｏ．ｌｕＭ、０．２ｍＭ、０．仙ＶＵ０６Ｍ、０．８Ｍ、ｌ．ＯＭＲＮａｓｅＦｒｅｅｄＨ２０２５Ｌ。．片ｎｕ，其它成分不变，最后用补足ｎ２．６．４灵巧性试验用核酸蛋白检测仪来测定阳性质粒浓度，平行测三次，然后取平均值作为阳性质粒的 １杨振：江苏地区猪婿病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析３５’’最终浓度１２３。取５ｉＬ测定过浓度的ＤＮＡ样品，进行１０倍倍比稀释，依次为１０、１０、１（Ｔ、＾ｉ－５－－７－８－６９１０入１〇、１〇、ｌ〇、ｌ〇和１〇的稀释比例。分别取稀释度各１咕作为模板，按照优化好的ＰＣ民条件扩增并巧行电泳分析：，得出核酸最小检出量。按下面公式计算质粒拷贝数６ＸＸＣ＾．０２ｃｏｅｓ／ｍｏｌｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／１１，ｒ、（ｐｉ）（ｇ）＝———ＤＮＡｃｏ—ｃｏｉｅｓ／ＰＬｐｙ（ｐ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ（ｇ／ｍｏｌ）２．６．５重复性试验Ｗ建立的ＰＣＲ方法，对猪峰病毒重组质粒样本重复检测，验证该方法检测的重复性。２．６．６特异性试验Ｔ－ＰＣＲＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＧＡＲＶＣＳＦＶ、ＰＲＲＳＶ、按建立好的Ｒ检测方法各参数，分别取、Ｉ？ＰＫＶＲＮＰＣＶ２、Ｅ．ｃｏ／ｚ模板进斤ＰＣＲ，Ｗｓ阳性ｃＤＮＡ为阳性对照，ａｓｅＦｒｅｅ曲２〇为阴性对照。１＼３结果３．１ＰＣＲ扩增ＰＫＶｓ３Ｄ基因用特异性引物成站的扩增出ＰＫＶｓ３Ｄ基因１－。的片段，大小约为２１７ｂｐ左右图１（）Ｍ１２２〇〇〇ｂｐ■科ｌｏｏｏｂｐ５００ｂｐ２５〇ｂＰ２１７ｂｐｂｌｏｏｐ－Ｃ民ＰＫＶＤ固１１Ｐ扩增ｓ３基因ＩＭＤＬＲＴ－ＰＣ民：２０００１：，２：；阴性对照扩增产物；Ｆ－－ｉ．１１Ａｍｐｌ巧ｃａｔｉｏｎｏｆＰＫＶｓ３Ｄｅ打ｅｂｙ民ＴＰＣ民ｇｇＩ３．２退火温度的确定°５２Ｃ－２根据电泳图可姐退火温度无大的差异，本方法最终选为最终退火温度（图１）。３．３ＭＣｌ浓度的确定ｇ；根据电泳结果得出当ＭｇＣｋ浓度为ｌ．ＯｍＭ即２５阵反应体系中加入２５ｍＭ的ＭｇＣｈ 化扬州大学硕去学位论文－为１阵时为最佑本方法最终选ｌ．ＯｍＭ浓度Ｍｃｂ为反应浓度调３。ｇ１）麵购国駐！２５ｄｂｐ■ＨＨ．ＨＨ■■ＩＨＨ－２图ｌ最佳退乂温度的确定图－Ｍ１３最佳Ｃｌ浓度的确定ｇ；２０００ＤＮＡＭＭ．ＤＬａｒｋｅｒ；．ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ．Ｍ１；阴性对照；‘＿１２ｓｒｅ、５２Ｃ．阴性对照７．ｅ、；退火温度＿、、２０ｍＭ、２７．ＭｇＣｋ浓度Ｏ．ＳｍＭ、ｌ．ＯｍＭｌ．ＳｍＭ．°°－－５４Ｃ．５６Ｃ，Ｃ．５８Ｃ６０２．５ｍＭ，３ｍＭ．０；－Ｆｌ化ｍｉ．１２Ｔｈｅｏｔｉｍｉｚａｔｉｏｏｆａｎｎｅａｉｎｔｕｒｎｅｒａｅ－ｇｐｇｐＦｉｇ１３ＴｈｅｏｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＭＣｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｐｇｂ３．４引物巧度的确定－根据电泳结果，最终确定引物浓度为０４ｉＭｌａ稀释好引物４。．，即反应体系加入（图１）＾＾３．５灵敏性试验视峭ＰＫＶｓ的阳性质粒浓度为１２６３ｎ／ＤＮＡＰＣ民ｇｙＬ，然后取等量的稀释好进行扩增。７试验结果显示，本研究建立的ＰＣＲ方法可Ｗ检测到核酸浓度稀释到１（Ｔ时最小核酸检，即＇４４出量为１，Ｘｓ／。．２６３Ｘ１〇蜡，最小核酸检出量为〇．１２６３ｐｇ３．Ｗｌ〇ｃ〇ｐｉｅ曲１句（图－■Ｉ：：：＊１＾＾简，〇〇ｂｐ２５化ｐ国国ｌｏｏｂｐ－４图１最佳引物浓度的确定图－１５灵敏性检测Ｍ２０００－ｌＭ、０２ＤＬ２ＮＡＭｒＤＬＭ１６？Ｏ．．ＶＩ、Ｍ０００Ｄａｋｅｒ１．；．ａｒｋｅｒ；引物浓度ａ；阴性对照叫ｉ—ｓ２－９？ｘ０？１２６．２６３ｌＯ．４ｉＭ、０．６ｉＭ、０．８ｌＭ、ｌ．ＯｉＭ．３打１＾；核酸含量＾＾＾ｇ－ｎｒｎｒ－Ｆｉ１ＴｈｉｉｖｉＰｉｇ．１４ＴｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｏｆｉｍｅｒｃｏｃｅｎｔａｔｉｏｎＦ５ｅ化ｎｓｔｔｙｏｆＣ民ｐｇ３．６重复性试验一ｃ－对获得的猪赠病毒ＤＮＡ进行多次重复性试验，获得致的检测结果（图６。１） 杨振：江苏地区猪啼病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析１１＿Ｍ１２３４５６Ｍ４５６７８９１２３两鞫－图－６重１７特异性实验１复性试验图ｅｒ１１Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋ．．ＮｅａｔｉｖｅＭＤＬ２０００；阴性对照；ｇＭｒｋｅ１．ａｒ；．阴性对照；ｃｏｎｔｒｏｌ２．ＰＫＶｓ３．ＰＥＤＶ４．ＴＧＥＶ５．ＧＡＲＹ６．；；；；；２－６．核酸重复性检测；ＣＳＦＶ；７．ＰＲＲＳＶ；８．ＰＣＶ２；９．Ｅ．ｃｏｌｉＦ－ｉ１６Ｒｅｅ加ｖｅｅｔｉｎｆｏｒＨＣＶｓｇ．ｐｔｓｇ巧昏－１７ＴｈｅｓｅｃｉｆｉｃｉｔｏｆＰＣ民ｐｙ；３．７特异性试验－按建立好的ＲＴＰＣＲ检测方法各参数，扩增其它病原，该方法不能扩增猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）、猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）、猪Ａ群轮快病毒（ＧＡＲＶ）、猪瘤病毒（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ，ｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｍｓ）、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）、猪圆环病毒（ＰＣＶ２）、猪ｓ。大肠杆菌，只能扩增出ＰＫＶ图＾７（）４讨论一ｒｃｎｅＫｏｂｕｖｉｒｕｓ猪赠病毒（化ｉ，ＰＫＶｓ）是种在猪群中广泛存在的新发病毒，其与仔猪腹湾的关系目前无法确定，但其在猪群中的高感染率引起人们的重视，在对腹湾仔猪病源一Ｒ方法．检测时常作为个参考病原。猪峭病毒目前无法体外分离培养，由于ＰＣ操作简便，－恃异性好，省时，因此实验室对猪峰病毒的检测最常使用的方法是ＲＴＰＣＲ方法。王长松ｉ－ＰＣ民方法建立的检测猪峭病毒的ＲＴ，灵敏度可达１．５４ｆｇ／＾Ｌ。四川农业大学石術建立的－ＰＣ民检测方法灵敏度可达／ｍ－ＲＴｌＬ２泌等根据ＰＫＶｓ的３Ｄ基因建立的ＲＴＰＣ民方法，最ｐｇ；李低可Ｗ检出Ｉｐｇ的病毒核酸，具有较高的敏感性，能够有效地对早期感染猪群进斤诊断和监控３。刘孟良等建立的猪峭病毒ＳＹＢ民ＧｒｅｅｎＩ实时癸光定量ＰＣＲ检测方法，将倍比稀释４好的质粒进行英光定量ＰＣＲ，能检测灵敏度是常规ＰＣＲ的检测极限的１００倍左右。Ｘｉｎｑｉｏｎｇ６Ｌａｎｏｎｉ－ｉ哺ＣｈｇｌｇＬ分别各自建立了针对猪崎病毒犯区基因的ＲＴＬＡＭＰ检观Ｊ方法，该方法操作简便３Ｄ－ＰＣＲ、快捷，并且有较高的检测灵敏度。本研究中针对猪峭病毒基因建立的ＲＴ检测方法检测灵敏度为５．１ｆｇ心Ｌ，重复性和特异性好，虽然没有王长松等人建立的检测方法灵敏度高，但足Ｗ满足对仔猪粪便样本中感染的猪崎病毒进行检测。 ８扬州大学硕ｄｒ学位论文２国外研巧学者针对嘴病毒建立了ＥＬＩＳＡ检测方法，也为崎病毒的研究提供了很好的参考。日本学者通过爱知病毒单克隆抗体建立的ＥＬＩＳＡ的方法可Ｗ在粪便中灵敏的检测出７ＡｉＶ，此方法对病毒分离较为敏感，但市场没有商业化检测试剂盒面市。另外，硏究者通－ＰＡＧＥ等得到了牛赠病毒部分蛋白ＩＳ过ＳＤＳ，建立了ＥＬＡ检测方法，也为峭病毒的研巧８９一提供了进步的依据。田野２０１３年利用表达的猜哨病毒ＶＰ１蛋白建立了检测感染猪群血清中猪峭病毒抗体的ＥＬ一ＩＳＡ方法，为检测血清中猪嗚病毒感染状况提供了种新的思１０路。小ＲＮＡ病毒的３Ｄ基因编巧的蛋白最为稳定，因此针对猪峰病毒表达其３Ｄ蛋白建立相应的免疫学检测方法可用于大量样本的检测，＾＾。（检测猪崎病毒的流行状况参考文献１王长松，兰道亮，华修国．猪赠病毒ＰＣ民检测方法的建立及其应用．中国动物检疫，９－３２２０２９口）：２（１２）．２石－術．猪晴病毒ＲＴＰＣ民检测方法的建立及四川省流行病学调瓷四川农业大学，硕±论文（２０１２）．－巧（８３李泌，朱玲，等．猪晴病毒ＲＴＰＣＲ检测方法的建立及应化中国兽医学报）：－１１５０１１５３２０１３．（）４刘孟良，王潇涕，等．猪崎病毒ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ实时巧光定量ＰＣＲ检测方法的建立－３（０３）．中国兽医科学４；Ｗ１２６５２０１３（）－５Ｌ－－ｉＸ．ＺｈｏｕＹ．Ｋ．ＸｕＺ．＆ＺｈｕＬ．Ｏｎｅｓｔｅｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎｌｏｏｍｅ，，，，，，，ｐｐｐｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｂｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｐｓｏｕ－ｌｏｆｖｉ５１ｔ２０．１ｏｂｕｖｉｒａ．Ｊｒｎａｒｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ２０７１ｄｏｉ：１０．１０６／．ｖｉｒｏｍｅ．１４．０６０，，ｊｊ２２０１４．（）６ＬｉＣ．巧ａｌ．艮ａｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒａｓｉｎｆｅｃｅｓｂｒｅｖｅｒ化ｔｒａｎｓｃｒｉｔｉｏｎ，ｐｐｙｐ－－ｍｅｄｌｏｏｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｏｕｒｎａｌ１１７３ｄｏｉ：ｌ０．１１８６／１７４３ｐｐｇｙｊ，，－４２２Ｘ＂－７３ＯＭ口．）７Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｔ，Ｓａｋａｅ，Ｋ．，Ｉｓｈ化ａｒａ，Ｙ．，Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｓ．＆Ｕ化ｇａｗａ，Ｅ．ＰｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｎｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄｃｔｏａｔｈｉｃｓｍａｌｌｒｏｕｎｄｖｉｒｕｓｉｃｈｉｓｔｒａｉｎｉｎＪａａｎ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｃＨ，ｙｐ（Ａ）ｐｎ巧３８－ｉｃａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ３１２９４３９９３．ｇｙ，。）８Ｙａｍａｓｈｉｔａ．ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏ打ｏｆａｎｅｗｉｅｓｏｆｋｏｂｕｖｉｒａｓｊＴｓｐｅｃ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃａｔｌｅ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｅｎｅｒａｌｖｉｒｏｌｏ８４３０６９３０７７口００３．ｇｇｙ，）９田野．猪晴病毒ＶＰｌ基因克隆与表达及抗体检测ＥＬＩＳＡ方法的建立．扬州大学硕±论文２０１３．（）１０Ｔａｐｐａｒｅｌ，Ｃ．，Ｓｉｅｇｒｉｓｔ，Ｆ．，Ｐｅｔｙ，Ｔ．Ｊ．＆Ｋａｉｓｅｒ，Ｌ．Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｕｓａｎｄｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓｄｉｖｅｒｓｉｔｙｗｉ化犯ｓｏｄａｔｅｄｈｕｍａｎｄｉ化ａｓｅｓ．Ｉｎ佐ｃｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｏｕｒｎａｌｊｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓｉｎｉｎ色ｃｔｉｏｕｓｄｋｅａｓｅｓ１４２８２，－２９３ｄｏｉ：１０．１０１６／．ｍｅｅｉｄ．２０１２．１０．０１６２０Ｕ．，ｊｇ（） 江苏化区猪峭病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析杨振：３９第二章猪腹泻病原混合感染检测及猪峭病毒３Ｄ基因和ＶＰ１基因特征分析Ｄ－用建立的猪峰病毒３基因ＲＴＰＣ民检测方法对２０１２年８月至２０１３年１２月从江苏１３个地区４６个猪场采集的３％份猪腹泻化拭样本进行检测。结果显示猪场阳性率和病料阳性率分Ｉ８０Ｄ男Ｊ为．４％和４５．７％。随机选取１９份病料进行猪嚼病毒３基因分析显示犯基因的核昔酸和￣￣氨基酸相似性分别为８８．０％１００％和６９．４％１００％，进化树分析显示不同地区的猪峭病一一毒３Ｄ基因处于同分支，说明江苏地区猪晴病毒没有定的地里限制。１８５份病科经检测发现含有巧巾及两种ｙＸ上其它病原，其中有６８份ＰＫＶｓ病料检测阳性的样本有３１份检测到其它病原。使用设计的针对猪崎病毒ＶＷ基因的特异性引物，对２０１４年８月至２０１５年２月从江苏地区采集的９１份腹泻仔猪棉拭样本和１２６份临床健康仔猪棉拭样本进行检测，腹泻仔猪猪峭病毒感染率６４．８％５９／９１；临床健康仔猪感染猪峭病毒感染率为１９．８％２５／１２６。随机（）（）２８ＶＰ￣１选取２８个ＶＰ１基因测序分析显示，个１基因的氨基酸同源性为８０．３％００％，核昔酸同７９６％￣源性为．１００％。进化树分析显示，２８个ＶＰ１基因分为四个群，其中腹泻猪感染的猪崎病毒ＶＰ１基因分布在四个不同的群；所有临床健康猪群感染的猪崎病毒ＶＰ１基因分布在同一个群并显示较近的基因同源性一定。结果表明江苏地区腹泻猪群中流行的猪曠病毒表现的基因多样性，而临床健康猪群中则不然。挂种差异可能与猪崎病毒的潜在致病性有关。１材料与方法１．１材料１１．．１病料来源和处理２０口年８月至２０１３年１２月从江苏１３个地区的４６个猪场采集３９６份腹泻仔猪棉拭和肠道样品，２０１４年８月至２０１５年２月从江苏１３个地区的猪场采集的９１份腹辑仔猪的棉拭样本和１２６临床健康仔猪棉拭样本。棉拭样本置经ＤＥＰＣ处理后无ＲＮＡ酶的１．５ｍＬ指一＝ｘ＝８００Ｈ７．，形管レＰＢＳ．２稀释道样品研磨后加定量ｌＰＢＳＨ７２制成悬液，用件（ｐ）；肠（ｐ）°－置经ＤＥＰＣ处理后的１，Ｃ冻存。．５ｍＬ指形管样品于７０１１．．２主要试剂ＴＲ－ＩｚｏＩ剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏ转录酶ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｔＩＩＩＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＳｎｔｈｅｓｉｓＳｓｔｅｍ试ｇｅｎ公司；反ｐｙｙ ４０扬州大学硕壬学位论文Ｉｎ－购自ｖｉｔｒｏｅｎ公司ＤＥＰＣ购自巧ａ公司；ＧＥＭＴＥａｓｒｏｍｅａ；ｇ；ｇｍｐｙ载体为Ｐｇ公司产品ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ为Ｔｈｅｒｍｏ公司产品；切酶仿ｏＲＩ、必２０Ｉ、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＬＡＴａｑ酶购购自扣必公司；质粒ＤＮＡ提取试剂盒购自Ａｙｇｅｗ公司；凝胶回收试剂盒购自ＱＩＡｑｕｉｃｋ公司；ＤＨ５ａ感受态细胞由本实验室保存。１．Ｌ３主要仪器同研巧内容一１．２方法１．２１．引物设计分别根据ＰＫＶｓ、ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ和ＧＡＲＶ参考毒株设计的特异性引物，对样本中不－－ＰＣＲ检测。同病原进行ＲＴ，引物信息见表２１表２－１：ＰＫＶｓ、ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＧＡＲＶ，用于ＰＣＲ扩增的引物序列，，Ｔ－Ｍａｂｌｅｒｉｍｓｕｓｅｄｆｏｒａｍｔｉｏｆ、、２１ＰｅｒＰＣ民ｃａｏｎＰＫＶｓＰＥＤＶＴＧＥＶ、ＧＡＲＶ．ｐ＇－病原引物序列５－３产物大小参考毒株＇＇－－－Ｓ－－３ＤＦ５ＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＴＧＴＴＴＴＧＡＴＧＣ３１ＨＵＮ：ＰＫＶｓ２１７ｂｐ＇＇３Ｄ－Ｒ－－：５ＡＴＧＴＴＧＴＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＧＡ３ＮＣ０Ｈ８２９（）＇＇－－－ＶＰ－Ｓ－ｌＦ：５７ＭＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣ３ｌＨＵＮＰＫＶｓ７７８ｂｐ＇＇－ＶＰ－－ｌＲ：５ｒ＾ＣＴＣＧＡＧＴＴＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧ３（ＮＣ０１１８２９）＇＇－－Ｆ－：５ＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＧＡＴＴＴＳＷＨｌＴＧＥＶ５１０ｂｐ＊＊Ｒ－－：５ＡＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＧＡＴＣＣＡＧＡＣＧＴＴＡＧＣＴ３ＨＱ４６２巧（。＇＇Ｆ－－：５ＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＴ３ＣＶ７７７ＰＥＤＶ巧Ｏｂｐ＇＊－－ＧＴＴＴＡＧＡＣＴＡＡＡＴＧＡＡＧＣＡＣＴＴＴＣ３ＡＦ３５３５Ｒ：５１１（）＇＇－－ＦＪＬ９４：５ＴＧＧＴＡＴＴＧＡＡＴＡＴＡＣＣＡＣＡＧ３ＧＡＲＶ８０２ｂｐ＇’化－－：５ＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＣＣＣＴＴＴＡＧＴＴ３（ＡＹ５Ｕ６３巧１．２．２总ＲＮＡ的提取处理好的样品按ＴＲＩｚｏｌ说明书步骤提取总ＲＮＡ；’’－２０ＣＣ２（１）取１．１处理好样品在冻融２次，在祸旋仪锅旋混匀后４１０００ｒ／ｍｉｎ离５ｍｉｎ也１；（２）取上清液３００阵于无ＲＮａｓｅ的１．５ｍＬ离也管中，然后加入７００阵ＴＲＩｚｏｌ，翻 杨振：江苏地区猪峰病毒感染流行病学调查和全基因纽遗传进化分析４１＿ｍｉｎ转混均，静置５！’０）加３００咕的氯仿（；氯甲焼），翻转海均，静置５１１１如然后４（：１２０００［／？山１、离屯１５ｍｉｎ，取上清液７５０ｐＬ，加入等体积的异丙醇，翻转混均，静置１０ｍｉｎ；’（４）４Ｃ１２０００ｒ／ｍｉｎ离也１０ｍｉｎ，弃掉上清液，加１ｍＬ预冷的用ＤＥＰＣ水配制的７５％的乙醇，静置１０ｍｉｎ；’、ｍ（５）４ＣＭ２０００ｒ／ｍｉｎ离屯５ｉｎ弃掉乙醇，待其挥发完全后，加３０典ＤＥＰＣ处理的—‘－Ｃ。的ｄｄｗ溶解，反转录或者７０保存备用１．２．３ＲＮＡ的反转录一１２３进巧。参照研究内容．．１．么４ＰＣＲ检测样本中ＰＫＶｓ‘一建立的ＲＴ－ＰＣＲ方法Ｃ根据研充内容，扩增ＰＫＶｓ３Ｄ基因的ＰＣＲ反应程序为％，’■■ｔ‘‘‘‘５ｍｉｎ；９５Ｃ１ｍｉｎ，５２Ｃ４５ｓ，７２Ｃ１ｍｉｎ，３５个循环；７２Ｃ延伸ｌＯｍｉｎ。在ＰＣＲ管里ｘ依次加入模板１曲、ｌ〇ＰＣＲＢｕｆｅｒ２．５曲、２５ｍＭＭＣｌｌ阵、２．５ｍＭｄＮＴＰｓｌ、Ｆｇ２片Ｌ引物和民各１曲、ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５咕、ｄｄｗｌ７ｎＬ，使总体系的体积为２５阵。１．２．５ＰＣＲ扩増其它病原１８５ＤＮＡＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ和ＧＡＲＶ进使用设计的特异性引物，选择反转录好的份ｃ对斤ＰＣＲ扩増。°’°’ＴＧＥＶ体系为２冲Ｌ，厉应程序为９４Ｃ，５ｍｉｎ；９４Ｃｌｍｉｎ，５５Ｃ４５ｓ，７２Ｃｌｍｉｎ，°Ｕ３５７２ＣｌＯｍｉｎ。个循环；延伸’＂°Ｃ’ＰＣＲＧＡＲＶ体系为２５，反应程序为％，５ｍｉｎ９４Ｃ４５ｓ，５４Ｃ４５７２Ｃ扩增咕；ｓ，‘１ｍｉｎ，３５个循环；７２Ｃ延伸１０ｍｉｎ。。’°’ＰＣＲ扩増ＰＥＤＶ体系为２５冲，反应程序为％Ｃ，５ｍｉｎ；％ＣＩｍｉｎ，５７Ｃ４５ｓ，７２Ｃ巧。１ｍｉｎ，３５个循环；Ｃ延伸１０ｍｉｎ。试验中所用阴性对照为高压灭菌的ＲＮａｓｅＦｒｅｅ姐２０，阳性对照为经Ｔ克隆测序分析为相关病原的阳性ｃＤＮＡ。１．么６琼脂糖凝胶电泳ｏｘ配制１．２％的琼脂糖凝胶０．３６Ａａｒｓｅ，３０ｍＬｌＴＡＥ缓冲，用电子天平称取ｇｇ粉加入撤用微波炉融化取ＰＣＲ产物，用ＤＮＡＬａｏｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ处理后用微量移液器加样进行 ４２扬州大学硕壬学位论文电泳分析。２ＰＫＶｓ３Ｄ基因和ＶＰ１基因的测序分析２．１目的基因的扩増选取经ＰＫＶＳ３Ｄ基因引物检测阳性的样本，用ＬＡＴａｑＤＮＡ聚合酶扩増３Ｄ基因ＶＰ１‘’°°‘基因。反应程序为９４Ｃ，Ｉｒａｉｎ；９４Ｃ，３０ｓ，５２Ｃ，３０ｓ，７２Ｃ，２ｍｉｎ，３５个循帝７２Ｃ延伸５ｍｉｎ。按下列体系分别加入反应组分：ＲＮａｓｅＦｒｅｅ細２〇３１Ｌｐｌ〇ｘＬＡｂｕｆｆＴａｑｅｒ５ｘＬｊｄＮＴＰｓＭｉｘ２．５ｍＭＬ（）叩ＰＫＶｓ－Ｆ２ｌＬｉＰＫＶｓ－Ｒ２Ｌｉｊ’？．已￣？ＬＡＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５冲ＴｅｍｐｌｅｔｅｃＤＮＡ１．５ｉＬ｜Ｔｏｔａｌ５０ｐ．Ｌ２．２目的基因的巧隆ｕｉｃｋ扩増好的目的基因片段参照ＱＩＡｑ胶回收试剂盒说明书进行胶回收，回收产物与’一ＧＥＭ－ＴａｓｐＥｙ载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶置４Ｃ过夜连接。连接体系参照研究内容。５ａ感－将连接好的产物转化至ＤＨ受态细胞，涂布含ＩＰＴＧ（４０＾ｉｇ／ｍＬ）、Ｘｇａｌ（ｌＯＯｎｇ／ｍＬ）‘的ＬＢ平板，置３７Ｃ细菌培养箱中培养至白色菌落出现。随机挑取白色菌落接种到含Ａｍｐ＋的ＬＢ培养基，过夜培养后使用Ａｍ？位Ｖ质粒小量制备试剂盒提取质粒并使用妨〇民Ｉ和酶切鉴定。２．３阳性质粧的测序和同源性分析将含有鉴定为阳性的重组质粒的菌液送Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司进行测序，每份菌液至少测序２２。ＤＮＡＳａｒＬａｓｅｒｅｎｅｖ７ＧＡ５０次测序结果使用ｔ．．．１和ＭＥ．软件分析ＮＣＢ让ＰＫＶｓ相关序ｇ，并与列Ｂｌａｓｔ比对，将获得的１９个犯基因序列和２８个ＶＰ１基因序列分别命名上传到ＧｅｎＢａｎｋ。３结果３．１ＰＣＲ检測样本中ＰＫＶｓ 杨振：江苏地区猪傅病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析４３使用设计的？１＜：￥３３０基因，使用２５＾ｉＬＰＣ民反应体系，对病料中感染的ＰＫＶｓ检测，ＰＫＶｓ３Ｄ－。成功扩增出了基因，大小约为２１７ｂｐ图２１（）Ｍ？Ｑ…１２３４６７１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０２１＾＾＾＿５００ｂｐ２－Ｄ基因的ＲＴ－ＰＣＲ图１猪婿病毒３扩增－巧ＰＣ民２化２Ｍ：ＤＮＡ分子质量标准；１：部分样品扩增产物；阳性对照；１：阴性对照Ｆ２－－１ＡｍｌｉｆｉｉｂＲＴＰＣＲｉｇ．ｐｃａｔｏｎｏｆＰＫＶｓ３Ｄｅｎｅｙｇ３．２ＰＣＲ检测其它病原’使用设计的ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＧＡ艮Ｖ特异性引物巧１８５份反转录好的ｃＤＮＡ进行ＰＣ民。０ｂ－１０ｂ８０２２。扩增，分别得到３７ｐ，５ｐ和崎的目的条带调巧Ｍｌ１２３Ｍｌ１２３Ｍ２１２３４５６７Ｐ瑪薩｜叫画圓１１１１；；苗皆￥漏ＩＰＰＰＰＩＰＥＤＶＰＲｏＶＴＧＥＶ－－图２２ＰＥＤＶ、ＧＡ民Ｖ、ＴＧＥＶ部分样品的ＲＴＰＣ民栓测检测结果ＭｌＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００ＧＡＲＶ，１：样品序号２：３：：；；阴性对照；阳性对照ＤＮＡＭＤＬ２０００－ＴＧＥＶＭ２１３，：ａｒｋｅｒ；：样品序号ＰＥＤＶＮＡＭｒｒＫｂ１－７，Ｍ２：Ｄａｋｅｌ：２氏样品序号：；阴性对照；；阳性对照２－－Ｆｉｆｉｉ、、ＧＡ民ＶａｉａｌｅｎｅｂＲＴＰＣ民ｉｇ．２ＡｍｐｌｃａｔｏｎｏｆＰＥＤＶＴＧＥＶｒｔｇｙｐ３．３阳性率统计８ＰＫＶｓ阳２－３经检测江苏省１３个地区３７个猪场的１１份病料检测为性（图），猪场阳性率和病料阳性率分别为８０．４％和４５．７％。选取另外的１８５份病料经检测发现含有２到３种其它病原，其中巧份样本检测发现只含有ＰＫＶｓ（２０％），６８份病料检测为ＰＫＶｓ阳性的 ４４扬州大学硕去学位论文。样本有３１份检测到含有其它病原，其中ＰＫＶｓ与ＰＥＤＶ的混合感染率最髙，为８７．１％９１１２６对采集的份腹泻仔猜样本和份临床健康仔猪粪便样本进行检测，结果发现，腹泻－仔猪ＰＫＶｓ感染率为６４．８％５９／９１，髙于２０１２２０１３年江苏地区ＰＫＶｓ感染率４５．７％（；临（））ＰＫＶｓ９８％２５／１２６。床健康仔猪感染感染率为１．（）２－２表２０１４年８月至２０１５年２月采集的江苏省不同地区样本统计。了６－２２Ｒｅｉｏｎｓｌ：ｅｓｔｉｎｇｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒＰＫＶｓｂｅｔｗｅｅ打２０１４ａｎｄ２０１５．＿挪ｇｐ￣￣样品来源腹湾巧猪非腹辑仔猪ＳａｍｌｅｓＤｉａｒｒｈｅｉｃｉｌｅｔｓＡｓｍｔｏｍａｔｉｃｉｌｅｔｓｐｐｇｙｐｐｇ扬州６１５泰州１１１４盐城１４３０如皋５８连云港２１８宿迁口１７沐阳９０滨海１１３常州１０海安１１２１总计９１１２６阳性率６４．８％（５９／９１）１９．８％（２５／１２６）心？、Ｓａ历ｅｓＳｏｕｒｃｅＰｏ別ｔＷｅＲａｔｅ）口曼…ＩｒＧａｎｕ１５％３／２０）＼＾／ｙ（．Ｊ２：Ｈａｉ浊ｏｕ８８０％２２／２５）（）心Ｉ３：Ｇｕａｎｙｕｎ６０．０％４８＾（）（４；Ｓｈｕａｎ．０％ｙｇ５０１１／２２（）＼＾ｆ５：Ｇｕａｎｎａｎ１５＊８％（６／３８）＾＼＼６：执她站４１．８％３３／７９＜）７：Ｄａｆｅｎ７７ｇ．８％７／９ｙＣＴＤ（）／ｉ？８：Ｘｉｎｇｈｉｉａ＂．８碟（４／２９ＪＪ＞＼９：Ｄｏｎｔａｉ３７３％３／８ｇ＜）、Ｉ？巧：ｎ／１０Ｙａｚｈｏｕ８４．６％ＩＪ１３ｇ＜）飞）＂？１１：側孤４６．２％（２４／５２产＾入Ｖ＇）＼、’…立。２Ｒｕａｏ７８４／１７＾＾１：ｇ．１％（）：２５＼Ｃｈａｎ．０％Ｍ？ｙ。ｇｚｈｏｕ＂）＾＇￣＾Ｋ／？－２３－１图２０１２年２０３年采集的江苏省不同地区猪峭病毒阳性率分布。－Ｆｉ２３Ｒｅｉｏ打Ｓｔｅｓｔｉｎｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒｉｔｈ＾ｈｉｎａｇｇｇＰＫＶｓｎｅａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅｏｆＣｂｅｔｗｅｅｎ２０１２ａｎｄ２０１３．ｐｇ 杨振：江苏地区猪啼病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析２－３表：临床猪腹泻样本中其它病原检测结果。Ｔ－ａｂｌｅ２３Ｄｅ化ｃｔｉｏｎｌｏｆｅｎｔｅｒｉｈｏｅｎｒｅｓｅｉｉｃｌｒｒｒｅｓｕｔｓｃｐａｔｓｎｔｉｎｃｌｎａｌｓａｍｅｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｄｉａｈｅｉｃｉｓ．ｇｐｐｐｇ虹拓ｃｔｉｏｎＴｙｐｅＰａｔｈｏｇｅｎｓＰｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅＰＫＶｓ２０．０％３７／１８５（）。７．巧／…方齡）Ｓｉｎｇ６ｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎＴＧＥＶ３．２４％／１８５巧）ＧＡＲＹ０．５４％１／１８５（）ＰＫＶｓ＋ＰＥＤＶ８．６５％１６／１８５（）－Ｍ山ｔｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎＰＫＶ汁ＧＡ民Ｖ０．５４％。／１哟ＰＫＶｓ＋ＴＧＥＶ０．５４％１／１８５（）３．４ＰＫＶｓ３Ｄ基因和ＶＰＩ基因的测序分析义４．１３Ｄ基因和ＶＰｌ基因的扩増用ＬＡＴａｑ高保真酶扩增猪崎病毒犯基因目的条带，ＰＣＲ反应体系为５０曲，获得了的犯灌因片段和约为７７８ｂ－４约为２１７ｂｐｐ的ＶＰ１基因片既电泳图片图２：ＭＭ１２１２３■■■－：Ｓ２５卿２ｉ７ｂＢＢＳＷｐ购圓圓Ｉ图２－４猪嘛病毒犯基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩増－：１、２：ＲＴＰＣＲ３ＭＤＮＡ分子质量标也扩增产物：；阴性对照；巧２－４－ＡｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＫＶｓ３ＤｅｎｅａｎｄＶＰ１ｅｎｅ民ＴＰＣ艮运ｐｂｇｇｙ３．４．２目的片段的酶切鉴定对目的片段参照研究内容一方法进行回收、Ｔ载体克隆后酶切鉴定，使用￡ｃｏＲｌ对提 ＾扬州大学硕壬学位论文取的重姐犯基因质粒酶切鉴定，使用仿ｏＲＩ和斯〇Ｉ对提取的重组ＶＰ１基因质粒酶切鉴‘定，３７Ｃ酶切４ｈ，酶切产物用１．２％的琼脂糖凝胶电泳检测。３Ｄ基因重组质粒酶切鉴定体一Ｐ２－１基５：系参照研究内容，Ｖ因重组质粒酶切反应体系和酶切鉴定结果如下（图）ＶＰ１基因质粒ＤＮＡ３０ｘＬ｜ｄｄｗ２ｉＬｉ１０ＸＴａｎｇｏｂｕｆｆｅｒ４＿ｉＬ｜ＥｃｏＲＩ２ｉＬ＼ＸｈｏＩ２咕Ｔｏｔａｌ４０［ｉＬ．ＭｌＶＰｌＭ２．＇＂誦化Ｍｌ１２３４５６７８９１０１１Ｍ２早Ｐ｜｜｜福眉２－ＶＰ图５犯基因和ｌ基因重组质粒酶巧电泳图２ａ－Ｍｌ：５０ｂＤＮＡＭｒｋｅｒ１１１ＶＰ１：２：ＩＫｂＤＮＡＭａｒｋｅｒｐ；和重组质粒；ＭＦ－ｍｍＩｃａｉｅｃｏｍｂｎａｎｒｅｒｃｎｚｅｓｎｉｇ２５ｄｅｎｔｉｆｉｔｏｎｏｆｒｉｔｌａｓｉｄｂｙｓｔｉｔｉｏｎｅｅｄｉｔｉｏｐｙｇ３．５目的片段的测序分析３．５．１同源性分析将鉴定阳性的３Ｄ基因重组菌送虹ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序，测序结果用生物学软件分析后选ｓ－ｒｃ择与Ａｃｈｉｖｉｒｕｓｏｖｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓ／ｌＭＳｈｅｅｋｏｂｕｖｉｍ／ＴＢ３ＨＵＮ，Ｐｏｉｎｅｉ，Ｂ，ｐ－－－ｋｏｂｕｖ－ｉｍｓ／ＳｌＨＵＮ，Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｖｉｏｕｓ／Ｙ１畑参考序列的犯基因进行核巧酸和氨基酸同２－４）源性分析，１９个ＰＫＶｓ３Ｄ基因的核昔酸和氨基酸同源性分别为，根据分析结果（表￣￣００－－－－？８８．０％１００％和６９．４％１％。与Ｓ１ＨＵＮ和Ｙ１Ｃ出的核昔酸同源性分别为９０．３％９５．９ 江苏地区猪踏病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析４７杨振：＿？ｃｈ％和８８．０％９４．９％。当与其它崎病毒在核昔酸和氨基酸水平比较发现与Ａｉｉｖｉｒｕｓ的核６９？？？巧酸水平分别为．６％７３．７％和２７．８％４３．１％与Ｂｏｖｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓ分别为７２．８％７６．０％，〇￣？？％和４３．１％５０．０％Ｓｈｅｅｋｏｂｕｖｉｍ％．５％７８乂％８．６／〇．９％。ＢＬＡＳＴ，与ｐｓ为和４分析发现３４５６７８本研究中的ＰＫＶｓ３Ｄ基因与之前的中国、泰国、日本、韩国、意大利及荷兰的？核巧酸同源性为９２．０９７．０％。－６２－７选取有代表性的２８个＼Ｔ１基因序列进行核昔酸和氨基酸同源性分析（图２，图）。８８０－－结果显示．３％１００％，７９．６％１００％。，２个ＶＰ１基因的氨基酸同源性为核巧酸同源性为—？ＳｈｏｋｏＯｋｉｔｓｕ７８ｅｎａｎｋ其中核昔酸同源性与等报道的．８９９．８％致但比ＧＢ中的数据，－－－－￣８４．３％１００％稍低。将ＶＰ１基因与参考株Ｓ１ＨＵＮ（ＮＣ０１１８２＾、Ｙ１ＣＨＩＧＵ２９２５５＾、（－－ＧＱ２４９－－Ｋ３０ＨＵＮ（１６１）、ＳＨＷＣＨＮ（ＪＮ６３０５１４）比较发现在本研究中的ＶＰｌ基因序列的－７１０ｎｔ有Ｈ个碱基的插入（图２８）。．■＇Ｌ＇１２３４５６７Ｂ９１０１１１２１３１４１Ｓ１６１７１８１９２０２１巧Ｉ２３２４２５２６２７巧ＩＩ寸￣＇＇｜｜ＩＩ品＝９９．Ｄ＾志９＾４．４３９９００．０８５．３８６Ｊ８Ｍ８５．６８９．４９８．８７，３８６而．３１Ｄ〇Ｔ，３９９．２１ＪＳ１３０１２如目３８ｊ３日９＾３１＾＾１＾品品的）＾，―！＾＂＾＊＾＾＊？，可，＾逗＾品Ｊｉ；８２，０ｅＯ化：＾８１．６８１７８品的．目拉０的．＾化３化＾ｉＵ閒．６８３．１８３．３ｌ支３扣．９ｉ＾．４帘．９８３．１化［＾８３７刖．＾８２．４而ｉｌｌ２．［）ＪＳ１４０１（ＫＰ２９６９２４）［＊■ｙ，＊，｜＇’，｜，＂■互｜飞ｒｉ．，．．，．ｒ’，ｉｙｊＵｉＪ雨７部７祐报ｒｉｉ万巧１９９１巧１化９的４而０化２Ｓ日巧９目１９８７ＴＪＳ１川２蛛巧巧巧￣￣＾ｐ广，’而，．‘＿＇，ＴＰ＾ｈ．６ｍ９８．３］８３．＾化６＾８品９＾＾＾．５化４８６１．８５１古打品而ｐＴｓ品￡１品Ｂ５言品Ｔ福甘＊品广９８＿２４化＂０３（ＫＰ２巧＂６）—－￣’＾｜＾＊＾，胃Ｆ了１Ｔ引７５７Ｌ２ｌｉｓｒ．ｉ８５．９Ｉ９．５品ｆ帘ｉ９９．９＾Ｔ９＂化＂＂蛛２巧巧。■ｒ而－？￣＇＂＇＂．！，品立广ｉｊ０．９誦９８．８化ｆ９９－１化８‘４３５‘８８５：１８８８品０９８．〇８６７８５，５９８．８８５．６扣－化＂０５（ＫＰ２ＷＷ８ＩＴ攝车）７＾岛曼毎■韦＊＊＾Ｔ７２２／１．６２．．２巧．３化５如．Ｓ９８．６８２言％８置ｒ化２占４亢６化３ｌｓ．４９７．８化＊８５７６８５．２３９９．０３８．２９８＇２７化１４０８（ＫＰ巧６日巧ＱｌｉＪｉｌｌ１￣＾￣帝＾｜节，＂■１，，ＴＴｌｉＴｙＴＴＩ．？０．厂１．５１７ＵｌｉｉｌｉＴ贵苗９９．ｒ目３．４视１１＾８化４８５．广品Ｉ而０１８．２￣日赢品．８ｊ扣．９１９９．３的．ｒｋｓ８化＂０７（ＫＰ２巧口０）ＩＩ，，，ｉ，Ｉ１３．７１８．１１９．０ｉ１９．２ｌＩｓＨｉ８４Ｔ８４．４９９．ｒ８品化０７３．６而品８７．７８６．５８３ｊ８８．３ｋｓ品打７品．｛ｓＧ８４．３９巧＂邮（ＫＰ巧６蝴！）？｜ｊ｜，｜｜，，．，，，］化＂０ｇＫＰ２巧。２（）＇＇￣＊￣＂＊￣￣ａ４２ｉ７５ＩＦｌｉ１＾Ｔ２Ｔ５ｉＴｉ＾８１１１扣．７］品３８由ｒ品ｉ目目品ｒ８６＇４３日ｉＶｌ品站．日＾＇２Ｓ９．ｒ９８Ｊ品８＾１１脚＂Ｄ（ＫＰ２如。。＊＊＂ｊ，＊‘｜￣，｜，ｒ；．．．化４ｉ．．．．．。．８目．日２．７．８的．５－２．７１３－化巧。ｉｎ？１８８１９０５１９Ｔ８Ｂ白１ＥｓｌＨ巧３］８３５削ｌｌＯ８８７１８８７３８８！８３９品７１２１４１１ＫＰ２＊（一Ｉ｜，■，，吊．，’，非＾ｉｏ２訂ｒ口７而；ｌｌｉ８Ｍ］１品０＾１８六９品３８７品１１品０９品品３１３巧１４１３师巧６。巧＿＊￣．－，＂与＾苗味［！…１＾１１．品．．石吊．＾４１６．８１７．３１８－〇１７３１１６．６１７．２７．８口３！化扫刖．１８４９１８Ｕ８４９日Ｍ．Ｓ３４１扫３化９．９１４化＂１４阳２巧。。■ｊ￣，’＇＂，■，，，，，：化３化３化６化。６而９３５．ｒＴｌ．Ｂ１［８布１１１．８１２．０１１．４化６２７．１］０．Ｑ７５７５．３巧．９８品７品Ｉｓ．Ｏ．８扣‘２品Ｆ巧化１４１２蛛別６日姆ｉｉｉ＾｜￣＂｜＂，，！，，，，ｉｒｒｒ＾ｒＴ＾ｉＴｌ５＇９ｕＴＴ５．６＂下…而化＊省品巧ｌ９刖．０化２７＾品品＇ｉＴｋｅ８巧雨．〇ｌ＾ｉＰ说４０２３件巧巧…］（￣￣皆确圍｜却—节而＾，，＂，化＾１６．０巧—３１Ｅ．５１６．ｒｗ．２７１４．５１６．２１６．２３－３１４．３ＩＳＪＵＳｉｌ阳．２９日．２化７３Ｄ．２３日．５２３０．６８８．９８５．６化４化４１７ＪＳ１＂５蛛別６巧１巧Ｊ或｜｜｜吊｜｜｜｜｜｜，＊，１■１２立化＾＾品．〇＾．〇ｓｇｉｆｌｇ．ｉＴ１８■ｊｓ＂ｉ目蛛２化＂巧＇＇￣＂瓦，＾＂，Ｔｓｌ＾ＴＴｅＪＴｅＴｉ１５．ｓＴｅＦｍｒｉｓＪｌｉｒｉｓ．ｓｌｅ．ｏＴｉｉ１５．７＾ｕｆｊｃｉｅｉｗ．２！８９．ｒｉ＾ｉ日９．１＾．１ｓ目品Ｔ？化＂ｉ７（ｋｐ巧６ｓ＂）＾…ｊ１＂＾＾，；１．２２２．日，．７ｉｒｒ２０。志品ｉ７布８１立１化２而．４Ｓ８．ｒ而劝化＂ｉ８ｋｐ２巧画（ｒ－？］可￣帝巧瓦吊ｒ町１￣￣＊＂＇＇！Ｉ的ｕＪ１品７而＾４了而巧而。目１品口．８ＴＴＴｃＪ３７ｉ〇．８１５．６９８．２８６去品导６７．３＾抗．９引化１４１９畔巧的４３而＾ｉ｜Ｈ）而｜１＊与＊可￣＾￣，，＾￣Ｔ？Ｔ＾ｎｉｉ＾＾ｉ５．６？＾１６．８ｒｉ５．９１１５．６１５．ｎｊｉ７Ｕ．ｒ＂．４＾Ｄ．［ｌｍ４５ｊ３Ｕｒｉ＾＾ｌｉＨ雨而７化１４２０（ＫＰ２巧９４。ｙ．，＊＾－，．，ｆＦ方＂飞心芯广立户瓦而而而丽瞧挪敲师ｒ赢品化＂＂（ｋｐｓ巧———．作＾＊ｙ一两雨Ｉｌｉｎ芯谅扁１５４扁１品ｉｌｉｉｉｉｒｉｓｊ？５．ｒｉ３．１１３＾１８．２；３．７０．４１口．寺占２１２。６韦Ｕ日．３点ｓｉｎ品霉．１＇硕８２４化＂。ＫＰ２巧９４巧（．，，，吊，．ｉｒｒ，’ｒＩ＾７＾．３＾ｉ４ｉ＾＾＾５．１Ｔ；；＾９１４．＂．９Ｈ．ｉｉ〇１９．５ｎ．３１０＇１１２＇３＂ｉ４＇６＾脚。３（ＫＰ巧柳７）￣￣￣—￣一＂，￣￣－｜ｙ＂—＂｜ｉ，一，一，，＂＊打５ＦＴＴ而ａ化１．０２１．１Ｔ５ＴＴ．ｒ＾ｇ０．，０．４化３〇１化６１０３ＩＩ＊１品ｉｌ．６，日Ｔｉ．２Ｕ，２Ｗｉ４ｌ５３１支７９．２！４＂ＫＰ巧巧４巧［訂（￣＂＇＇＇＾＇＂，Ｉ，，＊！，０．８２１Ｊ１．９ＪＪ１．６ｌ．ａ１．５＾Ｂ．５１．２ｌ．２１８．８〇７ｖＴｌｕ１５．９１６．３１２Ｔ７ｓ．３１．７ｕＦ１５．９１．２ｈ５．８ｊｌ４．６０．８＾｜１００．＾２７巧１＂５（ＫＰ２巧＂巧｜＂．＿＂胃广ＴＴ＾ｌｉ１－９０．９１．６１－９１．５１ｂＴ１．２ｌｊ化８０．７而１１．６Ｍ５．９化３１１５．３１ＪＲ７ｉｓｉ１．２Ｔｌ５．８１４ＪＵＴ〇‘〇巧＂巧ＫＰ２化化０Ｉ｜兩［１｜（），Ｉ＿■圓图２－６２８个猪睹病毒ＶＰ１基因核荐酸的同源性化较Ｆ２－ＶＰｌＫＶｉ．６ＳｅｕｅｎｃｅｓｌｉｏｆｅｎｅｓｏｆｔｈｅＰｇｑａｎａｙｓｓｇｓ 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杨振：猪瞬病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析？－’ｉＩＤ１２３４ＳＳ７８。＂口口１４巧巧１７；１８１９巧２１２２巧巧２Ｓ巧巧巧ｊＩＩ’‘｜！ｉ「化日化２化３化化８的．．．．．．化日＾９８．８６Ｊ１脚３ＭＫＰ巧的３扣．６９９．２的２８７８１０００扣９８Ｓ２的５：３３３１品打品９２（巧ｉ；＾＿＿！￣＾色，＇：￣７—＿一＇：＾！１Ｊ７４ｌ１之旧Ｋｌ！４．４而．品．６９２９８弓．４的．４９８８，８９，８７ｂ，ｌ３弓．３＾７品．９８７ｉ９２５９１．ｓｌｉｉ９１．７９０．９８９８８９万的．０１４日１Ｐ桃９２４ｌｏＨ講巧〇化８９６的ｒ（）而去品８刖．０９品貼２品巧＾４８７．１９８７９２．１ｓｓ．ｌ９１．ｆ９２，５１９３９６．５９３．３９８．０ｊ＾ＴＵｌ，０１９９．２９３０｜９８．〇３｜Ｊ８１４０２ＫＰ２９６９２５）［！巧打！ｊ］｜ｊ＾］［（也－迎賴＇－＇‘Ｉ＇．＿１－—［；ｊ１－￣－￣—［＞＾，’方祥产品品是品＾品品＾；而＾｜打品９．５９２２９３．９品打４．￥３卵．亩．击品打？１雨＂１２９７３９化１４巧＂〇３１＜巧的巧）（，＾可，＾挪，，，，，，，４１１．５．．．．巧９８．９８．Ｃ８７．５９９．３９２．５扣．６９打９２．９９３．７化７化９３３．７９１．８５６．４９１：９１．４９９．６９３．４９８．４５ＪＳ１４（ＭＫＰ２９６Ｗ０．１２ｈ２；刖！的３６８（。￣＇—誦Ｉｊ＇些＾—￣—＂＾，，＂＾＾＾ＴＴ７打Ｔｒｒ？Ｔｉｉｌｉ？４．ｉｍ南ＪｉＴｉｌＴｉ打Ｔ品Ｆ品ＴｓＴｉ／ｉ訂ｇｇｓ．３２．９．口９７．６３〇．６９７？９７．６６脚＂５（ｋｐ巧目９ｏ０ｊｌｉ视ｙ—－？－￣￣；＾品‘’品＾４１化ｗｉＩｊ？？；１１．．．＾Ｐ巧６３巧２．３．４３－２５．３２月Ｈｉ｜｜１５４化９３８６－３Ｔ的．０．６９＂９３２．２郎５６巧８６１５７巧＂０６（Ｋ）｜＂ｉ＾＾却却＾，’？；ｉＴｌｊ１．９１．９２．２９０．６ｇｌｌＪＴｍｏＩＦ巧＂＂Ｋｐ巧的３０ｉ２ｏ４Ｊ３３（）ｊ，＾￣＊，１，１７１９品＾巧１４７．５ｉ？４而１２．Ｑ１訂枯４１２９巧．２化８扣日而早口．６非式扣９２ｉ９３括．６９３．３９．３８．８９．７９０８９．０言８８．＾０８巧的３１ｌ５｜．．蛛）ｊ￣７￣－１＇’－一＂－１ＵＪ去７＾＾！８孔打８品芯ｒ芯７７＾．．１．．．４品９品品１〇ＣＫ１１．５１３３９３７化５９３７３８Ｆ９２２９１日０ｎ化＂９Ｐ巧巧（巧—吊巧…＾１亩￣■’１，｜０８１１－５１－６３．６ＴＴｉｏ３Ｊｒｒ吊７１．Ｓ濟打京了瓦尸品９３．３郎．９９３．３９１．４９８．日１８９１．０化至９日—０化０１１ＪＳ１４１０畔巧６９３３）ｊ．’‘＾＾｜’巧］，＾，，，＂，＋ｉ］＊１．Ｂ１才４１古８而ＴｉＪ１３．４１７７ＪＪＳ１４１１巧的３而Ｔ４ｌｉ１巧謂端巧品畔。￣｜￣ｙ［了１１１１１Ｄ９＾？１１１｜扣７巧３５占１Ｗ００１２ｒｌｉ２．０〇７３去７２．００．８０．７．３．Ｂ［０．［５．化帝３９目－７扣．０化７９目．３９．３９３．３日日．日化０化０１３化１３（ＫＰ巧的巧）１｜｜［ｙ｜￣￣———｜，一雨品吊Ｔ品品。！ＴＴ７抗古Ｉ．０．品＾而？ＳＳ瓦ＴｌＵ１４ｊ巧１．０７与＾８９．２８．８３ｉｉ［ｚｌ９２１１１３Ｓ＂筆巧扣。７＾ｌ１￣，ｊ：：，—［］审胃＾：８ｉ品化含１而品化４＂Ｐ＂－１７名方奇＾１．２．日Ｉ品ｓＴＴ品兩８品２８３３松８ｌ８５－６ｒ８４．５１５巧２（Ｋ巧巧巧．２２３５５２ｉｌＳ１１Ｔ麵麵［ｌ节＂＇Ｍ＂＇可＇￣＾！巧可７１１１１Ｋ７，９９．２６，６９．２８．３９．２１＾１９．２９．２８．３３．８１０．１５．５＾３！化化３９５．７９４９８化日日０．０９．３９８．８９５．７品品９．３１６巧＂２ａ（Ｐ巧巧５１），１｜｜１兩．．■■－－－－￣￣子｜十－，７言品广苦打而巧布本目誦。品＾８化２９５．３３。化５ｌ４．２９３＇ｒｉ＾互９２．ｎｒ化１４巧（ＫＰ巧的巧）六戸￣，＂，ｉ｜’．，７枯Ｔｂ７占７７７．．２．．６．３．ＳＳ．９而３７．６品化．１９３．７９＂化９品９１８化＂化２化Ｗ０６．２８．８．广．９７０日８８４１２ｊ化３吊！｜｜［蛛。－－｜￣￣一——＊＂节＂ｊ，ｐ！而，，＊呼＾，１Ｔ叮ｒｌ去品立品，身品．巧Ｈ１７Ｋ１７瓦５１Ｆ７５瓦７．５９．２６，６百。Ｊ１而ｓ２Ｈｉ９２／！声兩１．３３＂日３广＂Ｐ巧巧４１）下爾（节＇可节ｌ￣￣＇，＇＂＇，，；，１瓦劝Ｋ２．８＾ｌ．Ｂｌ．ｅ５７３＾１６３．２１５．３３４＾０．６５．３９．２８．３ＭＭ：引．３８Ｓ．４化１阳．８刖．〇９５召巧—９ＪＳ１＂８Ｐ巧６９４２！！．．（）ｙ＾＾￣￣｜，＇—’＂Ｉ，＾ｕ化４ｒ７ｉｉｒ．，．．．打Ｔｌｉ．２－２９Ｂ化９４品３９＂品９９２．９２１巧＂１９＜Ｐ巧巧３？９？．５ｓＢ３７５？０６ｅ７０７９２２４３９ｊ巧〇）Ｍ＿ｙ－ｙ’■＾—＊广｜＞＾，＾Ｊ＾＾７ＵＪＷ１１９１４＇９品９是＾３瓦而万９－２８．３８．８８．０５．５ＴＴ１６７ｏＦＴＰｌｓｓＩＵ〇Ｋ〇９９．２９７．２．２９．０９１．０ＪＳ１＂０ＫＰ巧６９，＾Ｉｌ＇＿＾（。：．＾＾＇＇＾＇．＇＾６＾３．０２．０１３．８８．３ｌ１．Ｅ９．２ｉｆ＼Ｕ９．２ｊｇＶ４ｌ９０６１９８，８９７．６９７，Ｆ２３ＪＳ＂。巧化９４，＾＾晒｜的）＼中—＾ＴＵＵ７品．ＩＴ．．．４．．．０，８．８，＾１，Ｔ１．Ｐ９４７．５８．８ｓ３８．Ｂ７．９日．８Ｓ．Ｓ７７ｓｓ１２４０９１０６１６８ｊ｜Ｈ９７９２５９ｌ９１２４化１＂２Ｋ巧６。（￣＇＿￣￣￣ｙ广—却，＾＾＇广＇＾＾＾７１万—ｆ９１．７ＴＴ．．品扫９．２化２４．５６．０６．日．日１．５目Ｊ２．７占９０．６９０．６２５旧１Ｕ３ＫＰ巧８９４８３９ｉ〇ａ８７＾９７９７麵（。节厂￣｜＇＾＂＂，，—＇■！＾＊Ｔｌ品ｉＩＴｌ４５ｊ７ｒ７ｒｉＴ抗．．Ｈ爾ｋ■－１－ｉＪＴＴＴｓｉＰｐ６．２ｅ．Ｐｓ７．９ｕｒｓ８３８ｓ２６化＂別２扣＂巧Ｖ００１０＾ｙｉ．１掷＊＾－－广，ｐ，Ｉ．■’＊１＇’＾１．２４．Ｄ１．６２．４３ｆ２．０１２．４２广亢７品品品品言厂７．９７．５；Ｓ．ｒ３．２７ｉ江２２．ｒＷｊ９Ｊｉ１．２ＪＳ１＂５ＫＰ巧剛巧．．｜＾（Ｉ—；－｜：■一雨一＇Ｔｗ５Ｈ－Ｏ品心瓦％２再Ｓ．ＳＪＳ１４２６ＫＰ巧目３０１２广品命广｜‘巧（）图２－７２８个猪啼病毒ＶＰ１基因氨基酸同源性比较－ｕｅｎｃ巧ｎａｏｆＶＰＦ１ｒＰＫＶｓｉｇ．２７Ｓｅｑａｌｙｓｉｓｐｏ化ｉｎｏｆ化ｅ圓Ｕ画誦画Ｉ＾Ｌ■？！■■画■■■ｋ—圓圓ＣＣＣＣＴＣｔＣＧＧＡＡＣＴＡＴＣＣ亡ＣＡＣ－．？ｔＣＣＴＧＣＴＧＣＴ－ＧＣＴＧ化ＧＴＣＣＧＣＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＧＴＣＡＡ俯地Ｔ＂■■ＩＩＩＩＩ１Ｉ０Ｔ２Ｍ０Ｔｔｏ叩７３巧’叩Ｉ叩巧巧－９ＣＣＣＡ！．ＣＣＣｒｃＣＴＡＣＴＣＴＣＴｒＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡｔｔＧｒＧＣＴＡＡ巧巧３ＣＴＣＴＣＧＧＡＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＯＧＧＧＣＣＣＧＣＪ５Ｄ的奸巧＊化－？．．ＧＧＣＧＣＡ《１＞ＣＴＣＣＴＣＴＣＤＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＴ＇．ＣＣＴＧＣｔｌ！ＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＧＴＣＣＴＡＡＱＧＣＣＧＣＴＣｔＣＧＣＡｒｔＧＴＴＡ町ＣＣＧＣ口坤ＣＣＬＣＣＣＣＣＣＧＣ－ＧＣＧＧＧＴＣＣＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣｔＣＣＣＣＣＡＴＹＧＴＧＣＧＹＣＡＡ５Ｗ巧（Ｉ２巧０巧》ＣＣＣＣｔＣＴＣＧＧＡＡＣＴＡｌＣＣＴｔＴＡＴＴＴｔ口Ｊ）巧ＣＣＣｔＣＴＣＧＧＡＡＣＴＡｌＣＣＴＣＴＣＣＴＡＣＴＧＣｔ－ＧＣＴＧＴＧＧｔＧＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＧＴＣＡＡ３１４ＣＪ巧巧》ＣＣＣｒＣＣＣＣＣＣＣＡＧＧＧＣＪ口ｔＴＣｔＡＴＴ－ＧＴｇＧＧＣＣＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＧＴＣＫＡ４４巧ｌＣ巧巧巧５ＣＣＣＣＴＣＴＣＧＧＡＡＣＴＡｌＣＣＣＣｒＣＣＣＣＣＧＣＣＴＶｆ口巧９ＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣ－ＧＣＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＧＣＧＴＣＣＴＣＴＣＧＧＡＡＣＴＴＣＣＣＣｌ？５巧巧！．，ＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＣＣＧＣｔＴＣＡＡ３口巧Ｊ巧？ＣＴＣｔＧＧＫＴＡＴＣＣＬＣＴＴＴＴＣＴ．ｆＧＴＧＧＴＣＣＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣｔＣＣＣＣＣＡＴＴｏＴＧＣＧＴＣＡＡ５１４０６巧０ＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＪ辉巧＊巧ＣＣＣＣＣＣＡＣＧＣ－ＧＣｆＣＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＧＴＣＡＡ４０７巧饥？ＣＣＣＣ￥ＣＴＣＧＧＡＡＣｒＡｙｃＣＣＪ．ＴＴＴＴＴＴＧＴＧＧＣ町口－■■．■糾励巧＞ＣＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＡＣＡＣＡＡＣＴＩＮ．ＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＧＣＴＡＡ１Ｃ６ＣＴＣ扛ＴＴＴＧＴＧＣＧＴＣＡＡ３ｉ！ＣＣＧＧＧＣＣＡＪ阿》化－？巧、ＣＣＣＣｔＣＯＧＡＡＣｔＡｔＣＬＣｙＣＣＹＣｔＡＣＧＣｔＧＧＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣｔＣＣＣＣＣＡｙｆＧＶＧＣＧＴＣＡＡ３ＨＣ５ｔＣＣＣＣＣｔＧＣｉＪＧｆＣＣＣＪ狙句＊ＣＣ＂ＣＣＣＣＣＧＣ－做ＣＣＣＣＣＫ：ＧＧＧｃＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡｒＴＧＴＧＣＴＡＡ４０巧ＷＴＣｔＣＣＧＧＡＡＣＴＡＴＣＣＴＴＴＡＴＴｒＴｒＣ！ＧＣ巧１的每做ＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＣ－？？－ＣＣＣＧＴＡＴ＇．ＴＣＴＡＣＣＧＣｔＧＣＣＧＴＧＧＴＣＣＧＣＣＣ了ＡＧＧＴＴＴＧｒＧＣＧＴＣＡＡ３ｉ４！４巧ＴＣＣＡＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＡＪ辉－－■－ＣＣＧＣＣＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣＣＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡｓ巧ＷｍＣＴＣＣＩＣＴ５ＣＧＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＶｌＣＣＣＣＴＧＣＴＧＣｔＧＣＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴｊｍ辉）ＣＣＣＣＧＣＧＧＢＡＣＡＡＣ－－？ＴＣＣＴＡＣＴＧＣＴ－ＧＣＹＧＴＧＧＴＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＣＴＴＧＴＧＣＧＴＣＡＡ巧５１４Ｕ巧＞ＴＴＴＴＣＣｌＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＡ征Ｊ巧ＣＴＡＣＴＴｒＴ．？■ＴＣＣＴＴＴ．ＣＴＴＴＣＧＣＣＣＴＡＡＧＧＧＴＧＣＴＣＣＣＧＴＡＴＴＧｔＧＴＣＡ５１４Ｕ巧？ＣＣＣＣＣＴＧ这ＧＣＡＣＡＡＧＣＧＣＧＧＧＧＣＣＣＧＡＪ押－ＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧＧＣＧＡＡ３Ｔ１似￡巧？ＣＣＣＣｉＣＣＧＧＡＡＣＴＡＴＣＣＣＣ／．ＣＡＣＣｒｃＣＴＡＣＴＧＣＴＧＣｔＧＴＧＧＴＣＣＧＣＣｔＴＴＴＴＣＪ辉巧６巧）ＣＣＣＣＣＣＧＧＯＡＣＧＴＣＡＣＣＣ－？．－ｍＴＴＪ．ＣＴＣＣｔＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＧＣＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＧＣＩＣＣＣＣＣＡＴＣＡＡＡＣＧＴＣＡＡ口《站口巧０５１）ｍＣＴＣＣＣＣＴＣＧＧＧＡＣＧＴＴＡＣＣＣＬＣ．？－ＣＣＣＴＧＣＴＧＣ，－ＧＣＴＧＴＧＧＴＣＣＧＣＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣＴＣＣＣＡＴＴＧＴＧＣＧＴＣＡＡ５１４Ｗ巧巧崎Ｊ阿＊－．．ＴＴＴＡＡＧＧＧＴｍＴＴＣＣＣＴＣＴＧＧＧＡＣＡＴ－ｍＴＴＴＡＣＣＣＬＣＴＴＣＴＧＣｔＧＣｔＧＣＴＧｒＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＧＣＧＣＡＡ町４口的０巧巧＊巧－ＰＣＣＣＣＴＣＴＣＧＧＡＡＣＡＣＣＬＣｔＣＣＴＣＣｔｈＣＴＧＣｔＧＣＴＧｒＧＧＴＣＣＧＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣｌＣＣＣＣＣＡＴＴＧｒＧＣＧＴＣＡＡ３１４Ｕ巧巧４＾ｒＴＣＣＣＣＣＪ巧＊巧－？？－ＧＣＧＣＯＣＡＡ５１４１９巧０４＞ＣｒｃＣＣＣＴＣＧＧＧＡＣＧＴＣＡＣＣ！．ＣＣＴＧＣＴＣＴＧＴＧｒＧＧＴＣＣＧＣＣＣＴＡＡＧＧＣＣＧＣＴＣＴＣＣＡＴＴＧＴｒ３ＣＣＣＧＣＪ押）ＣＣＣＣＣＣＣＣｈＣＧＣ－ＧＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＡＴＴＧＴＧＧＪＣＡＡ３巧１切＞ＣＣＣＣＴＣＴＣＧＧＡＡＣｔＡＴＣＪ．ＴＴＴＴＴＴＪＧＴＣＣＴＣ巧００巧Ｊ巧－９ＣＣＣＣＴＣｔＣＧＧＡＡＣＴＡｔＣＣＣＣｒｃＴＣＣＴＣＣＴＡＣＴＧＣｔＧＣＴＧｒＧＧＴＣＣＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴｏｒＧＣＧｌＣＡＡ５１４Ｍ巧扣巧Ｊ阿ＴＴＴ－ＧｉＴＴＣＴｂＣＴＧｔＧＴＧＴＧＧＴＣＣＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＣＣＡＴＴＧｌＣＧｒＣＡＡ３１似巧０巧？ＣＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＰＣＣＣＣＬＣＡＣＣＣＣＣＪ辟巧ＣＣＣＣＣＧＧＡＡＣＧＡＡＣＣＣ－？？ＣＣＣＧＣ．ＧＣＧＧＧＣＣＧＣＣｉＡｌＣＴＣＧｔＣＡＡｍＴＴＴＴＭ：ｔＴＧＴｔＴｔＴＣＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＡＡＡ５１物巧０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＾扬州大学硕壬学位论文３．５．２进化树分析将本研究选取的１９个猪峭病毒３Ｄ基因与参考巧的３Ｄ基因进行系统进化树分析并使用ＭＥＧＡ５－．０绘制进化树（图２９），了解江苏地区猪赠病毒遗传进化关系。。结果显示，１９个３Ｄ基因与ＰＫＶｓ的同源性较近而与其它晴病毒较远来自不同地区的ＰＫＶ一ｓ３Ｄ基因处于同个群，说明在江苏地区ＰＫＶｓ的分布是没有地理限制的；从进化树可一一Ｗ看出Ｈａｉａｎ／２Ｃｎ２１２与株日本的ＰＫＶｓ（ＪａｐａｎＴ０９０）处于同个分克艮ｕＧａｏ２／２０１３０３与中一２６一一一国吉林的ＳｉＰｉｎｇ／２０１３１１处于同分克ＳｈｕＹ／２０１３１２与株韩国的ＰＫＶｓ处于同分克一－株ＰＫＶｓ（Ｂｉｎｈａｉ／２０１２０８）在进化树中与株来自韩国的牛晴病毒株（ＣＰＦ４２９３有较近的亲）缘关系巧１．７％的核昔酸同源性和７５．０％的氨基酸同源性）。这些数据说明在江苏地区ＰＫＶｓ一的分布具有定的基因多样性。将１５个从腹泻猪样本获得的ＶＰ１基因序列；ＪＳ１４０１，ＪＳ１４０２，胤４０３，ＪＳ１４０４，ＪＳ１４０５，胤４０６，胤４０７，胤４０８，ＪＳ１４０９，ＪＳ１４１０，ＪＳ１４１１，ＪＳ１４１２，化１４１３，ＪＳ１４１４，ＪＳ１３０１和１３个从临床健康猪样本获得的ＶＰ１基因序列ＪＳ１４１５，ＪＳ１４１６，化１４１７，化１４１８，ＪＳ１４１９，ＪＳ１４２０，ＪＳ１４２１，ＪＳ１４２２，ＪＳ１４２３，ＪＳ１４２４，ＪＳ１４２５，化１４２６，ＪＳ１４０２ａ分别命名并上传到瓜号为－ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＰ巧６９２４ＫＰ２９６９５１。，获得的ｓ的ＶＰ－对ＰＫＶ１基面的进行进化树分析显示（图２１０），２８个ＶＰ１基因分为四个群，其；中１５个从临床腹泻猪讀中获得的ＶＰ１基因在进化树中分布在四个不同的群。序列ＪＳ１４０１一４一与美国的序列Ｈ１处于同分支，彼此间的核巧酸和氨基酸同源性分别为８０．８％和一％ＪＳ１４０８和ＪＳ－－８９．４１４Ｈ位于同个分支并且与日本的Ｔ２４７和匈牙利的Ｓ１ＨＵＮ株ＶＰ１’一基因亲缘关系较近；ＪＳ１４１４与５个来自中国的ＶＰ１基因形成个姐，该组的核昔酸和氨一基酸同源性平均为８６．７％和％．５％。这些表明江苏地区腹泻猪群中流行的ＰＫＶｓ表现定的基因多样性。一ＪＳ１４０８和ＪＳ１４１３ＪＳ１４１１和ＪＳ１４０８地区的猪场中，但在进化树中处于，是来自同不同的分支，这与之前报道的在江苏地区猪群中ＰＫＶｓ的感染可能巧同存在多种不同的基因型相一致一。有趣的是所有临床健康猪群感染的ＰＫＶｓＶＰ１基因分布在同个群并显示较近的基因同源性。这种差异可能与ＰＫＶｓ的潜在致病性有关。 杨振：猪婿病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析Ｍ＿Ｐｏ－２４９６ｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓＫ３ＣＲＨＵＮＧＱ１１＾（）Ｉｏ－－－ｒｃｎｅｖｉＰｉｋｏｂｕｉａｓＳｌＨＵＮＨｕｎｇａｒｙＣ０１１８２９（Ｎ）—＇＂＾２ＩＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕＡｒｕｓｓｗｉｎｅ００７ＣＨＮＦＪ４９３６＾（）ｒＬＰ－－７９ｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓＹＣＨＩＧＵ２９２５５１（９）－ｖ＾ｌａ■Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕ＾ｕｓ／ＤａＦ。０。。（５说肝９ｊ）Ｉ—■Ｐｏｒｃｖｉ悔ｋｏｂｕｉｒｕｓ／Ｙａｎｇ说０１３１２１０５祐９的（）Ｉ—－ｒｒＰｏｃｉｎｅｋｏｂｕｕｕｓＣＨＨＮＸ）ＵＪ）ｔ０１５２３（）￣ｍＡＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ２００８ＡＢ６２４４７２（）—Ｐ■ｉ惦ｋｏｂｕｖｉｒ／Ｈｉ／２（ｍｎＫＦ３１７如７ｊｏｒｃｕｓａａｎ（）＇＇Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｄｒｕｓ＾ｌＴ的ＯＨＭＯＷＯＳＪａｐａｎｆ）－－ＰｏｒｕｒｃｉｎｅｋｏｂｉｗｉｓＷＢ１ＨＵＮＪＸ１７７６１（巧Ｉ■Ｐｏ记ｉ化ｋｏｂｕｖｉｒｕｓ巧ｈｕＹ／２０１３１２（ＫＪ５５６９姑）Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／Ｇｕａ佩如１＂２脚５说９８。ＩＰｏｒｃＣＭＰ的５ＧＱｉｎｅｋｏｂ叫机ｓ７ＨＡ１巧１００（）ｊ＇＊ＰｏｒｃｒｕｉｎｅｋｏｂｕｄｓＢＲＡ２４ＨＱ８７７目２０（）ＰｏｒｃｉｎｅＩｃｏｂｕＭｆｕｓＣ２０４６８４）導Ｉ－—Ｐｏｒｃｉｋｂ加／Ｇ２０１如１ＫＦ別７■ｎｅｏｒｕｓｕａｎｙｕｉＶ（２０６）Ｉ品Ｌ时ｉ／Ｈｉｈｏ：Ｐｏｒｃｎｅｏｂｕｖｒｕｓ■ｐｏｎｅ妃加ｖｒｕｓａｚｕ／２０１３０１ＫＦ：３１７２０８ｉＫｉ（）ＢｏＷｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓＣＰＦ４巧３ＨＱ２３４如巧（Ｉ■Ｐｏｒｃｉ化ｋｏｌ加ｒｕｓ旧ｉｎｈ泌２０巧０巧Ｋ朽１７２０巧Ｉ＞！ＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕＭｎｉｓＷＵＨ１ＪＱ６９２０６９（）？？？ｈ，■Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／Ｒｕｇａｏ／２０１３０３（ＫＦ３１７２０９）「—Ｉｒｃｖｒ■Ｐｏｉｎｅｋｏｂｕｉｕｓ／如如Ｙｕｎ２３／２０１孤１ＫＦ９７７０１（。６０ｉ■ｖ１Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｉ山ｓ／ＧｕａｎＹｕｎ２７／２０孤１ＫＦ９７７０１（巧９８■Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｔｒｕｓ／ＲｕＧａｏ３／２０１３０３（ＫＦＱ７７０２６）■Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉａｉｓ／ＧｕａｎＹｉｍ助如１舰（ＫＦ９７７０１巧９９１￣！■ｕＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｖｉｒｕｓ／Ｈａ卸ＯＵ４／２０１孤１ＫＦ９７７０１（巧■０Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉ山ｓ／ＨａｉＺｈｏｕ８／２１３０１ＫＦ９７７０２２（）ｊ＾—■Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／Ｈａ畑ＯＵ１９／２０１沉１（ＫＦ９７７０２３）巧■Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／ＲｕＧａｏ２／２〇ｎ〇３（Ｋ７７０２５）Ｉ￣２６３０Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／ＳｉＰｉｎｇ／２０１３１１ＫＦ９７７０（）１００■Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／ＤｏｎｇＴ／２０１３１１（ＫＪ５５６如０）广－Ｐｏｃ巧ｉｋ＼ｊａｎ２／２０巧０７Ｋ巧７７０Ｉ■ｒｎｅｏｂｕｒｕｓ肪Ｎ（１１）ｇ２＾ｒｕ■Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｓ巧烟Ｎａｎ４／２０１３０７ＫＦ９７７０。（）Ｐｏｒｃｎｅｖ３ｉｋｏｂｕｉｍｓ／Ｓｉ円ｎｇ１７／２０１＂ＫＦ９７７０２巧（ＩＩ—ｖＰｏｒｃｉｎｅｌ（〇ｂｕｉａｉＳ／ＳＰｉｎｇ１５／２０巧１１〇ＣＦ９７７０２７？）品ＪＰｏ似２０ＫＦｒｃｉｎｅｋｏｂｕ加ｓ／扣Ｐｉｎｇ１別１９７７０２—（巧Ｂｏｖｉｎｅｋｏｂｕｖｉｎｉｓ…ＡＢ０８４７汾（）１Ｂｏｖｉｎｅ抑ｄｓｈｅｅｐＫｏｂｕｖｉｒｕｓＩＩ品—Ｓｈｅ－－－ｅｐｋｏｂｕｖｉｒｕｓ１Ｂ３ＨＵＮ２００９（ＧＵ２４５６９３）＾．．．．．ｉ？《？化Ａｉｃｈｖｉｕｓ＂ｎ、ＡｈｍＡＢ０１０１４５」记ｉ＂ｓ（）Ｉ＂—Ｃａｖｕｓ－８５ｎｉｎｅｋｏｂｕｉｒＵＳＰＣ００８２ＪＮ０８４１？（＇）＇＂ｊ＂＂、：（１００ＭＣＫ化ｉ１ｏｕｓｅａｎｄａｎｉｎｅｕｖｒｕｓ巧－－－１５９ＭｏｕｓｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓＭ５ＵＳＡ２０１０ＮＣ０１３６（）１Ｉ０．０５图２－９基于ＰＫＶＳ３Ｄ基因构建的系统进化树■所示哉（本研究中获傳的序列）－Ｆｉ．２９Ｐｈｌｏｅ打ｅｔｉｃｔｒｅｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｒｔｉａｌ３Ｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ巧ｕｅｎｃｅｏｆＰｏｒｃｉｎｅＫｏｂｕｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｇｙｇｐｑ？ｌｉａｎｇｓｕｒｏｖｉｎｃｅ．Ｆｉｌｌｅｄｓｕａｒｅｓ■ｉｎｄｉｃａｔｅａｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ巧ｕｅｎｃｅｏｂｔａｉ打ｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄ．ｐｑ（）ｐｑｙｈｂｏ－Ｎｅｉｒｏｉｎｉｎｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｗｉｔｈｂｏｏｔｓｔｒａａｎａｌｓｉｓ１，０００ｒｅｌｉｃａｔｅｓｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂａｓｅｄｏｎｇｊｇｐｙｇｙｐｙ（ｐ）ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｌｉｎｍｅｎｔｓｕｓｉｎｇｔｈｅＭＥＧＡ５．０．ｇ ５２扬州大学硕壬学位论文Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｌｒ＼Ｊ８／ＡＹ２／ＣＨＮＫＣ１７６７２４９９（）＾［口ｏｎｓＪｎ＊ｋｏｂ＂ｖｆｒｕ？／ＡＶ３／ＣＨＮＫＣ１７６７２３＜，Ｐｏ６／ＣＨＮ９７ｒｃｉｎｏｋｏｂｕｖｔｎｊｓ／ＳＣＫＦ１１９３２（）ｊＩＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖ＜ｒｕ８／Ｈ１２／ＵＳＡＪ巧８７５００ｐ（）Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｔ＞ｕｗｌｒｕｓ／ＳＣ０６／ＣＨＮＫＦｉｅ７９２＜巧■ｊ？戶ｏｅｏｂｕｖｎｊ８ＺＫｒｃｉｎｋｌ／／ＣＨＮＫＣ１７６７１７（）ＩＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｆｒｕｓ／ＧＹ／ＣＨＮＫＣ１７６７２２（）Ｆｏｎｃｌｎ。ｋｏｂ。一ｍｓ／Ｈ１０／ＵＳＡ（ＪＸＢＳ７４９８）ｎｅＰｏｒｃｏｂｕｖｒｕ８Ｈ／ＵＳＡｉｋ＜／１１ＪＸ９８７４９９Ｊ（）？ＰｏＪＱ６９２０６ｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｌｒｕｓ／ＷＵＨ１／ＣＨＮ＜巧Ｐｏｒｃｍｅｋｏｔ＞ｕｖｌｒｖ＞ｓｎｒｉ５２／ＪＰＮＡＢ６２４５００广（）■尸品ｏｒｏｌｎｅｋｏｂｕｖｌｒｕｓ／Ｔ１９８／Ｊ户ＮＡＢ６２４５０１（）［厂９８ＬＡＢ＠２４４Ｐｏｒｉｅｋ〇ｂｕｖｉｒｕ８／ＣＭＰ０７／ＴＨＡｃｎ（９４）Ｐ〇ｒｃｌｎｅｋ〇ｂｕｖｆ＂ｓ／ＳＧ（）２？ＤＨＫ＂９７９１８５Ｗ＞－ＶＰ图２１０基于猪曠病毒ｌ基因构可一ｃｒＰｏｒｉｎｅｋｏｂＬＭｕｓ／ＳＣ０８／ＣＨＮ〇＜ＦＷ７９２４２＾）Ｐｏｎｏｌｎｅｋｏｂｕｖｉａ／ＳＣ０１ＣＨＮＫＦ９７９７ｉｓ／１１建的系统进化树■为腹泻巧猪感（）（ＨＩ戶ｏＡ巨６２４４９８ｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｎｊｓ／Ｔ０９３／ＪＰＮ（）〇ｕｖｕｓＰ▲戶ｏ－ｒｃｉｎｅｋｂｉｉ／ＪＹ２０１０ａ／ＣＨＮＧＵ２９２５５４染猪崎病毒Ｖｌ基因，为略床健＜＞「Ｐｏｒｃｌｒ６ｋ〇ｂｕｖｌａｉｓ／Ｈ１４／ＵＳＡＸ９ｇ了５０心一山山ｉＷ１Ｉ山山Ａ一ｗ、Ｉ）１一，＂￣ｍｕＰ，康巧猪感染猪蜡病毒ＶＰｔＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ＂Ｓ１４０ＣＨＮＫＰ２９６９２４Ｊｌ基因）■ｌ／）（＾—．．，Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓ／ＳＣ３５／ＣＨＮＫＦ１５７９５１ＡｉＡＴＭ，Ａ１Ｊ１（）－Ｆｉ．２１０Ｐｈｌｏｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｂｎｓｃｄｏｎｇ＿ｏｒｃｎｅ０ａ５ｙｇｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／ｊｙ－２０ＧＵ２ｄ２ｐｉ１／ＣＨＮ５６＜）＾￣＇的材。。咖。＾＞＾？＂２〇１２３／？＾成９４说巧ｔｈｅａｒｔｉａｌＶＰｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｐｑ「ｔ１ＬＰ－１－ＣＨｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／ＹＩＣＨＮＧＵ２９２Ｓ５９（）口如加。化扯加ｓ／ｊＹ－２〇ｉ〇ａ／ｃＨＧＵ２９２Ｓ５３ｏｆｒＫｒｕｓＦｉｅｄｓｕａｒｅＷ＞Ｐｏｃｉｎｅｏｂｕｖｉ．ｌｌｑｓｅ。「Ｐｏｒｃ－ｉｎｅｋｏｂｕｖｊｒｕｓ／ＪＹ２０１０ａ／ＣＨＮＧＵ２９２５５８（）ｐ〇ｒｃＨｉｉｉｋｉｉｎ？ｋ〇ｂＬｗｉｒｕｓ／２〇ｉ２ａ／ｃＨＮ＜ｊ＞ｃ２９４６６３ｎｄｃａｔｅａｏｒｃｎｅｏｂｕｖｒｕｓ）（）ｉｐＩ戶ｏｒｃ－ｉｎｅｋｏｂｕ＂ｎＪｓ／ＧＳ２／ＣＨＮＫＣ４２４６４０（）？ｅｔｉｆｒｏｍｄｉａｒｒｈｅｉｃＰｏ－１－ＪＸ７７６２ｒｃｉｎｅｋ〇ｂｕｖｉｎｉｓＡＡ／ＢＨＵＮｓｕｅｎｃｅｏｂａｎｅｄＩ（１１）ｑＩＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／Ｔ１８２／ＪＰＮＡＢ６２４５００，（），▲ｉｉｇｌｅｔｓ．Ｆｉｌｌｅｄｔｒｉａｎｇｌｅｉ打ｄｅ过ｔｅａｐ（）ｐｏｒｃｉｎ。ｔｃ〇ｂｕｖｉｍｓ／Ｈ２ｉ／ｕｓＡｊｘ９８７ｓ〇４（）＾ｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｓｅｕｅｎｃｅｏｂｔａｉｎｅｄｐｑＷ；ｒ：ｅｒｒ三：「ｐｏＡＳ６２４５０２ｒｃｉｎｅｋｏｂｕ＞＾ｒｕｓ／Ｔ２４７／ＪＰｆｒＷ＞ｏｍａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃｉｌｅｔｓ一ｒｒｐｎｇ￣ｒＨＰｏＫｓｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／ＪＳ１４０Ｂ／ＣＨＮＫＰ２９６９３１１（）＿＂＆…。品Ｊ口－Ｌｏｒｃｉｎｅ（ｃ〇ｂｉ細８／巧ｗ＂州ｎｋｐｚｗｓｍＮｅ■ｐｃ）ｉｇｈｂｏｒｏｉｎｉｎｇｈｌｏｅｎｅｔｉｃｊｐｙｇ—Ｐｏｒｃ＞－ｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕ８／ＳＨＷＣＨＮＪＮ６３０Ｓ１４．６３（）Ｊａｎａｌｓｉｓｗｉｔｈｂｏｏｔｓｔｒａａｎａｌｓｉｓｆｌ户ＯＦｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉ？ｓ／Ｘ＞ｔｆＯＨＮＫＣ２０４６８４ＬＧｒｏｕｙｐ＜》ｐ３ｙＵＳＩＰｉｂｉ１４１４／ＣＨＮＫＰ９Ｓ９３７■ｏｒｃｎｅｋｏｕｖｎＪｓ２＿＂ｒｖＡＡ■、，（），，０００ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）ｗａｓｅａｒｎｅｄｏｕｔｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓ／ＧＳ－１／ＣＨＮ（ＫＣ４２４６３９）￣ｐ。。，。。幽＂…ｗｃｈｗ＇ｃ…ｋ巧的７的（）ｂａｓｅｄｏｎｎｕｃｌｉｌｅｏｔｉｄｅａｅｎｍｅｎｔｓ「—〇ｒｃｎｅｋｏｂｕｒｕａ＂Ｓ７４ＡＰｉ＂１４２０／ＣＨＮＫＰ２９６９４４＜）ｕｓｉｎｇｔｈ？．６ｅＭＥＧＡ５．■０ｊ７７ｉ■戸ｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍ９／ＪＳ１４０２ａ／ＣＨＮＫＰ２９６９５１（）ｊＰｏＴｃＩｎｅｋｏｂＬｉ＼＜ｒｕｓ／ＪＳ１４２ＣＨＮＫＰ２９６９４６＾Ｃ）＿Ｉ▲户ｏｒｃｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕＢ／ＪＳ１４１９ＣＨＮＫ戸ｉ／２９６９４（巧Ｉ▲Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｔｒｕｓ／ＪＳ１４１６／ＣＨＮＫ戸２９６９４０（）ｏｒｃｉｎｅｋｏｂＬＷｍｓ／ＪＳ１４１５／ＣＨＮＫＰ２９６９３▲Ｐ（巧化ＩｒｉｄｌｊｋＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／ＪＳ１４１７／ＣＨＮＫＰ２９６９４１（）ＩＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂ。一ｒｕｓ／ＪＳ１４２３／ＣＨＮＫ戶２９６９４７▲（）８６圓Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｆｒｕｓ／Ｊ８１＜４０３／ＣＨＮＫ户２９６９２６（）「▲戶ｏｒｕｒｃｉｎｅｋｏｂｕ＼４ｓ／ＪＳ１４２５／ＣＨＮＫＰ２９６９４９（）「．ｏｂｕ９９戶〇ｒｃｉｎｅｖｉｒｕｓ／ＪＳ１４０ＷＣＨＮ３２■ＫＫＰ２９６９厂（）－■Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ＂Ｓ１４１０ＫＰ２９６的／ＣＨＮ—Ｇ（巧ｒｏｕｐ４ｇ４▲Ｐｗｉｎｅｋｏｂｕｖｆｒｕ８ＵＳ１４２４／ＣＨＮＫＰ２９６９４＜巧ＰｏｒｅｌｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓＵＳ１３０１／ＣＨＮＫＰ２Ｇ６９３巧Ａ（ｏｂｕｖｎｓＡＳ■ＰｏｒｃｉｎｅｋｌｊＩ１４１２／ＣＨＮＫＰ２９６９３５（）Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｎｊｓ／ＪＳ１４１３／ＣＨＮＫＰ２９６９３６■（）▲Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍ８／ＪＳｌ４２ｌ／ＣＨＮ（ＫＰ２９６９４巧－ｏｃｅｏｂｕｖｒｕｓｗ■Ｐｒｉｎｋｉ／ＪＳ１４０２／ＣＨＮＫＰ２９６９２５（）■Ｐｏｒｅｌｎ。Ｋｅ＞ｂｉＪ＼＜ｒｕ，／ＪＳ１４０４／ＣＨＮＫＰ２９６９２７（）—■Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｆ？ｓ／ＪＳ４０５／ＣＨＮＫ戶２９６９２，（巧－■戶ｏＫＰ２９６９３０ｒｃｉｎｅｋｏｔ＞ｕｖｉｍｓ／ＪＳ１４０７／ＣＨＮ（）—■Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖ（ｒｕｓ＂Ｓ１４０６／ＣＨＮＫ户２９６９２巧（▲Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／ＪＳ１４ｉｅ／ＣＨＮＫＰ２９６０４巧厂（ｂｂＬＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖ？ｎｊ８／ＪＳ１４２６／ＣＨＮＫＰ２ｅ６９５０＾＾（＞ＪＰｏｒｃｉｎ。Ｋｏｂｕｖｉｒｕ，／ＣＭＰ１７／ＴＨＡＳ６２４５０４（Ａ）ＩＰｏｐｏ－ｌｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕ８／ＣＨＨＺ／ＣＨＮ＂ＸＢ２７Ｓ９巧Ｂｏｖ－（ｎ。ｋｏｂｕ＂ｍｓ／Ｕ１／ＣＨＮＡＢＯｆｒ４７ｅ８（）＂ｊ完ＩＳｈ？ｅｐＫｏｂｕｖＱＵ２４说的ｌｒｕｓ／ＴＢ３／ＨＵＮ（）＂ｓＡｂｈＭ／ＣＨＮＡＢＱ１０１々。（ＩＣａｎ－ｉｎ，ｋｏｂｕｖ（ｒｕｓ／ＵＳＰＣ００８２＜ＪＮ０８８６４１＾）ｊ品—１Ｍｏｕａ。Ｋｏｂｕｖ－－ｉｒｕ＂Ｍ５ＵＳＡＮＯ０巧９说．１（）０．０５ 杨振：猪啼病毒感染流行病学调查和全基因纽遗传进化分析？４讨论ＰＫＶｓ普遍存在于世界范围内多个国家的腹泻群和临床康猪群中。２００７和２００８匈牙利９健康猪群中ＰＫＶｓ阳性率分别为６５％（３９／６０）和５３．３％（３２／６０）。虞结梅等人从３２２份健康的猪粪便中检测到ＰＫＶｓ阳性率为３０．１２％，从１１６份腹泻猪粪便中检测ＰＫＶｓ阳性率为３５３８．８％。在日本，健康猪群中的ＰＫＶｓ阳性率为４５．４％１３３／２９３；２００９年泰国腹泻猪群中（）４ＰＫＶｓ９９．０％７／９８的感染率达到巧；意大利学者对２６０份健康猪粪便检测发现ＰＫＶｓ阳）７性率为３．８５％，２０１５年又对２０８份病料检测发现５７．５％的健康猪和４９．７％的腹泻猪感染了Ｗ１１ＰＫＶｓ；２０１２年，美国健康和腹泻猪群中的ＰＫＶｓ感染率分别为２１．７％和２１．９％。这种Ｖ一差异提示ＰＫｓ与猪群的腹泻可能具有定的关联２０１０韩国学者发现年本地健康猪群中。〇ＰＫＶｓ阳性率为１９．３／（＜１６／８３），而腹泻猪群为８４．５％（７１／８４），他们认为ＰＫＶｓ与猪的腹泻有６直接的关联性。２０１３年陈蕾等对四川省１６３份样本检测发现腹泻猪的ＰＫＶｓ感染率为Ｕ６４．３％，健康猪ＰＫＶｓ感染率为２９．４％。这是首次对江苏地区猪群中的ＰＫＶｓ进行流行病学报道，在４６个猪场的３９６份样本检测发现１３个地区３７个猪场的１８１（４５．７％）份的样本为ＰＫＶｓ阳性，腹泻仔猜阳性率为４５．７％，表明ＰＫＶｓ在江苏地区的腹泻仔猪中广泛的。、Ｌ存在由于样本的采样时间、区域样品密度义及猪的日龄等因素限制，造成了不同地区猪感染ＰＫＶｓ的阳性率分布的多样性。同时，对１８５份样本检测发现ＰＫＶｓ能与其它病原女口ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＧＡＲＶ存在混合感染，尤其与ＰＥＤＶ的混合感染率最高。ＰＫＶｓ与其它病原发生混合感染可能是普遍现象，韩国学者对１６７份不同年龄阶段的猪粪便样本检测发现，７１份ＰＫＶｓ阳性病料中６８份检测到多种其它病原的混合感染，包括ＰＥＤＶ、ＴＧＥＶ、ＧＡＲＶ、ＰＳａＶ、ＰＴｏＶ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏ／／（ＬＴ，ＳＴａ，６ｕＳＴｂ）；东非的学者发现ＰＫＶｓ能与星状病毒（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）发生混合感染；美国的研究学者在检测猪札幌病毒（Ｓａｐｏｖｉｍｓｅｓ，ＳａＶｓ）和诺如病毒Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，ＮｏＶｓ时也同时发（）Ｍ一现了ＰＫＶｓ。这些结果提示ＰＫＶｓ可能只是与其它病原共同存在机体内的种常见病原，抑或ＰＫＶｓ会在其它病原存在的情况下导致猪的腹泻。Ｖｅｒｍａ认为可能存在两种类型的１１ＰＫＶｓ：致病性的和非致病性的。如果ＰＫＶｓ是致病性的病毒，在猪体内如果病毒积累较一多或者在其它致病性病毒的存在下就会导致猪的腹泻，或者是ＰＫＶｓ的存在在定程度上３７促进了致腹泻病毒的毒力；本文中尽管有份样本只检测到ＰＫＶｓ，但我们不能因此确定ＰＫＶ一ｓ是引起猪腹泻的病原。Ｐａｒｋ等人用统计学分析认为ＰＫＶｓ与猪群的腹泻有定的关６一一联，但要进步确认ＰＫＶｓ与猜腹泻的关系需要进步的研究。使用Ｓ押一－－（ｓｐｅｃ姐ｃｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ）猎进行动物实验是个不错的方法，但成功分离该病毒是关键。 Ｍ扬州大学硕±学位论文一对获得的１９个ＰＫＶｓ的３Ｄ基因进行分析发现江苏地区ＰＫＶｓ的分布具有定的基因多一。ｓ样性并无地理限制值得注意的是，有些ＰＫＶ虽然是来自同个猪场，但在进化树中分布一在不同的分支，暗示在个猪群中可能有多种不同的ＰＫＶｓ基因型各自独立的存在，也可能０一是多地进行的生猪贸易导致了基因多样性的发生。Ｂｉｎｈａｉ／２１２０８显示与株来自韩国的牛ＣＰＦ－４２９３９峰病毒株席较近的亲缘关系（１．７％的核昔酸同源性和７５．０％的氨基酸同源（ＩＳＭｎ性）。牛晴病毒已经在日本、韩国、意大利等国家有发现的报道，据我们所知，目前中国尚无关于牛晴病毒的分离报道，另外，晴病毒在不同种群间进巧种间传播也有文献记录ｙｓ’ｉｓ（ｂ－ｉｎｌｉｋ）ＰＫＶｓ，因此，在这里不能排除该株与牛峭病毒相近的ｏｖｅｅ可能是来自猪牛间的种间传播。在本文中另对２０１４年８月至２０１５年２月从江苏１１个地区的猪场采集的９１份腹泻仔猪的棉拭样本和临床健康仔猪棉拭样本检测发现，腹泻仔猪ＰＫＶｓ阳性率为６４．８％１９１－５９／９，高于２０１２２０１３年的４５／１．７％临床健康仔猪感染ＰＫＶｓ阳性率为１９．８％２５２６，（）；（）＾５３低于匈牙利的５３．３％３２／６０严，日本的４５．４％ｙＷ／２９３）和中国的３０．１２％（９７Ｚ３２２，但和韩．（）６一国１９．３％１６／８３的致。这些数据说明ＰＫＶｓ在江苏地区腹泻和临床健康仔猪群中都有（）存在，但在临床健康猪群中的感染率低于腹泻猪群，送种差异除去自然因素外，ＰＫＶｓ本一步的关注身的致病性值得进。在峭病毒属中，Ｖｎ基因编码的ＶＰ１蛋白是结构蛋白中是最可变的，该蛋白可Ｗ使机体产生免疫反应。本研究中设计针对ＶＰ１基因的引物，Ｗ江苏地区腹泻仔猪和临床健康仔猪为对象，Ｗ期了解不同猪群中感染的ＰＫＶｓ的ＶＰ１基因的基因水平差异。根据结果发８￣￣１。现，２８个ＶＰ１基因的氨基酸同源性为０．３％〇〇％，核巧酸同源性为７９．６％１００％其中一核巧酸同源性与文献报道的致。与参考株的ＶＰ１基因序列比较发现ＪＳ１４２６和ＪＳ１４２５两个ＶＰ１基因从７１０部位插入兰个碱基（ＡＣＣ）而ＪＳ１３０１、ＪＳ１４０２、化１４０４、ＪＳ１４０５、ＪＳ１４０６、ＪＳ１４０７、ＪＳ１４０９、ＪＳ１４１０在７１０部位插入三个核昔酸（ＴＣＣ），这种插入可能是江苏地区感染的ＰＫＶｓ株特有的。这不是首次发现在ＶＰ１基因有核昔酸的插入。ＣＭＰ１７／２００７／ＴＨＡ２１一２４８ＣＨ￣在编码氨基酸的第位有个氨基酸的插入，／ＨＮＸＸ４／２０１２则在编码氨基酸的第２３９位有氨基酸的插入气这样的插入可能是ＶＰ１基因进化的结果，是否与ＶＰ１蛋白的功一步的验证能有关需要进。进化树分析显示在江苏地区猪群中感染的ＰＫＶｓＶＰ１基因且与ＰＫＶｓ的ＶＰ１亲缘关系较近它鳴病毒亲缘关系较远。２８个ＶＰ１基因可＞４，而与其１＾１形成一ｓ个大的群组，尤其是腹泻猪感染的ＰＫＶ，ＶＰ１基因分布在四个不同的群姐，体现定的基因多样性一，而临床健康仔猪群中感染的ＰＫＶｓ的ＶＰ１基因只分布在同个大的组中，体 杨巧组遗传进化分析５：猪啼病毒感染流行病学调查和全基因三一一ＰＫＶ现定的保守性ｓ可能存在。这种遗传进化的差异是否与的潜在致病性有关值得进步的研究。本研究成功获得了江苏不同地区ＰＫＶｓ的３Ｄ基因和ＹＰ１基因并进行了生物信息学分化并对临床健康猪群中的ＰＫＶｓ进行流行病学调查，初步了解了ＰＫＶｓ在江苏地区的感染状况和遗传进化关系。同时对腹泻样品进行了其它病原进行检测，发现ＰＫＶｓ与其它病一原能发生混合感染。希望相关数据能丰富ＰＫＶｓ流行病学的数据，进步了解ＰＫＶｓ的致一病特点。另外，需要进步研究ＰＫＶｓ的发病机制来确定其与猪腹泻的关联性，还需要对一不同国家和地区的流行株型进行进步的分析，对腹泻猪群中和非腹辑猪群中感染的ＰＫＶｓ进行区别鉴定和分析。参考文献．１Ｚｈａｎ吐ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏ打ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆ化ｅａ化ｏｅ，ｇ，ｐｇ打ｉｃｋｙｏｆａｐｏｒｃｉｎｅｒｏｔａｖｉｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉ，ｒｏｏｄｏ－－－ｉ：／ｓ２２０１５．ｌｇｙ１０．１００７００７０５０１５３４７９，（）２Ｔａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔａｌ．ＭＥＧＡ５：ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇｍａｘｉｍｕｍ１化ｄ出ｏｏｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｄｉｓｔａｎｃｅａｎｄｍａｘｉｍｕｍａｒｓｉｍｏ打ｍｅ化ｏｄｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｙ，ｐｙｂｔ－２７３９ｉｌｉｏｌｏａｎｄｅｖｏｌｕｉｏｎ２８２７３１ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｏ比ｅｖ／ｍｓｒｌ２１Ｏ．ｇｙ，，口）３Ｙｕ，Ｊ．Ｍ．ｅｔａｌ．ＣａｎｄｉｄａｔｅｐｏｒｃｉｎｅＫｏｂｕｖｉｒｕｓ，Ｃｈｉｎａ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ－ｄｏ１５８２３８２５ｉ：１０／ｅｉｄ１２００９．３２０１ｌ５０５．０８１５８．，），（４ＫｈａｍｒｉｎＰｅｔａｌ．Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓｉ打ｉｌｅｔｓＴｈａｉｌａｎ过．Ｅｍｅｒｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｃ．，，ｐｇｇｇ－２０７６ｄｏａｓｅｓ１５２０＾ｉ：１０３２０１／ｅｉｃｉｌ５１２．０９０７２４２００９．，，（）５Ｋｈａｍｒｉｎ，Ｐ．ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｋｏｂｕｖｉｍｓｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｎｓｔｏｏｌｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｈｅａｌｔｈｉｓｉ打ＪａａｎＩｎｆｅｃｔｉｏｎｅｎｅｔｉｃａｎｄｅｖｏｌｕｉｏ打：ｏｕｒｎａｌｏｆ．ｓｔｙｐｇｐ，ｇｊ－ｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｉｄｅｍｉｏｌｏａｎｄｅｖｏｌｕｉｏｎａｒｅｎｅｔｉｃｓｉｎｉ打ｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１０９５０９５ｐｇｙｙ呂，４ｄｏｉ１１．：１０．０６／．ｍｅｅｉｄ．２０１０．０６００１２０１０．，ｊｇ（）Ｓｌｅｃｌｉｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｍｓｅｓｉｎｉｓｅａａｎｄ６Ｐａｒｋ．Ｊ．ｅｔａｌ．Ｍｏｕａｒｄｅｔｅｃｔｏｎｏｆｉｉ打Ｋｏｒ，ｐｐｇｈ－ｔｅｉｒａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗＵｈｄｉａｒｒｈｅａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ１５５１８０３１８１１ｄｏｉ：１０．１００７／ｇｙ，，Ｓ－－－２０００７０５０１００７７４１（１０）．７ＤｉＰｒｏｆｉｏ，Ｆ．，Ｃｅｃｉ，Ｃ．，ＤｉＦｅｌｉｃｅ，Ｅ．，Ｍａｒｓｉｌｉｏ，Ｆ．足ＤｉＭａｒｔｉｎｏ，Ｂ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓｅｓｉｎＩｔａｌｉａ打ｓｗｉｎｅ．民ｅｓｅａｒｃｈｉ打ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｓｃｉｅｎｃｅ９５，ｐ７８２－７８５ｄｏｉ：１０．１０１６／．ｒｖｓｃ．２０１３．０６．０２０２０１３．，ｊ（）８Ｂａｒｒｙ，Ａ．Ｆ？，民ｉｂｅｉｒｏ，Ｊ．，Ａｌｆｉｅｒｉ，Ａ．Ｆ．，ｖａｎｄｅｒＰｏｅｌ，Ｗ．Ｈ．＆Ａｌｆｉｅｒｉ，Ａ．Ａ．ＦｉｒＳｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｋｏｂｕｖｉｍｓｉｎｆａｒｍａｎｉｍａｌｓｉｎＢｒａｚｉｌａｎｄｔｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｏｕｒｎａｌｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｉｄｅｍｉｏｌｏａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｅｎｅｊｐｇｙｙｇ－ｔｉｃｓｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１１１８１１１８１４ｄｏｉ：１０．１０１６／．ｍｅｅｉｄ．２０１１．０６．０２０２０１１．，，ｊｇ（）９艮ｅ山ｅｒ，Ｇ．ＫｅｃｓｋｅｍｅｔｉＳ．＆ＰａｎｋｏｖｉｃｓＰ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓｉｎｆｅｃｔｉ，，，ｐａＥｍｅｒ－ｏｎＨｕｎｒ．ｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１６６９６６９８ｄｏｉ：１０．３２０１／ｅｉｄｌ６０４．０９０９３，ｇｙｇｇ，，７２０１０．（） ＾扬州大学硕击学位论文１０ＤｉＢａｒｔｏｌｏＬＡｎｅｌｏｎｉＧ．ＴｏｆａｎｉＳ．ＭｏｎｉｎｉＭ．＆ＲｕｅｒｉＦ．Ｍ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏ，，ｇ，，，，，ｇｇ，ｆｆａｒｍｅｄｉｓｗｉ化ｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒａｓｅｓｉｎＩｔａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｄｏｉ：ｌ０．１００７／ｐｇｐｙｇｙ，－Ｓ００７０５０－－１５２３９７Ｚ２０１５．（）１１Ｖｅｒｍａ比ＭｏｒＳ．Ｋ．ＡｂｄｅｋａｉｌＭＹ．＆ＧｏａｌＩＳ．ＭＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｊ，，，，ｙ，ｅｃｕ－ｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｉｎＵ．Ｓ．ｓｗｉｎｅ．Ｖｉｒｕｓｅｎｅｓ４６５５１５ｐｇ，ｄｏ－－－５３ｉ：１０．１００７／ｓｌ口６２０１３０８７９１０巧．，口１２Ｃｈｅｎ，Ｌ．ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓＶＰｌｐｙｒｅｉｏｎｕｓｉｎｉｎｆｅｃｔｅｄｉｓｆｒｏｍＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ．Ｖｉｒｏｌｏｏｕｒｎａｌ１０２８ｇｇｐｇ，ｇｙｊ，ｄｏ－－－１ｉ：１０．１１８６／１７４３４２２Ｘ１０２８１２０１３．，（）１３ＡｍｉｍｏＪ．０．ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｋｏｂｕｖｉｍｓｅ，ｇｅｎｅｓａｎｄａｓｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓｉｎａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃｌｏｃａｌｐｉｇｓｉｎＥａｓｔＡｆｒｉｃａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ－－ｄｏ－－１５９１３１３１３１９ｉ：１０．１００７／ｓ００７０５０１３１９４２ｘ０１４．，，口）１４ＳｉｓａＺ．Ｗａｎ．ＯｋａＴ．＆ＳａｉｆＬ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｙ，，Ｑ，，，，ｇｏｆｏｒｃｉｎｅｅｎｔｅｒｉｃｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｆｉｒｓｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕ化ｓｉｎＵＳｓｐｐ－－－ｗｄｏ－ｉｎｅ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ１５８１５８３１巧８ｉ：１０．１００７／ｓ００７０５０１３１６１９５２０１３．ｇｙ，，（）１５ＹａｍａｓｈｉｔａＴ．ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｅｗｓｅｃｉｅｓｏｆｋｏｂｕｖｉｒｕｓ，ｐｓｓ－ａｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｃａｔｌｅ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆｅｎｅｒａｌｖｉｒｏｌｏ８４３０的３０７７００３．ｇｇｙ，口）１６Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｈ．Ｋ．，Ｓｏｎｇ，Ｄ．Ｓ．，Ｍｏｏｎ，Ｈ．Ｊ．＆Ｐａｒｋ，Ｂ．Ｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｋｏｂｕｖｉｍｓｅ＾ｉｎｆｅｃａｌｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｄｉａｒｒｈｅｉｃｃａｔｌｅｉｎＫｏｒｅａ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｏｕｒｎａｌｏｆｍｏｌ说山ａｒｅ，ｇｊｐ－ｉｄｅｍｉｏｌｏａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｅｎｅｔｉｃｓｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１１１１７８１１８２ｄｏｉ：ｌ０．１ｇｙｙｇ，，０１６／．ｍｅｅｉｄ．２０１１．０２．０１９（２０１ｊｇ１７ＤｉＭａｒｔｉｎｏＢ．ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｏｖｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｅｓｉｎＩｔａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ，ｙ－－－ｏｆｖｉｒｏｌｏ１２２３９６ｄｏｉ１０－５７３Ｗ．１００７／００７０５０２１４３９ｚ０１．：ｓ１ｇｙ，，口巧１８ＲｅｕｔｅｒＧ．ｏｒｏｓＡ．ａｎｋｏｖｉｃｓ．＆Ｅｅｄ．ＫｏｂｕｖｉｒｕｓｉｎｄｏｍｅｓｔｉｃｓｈｅｅＨ，，Ｂ，，Ｐ，Ｐｇｙ，Ｌｐ，－ｕｎａｒ．Ｅｒｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１６Ｗ９８７０ｄｏｉ１０．３２０１／ｉｄｌ６０５．０９１％４２０１ｍｅ：ｅｇｙｇｇ，，（０．）．１９Ｙａｎｇ，Ｚ．ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣＯ虹ｆｅｃｔｉｎａｔｈｏｅｎｓｉｎｄｉａｒｒｈｅｉｃｉｓｉｎＪｉａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｐｇｐｇｇ，ｇ－－－－１５９３４０７３４１２ｄｏｉ１０．１００７／ｓ００７０５０１４２２０４２０１４．：ｙ，，口）２０Ｒｅｕｔｅｒ，Ｇ．，Ｂｏｌｄｉｚｓａｒ，Ａ．，Ｋｉｓｓ，Ｉ．＆Ｐａｎｋｏｖｉｃｓ，Ｐ．ＣａｎｄｉｄａｔｅｎｅｗｓｐｅｃｉｅｓｏｆＫｏｂｃｍｅ－ｕｖｉｒａｓｉｎｏｒｉｎｅｈｏｓｔｓ．Ｅｒｇｉｎｇｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ化ｓｅａｓｅｓ１４１９６８１９７０ｄｏｉ：１０．３２０１／ｅｉｐ，，ｄｌ４１２．０８０７９７２００８．（）２１Ｏｋｉｔｓｕ，Ｓ．ｅｔａｌ．ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓＶＰｌｒｅｇｉｏｎｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｐ－－－－ｉｓｉｎＪａａｎａｎｄＴｈａｉｌａｎｄ．Ｖｉｒａｓｅｎｅｓ４４２５３２５７ｄｏｉ：１０．１００７／ｓｌｌ２６２０１１０６９２ｇｐｇ，，７２０１２．（）２２ＣａｏＷ．ｅｔａｌ．ＣｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅｓｅｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｖａｒｉａｎｔＣＨ／Ｈ，ｐｇｑｐ－ｒ９４７－ＮＸＸ４／２０１２：。口０。．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｏｌｏｇｙ８６１１ｄｏｉ１０．１１２８／ＪＶＩ．（ｍ３７．，，） ．杨振：猪幡病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析５＿１第Ｈ章江苏地区猪峭病毒全基因组的遠传进化分析根据ＧｅｎＢａｎｋ公布的ＰＫＶｓ全基因组序列，设计１２对针对ＰＫＶｓ全基因组的特异性引物，－ｓ－０对从江苏地区检测的２株ＰＫＶ进行全基因测序分析。ＪＳ１ＣＨＮ检测自腹湾仔猪，除去’－ｏｌＡ基因组全长为８２１４ｎｔ，开放阅读框（ＯＲＦ基因全长为７４７０ｎｔ５ＵＴＲ长５７６出。ｐｙ（）），度为－－ＪＳ０２ａＣＨＮ来自临床健康仔猪，除去ｐｏｌｙＡ基因组全长为８１２１ｎｔ，序列分析发现，两个（）－－ＰＫＶｓ与参考株序列编码区氨基酸和核巧酸同源性分别为９４．３％９６．３％．４％和８７．８％８９，而与’’￣￣５６－－其它赠病毒则为．２％６５１％５９．０％６６．１％。５ＵＴＲ３ＵＴＲ与ＰＫＶ．和和其它ｓ核巧酸同源性一－－－９５－－－为．１％９７．０％和８９．１９７．０％。ＪＳ０２ａＣＨＮ和化０１ＣＨＮ处于同％进化树分析显示分支并－和ＰＫＶｓ较近０１細化在巧６０扣－。对ＰＫＶｓ全基因组进行重组分析发现，版５９８２１１枢域存在潜在的重组事件，为了解ＰＫＶｓ的重组特点，需要对更多的全基因序列测序分析。１，？材料与方法＿１．１材料１．１．１病料来源和处理２０１３年１２月和２０１４年Ｕ月分别从江苏连云港地区和南通地区经ＰＫＶｓ３Ｄ基因引物’－１７０Ｃ冻。检测阳性的腹泻仔猪粪便样本和临床健康仔猪粪便样本各份，样品于存１．１．２主要试剂’＞一５ＲＡＣＥ和３ＲＡＣＥ试剂盒购自扣总？化？公司，其余同研究内容、二。１．１．３主要仪器一二同研巧内容、１．２方法１．２．１引物设计１２ＰＫＶ参考王长松和Ｒｅｕｔｅｒ扩增猪峰病毒全序列引物设计针对ｓ全基因序列的十对引’’－－３－１－曲斯和￥１畑１全序列设计针对？］：￥５。物，同时根据＜３端和３端引物引物序列和长度如下表所示： ＾扬州大学硕壬学位论文３－表１扩增ＰＫＶｓ全基因组所用序列Ｔ－ａｂｉｉ化ｉｌｅ３１ＰｒｍｅｒｓｕｓｅｄｎｓＳｔｕｄｙ１引物名称引物序列八３＾物位置扩增大ｙＲＡＣＥ－Ｏ山ｅｒ（ＴａＫａＲａＣＡＴＧＧＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＡ）＂化ｐ＇ＰＫＶ－－－ｓ５ＯｕｔｅｒＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＧＣＡＡＣＣＡＣ４８４５０２＊－５ＲＡＣＥＩｎｎｅｒＴａＫａＲａＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＴＣＧＡＴＧ（）巧化ｐ＊ＰＫＶ－－－ｓ５ＩｎｎｅｒＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＣＣＣＡＴＴＡＣＴＣＡ扣８３巧－－ＰＫＶｓ－ＫｌＦＣＣＡＣＣＧＡＴＡＣＴＴＣＡＣＴＣＣＡＣＴＣＣ６５？７７４６ｂｐ－－ＰＫＶｓＫ－ｌＲＣＧＡＧＧＧＡＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＡＧＡＧＧＣ７８８８１０－－ＰＫＶ－ＳＫ２ＦＴＡＣＡＴＣＡＡＣＧＣＧＣＡＡＣＡＣＣＧ７３０７４９１４８５ｂｐＰＫＶＳ－Ｋ２■反ＧＧＴＧＡＣＴＴＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＧＧＡ２＾１９４２２１４－ＰＫＶＳ－Ｋ３－ＦＡＣＣＣＣＧＡＡＣＴＣＣＴＣＴＡＣＴＴＧＴＧ２０９８２＂９８０８ｂｐ＾ＰＫＶＳ－Ｋ３－ＲＧＧＡＴＡＣＣＡＣＧＣＡＧＧＧＴＧＡＡＡＧＡ２８８４２９０５ＰＫＶ－－－ＳＫ４ＦＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＣＴＴ２８６６２８８７１１４抓ｐＰＫＶ－－ＳＫ４ＲＡＡＡＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＧＧＡＧＴＴＣＡ巧９３确３ＰＫＶＳ－Ｋ５－ＦＣＣＣＧＴＣＴＴＧＧＣＣＴＣＡＡＣＧＣＡＴＡＣ－３８２７３８４９巧６ｂｐ－￣ＰＫＶＳＫ５－ＲＡＴＧＡＧＣＣＡＣＴＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＧＡＣ４７４巧Ｉ７９■＊？ＰＫＶＳ－Ｋ６－ＦＴＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴＡＣＴ４巧４＾巧６．８１６ｂｐＰＫＶ－－－ＳＫ６ＲＴＴＧＧＡＡＧＴＧＡＣＣＡＣＡＡＣＧＡＣＣＴＧ５３４７５３６９ＰＫＶ－－—ＳＫ７ＦＴＴＴＣＡＴＣＧＴＧＣＣＡＴＴＧＧＣＴＡＡ巧９５５３５！７７０ｂｐＰＫＶＳ－Ｋ７－ＲＧＡＧＡＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＡＣＧＧＡＴＣ６０４４－６０６４ＰＫＶ－－ＧＡＧＡＡＡＡ－ＳＫ８ＦＡＡＣＧＧＣＡＧＴＧＡＧＡＣＣＡ５９８７６００９９４８ｂｐＰＫＶ－－－ＳＫ８ＲＧＴＧＴＴＣＣＡＴＴＧＡＴＡＧＣＣＴＣＴＴＣＣ６９１２６巧４ＰＫＶ－－￣ＳＫ９ＦＣＡＡＣＣＡＧＣＣＧＴＣＣＧＣＡＣＴＣＡＡＡＡ６巧９６巧Ｉ巧４ｂｐＰＫＶ－－－ＳＫ９ＲＣＣＴＴＧＡＴＧＡＡＴＧＡＣＧＧＡＴＧＧＡＴＧ７化０７６７２－ＰＫＶｓ－Ｋ－ｌＯＦＴＣＴＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣｍＴ７５６６７５８８６４５ｂｐＰＫＶ－－－ｓＫＷＲＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＴＡＡＡＧＧＡ８１８６８２１０＊３ＲＡＣＥ－Ｏｕｔｅｒ（ＴａＫａＲａＴＡＣＣＧＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴ）５４７ｂｐ＇－ＰＫＶ－－ｓ３ＯｕｔｅｒＣＧＣＣＴＣＡＴＴＧＧＡＧＡＣＧＡＡ７７７１７７９１＇３ＲＡＣＥ－ＩｎｎｅｒＴａＫａＲａＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ（）４４０ｂｐ＇ＰＫＶｓ－３－－ＩｎｎｅｒＣＧＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＣＣＴＧＡＴＧＡＣ７４０２７４１９１．２．２总ＲＮＡ的提取ｅｎ一Ａｘ试剂盒方法提取总ＲＮＡ．使用ｙｇ，提取和反转录参照研巧内容的１．２．２和１２．３所述方法。１．２．３ＰＣＲ扩増基因细各片段Ｗ设计的１２对特异性引物用ＬＡＴａｑＤＮＡ聚合酶扩增ＰＫＶｓ的全基因片段，反应体系°°为５０阵，反应程序使用Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ方法，为９５Ｃ，５ｍｉｎ，９５Ｃ，１１１１１１１，５８＾化１４５８反应°°°１０％（：１１１１（：４５２（：１１１１扣个循环；，的５５，３，７反应３５个循环；７２＾延伸５〇１心 杨振：猪睛病毒感染流行病学调查和全基因纽遗传进化分析？ＲＮａｓｅＦｒｅｅ姐２〇１５ｉＬｊ２ＸＬＡＴａｑｂｕｆｆｅｒ巧曲ｄＮＴＰｓＭｉｘ２．５ｍＭ４Ｌ（）ｐ上游特异性引物２阵下游特异性引物２阵ＬＡＴａｑＤＮＡ聚合晦０．５阵ＴｅｍｌｅｔｅｃＤＮＡ１．５ＬｐｎＴｏｔａｌ５０ｉＬ｜，，１．２．４ＰＣＲ扩増５端和３端ａＫａＲａ公司＇＇实验步骤按Ｔ５ＲＡＣＥ和３ＲＡＣＥ说明书操作进行：＇（１）５ＲＡＣＥ反应①去磯酸化处理。＂＂按下列姐份配制去憐酸化反应液：ＴｏｔａｌＲＮＡ（１ｊ，／ｉＬ）２｜ｇ｜睐ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／，Ｌ）１ｊ．Ｌｐ｜ｘ１０ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅＢｕｆｆｅｒ（ＭｇＱ２Ｆｒｅｅ）５＾ＬＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｃａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）（１６Ｕ／ａＬ）０．６ｉＬｉ｜ＲＮａｓｅＦｒｅｅ脏〇４１．４ｉＬ２｜°Ｃ反应５０１小时上述反应液中加入２０ｉＬ３ＭＣＨ３ＣＯＯＮａ（Ｈ５．２），１３０；向｜的ｐ件的ＲＮａｓｅＦｒｅｅ姐２〇后，充分混匀；００ｉＬ２５ｘ、加入２的苯酌／氯仿／异戊醇（：２４：１），充分混匀后１３００〇室温离屯５，ｆｇ分钟ｉｃｒｏｔｕｂｅ中；，将上层水相转移至新的Ｍ２００＞＜＾的氯仿１３０００５，加入，充分混匀后室温离也分钟｜，３将上层水相转移至新的Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ中；加入２阵的ＮＡＣａｒｒｉｅｒ后均匀混合，加入２００ｎＬ的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却１０’ｘ。１３０００４Ｃ２０分钟，；，ｇ离也分钟奔上清〇５〇０７〇／＞＜加入〇冷乙醇（獻〇８６？巧６地２〇配制）漂洗，１３０００４１：离也５曲的，３分钟，７ＲＮａｓｅＦｒｅｅ脏０－ｅａｅｄ弃上清后干燥，ｔｒｔＲＮＡ。；加入阵的２溶解沉淀得到ＣＩＡＰ②‘＂反应哇帽子。 Ｍ扬州大学硕去学位论文；’＂’按下列组份配制去帽甲Ｃ反应－反应液，３７１小化得到ＣＩＡＰ／ＴＡＰｔｒｅａｔｅｄＲＮＡ：Ｃ－ｔｔＩＡＰｒｅａｅｄＲＮＡ）７冲民Ｎａｓｅｌｎｈ化ｉｔｏｒ（４０Ｕ／Ｌ）１ｉＬｊ｜｜ｘｔｉ１〇ＴＡＰＲｅａｃｏｎ良ｕｆｆｅｒｌｉＬ｜ＴｏｂａｃｃｏＡｃｉｄＰｙｒｏｈｏｓｈａｔａｓｅ（０．５Ｕ／ｊＬ）ＩｉＬｐｐ｜ｊＴｏｔａｌ１０ｉＬ）＇感５ＲＡＣＥＡｄａｔｏｒ。ｐ的连接首先配制下列溶液；Ｃ－ＩＡＰ／ＴＡＰｔｒｅａｔｅｄＲＮＡ５ｊＬ＼＇Ｍ５ＲＡＣＥＡｄａｐｔｏｒ（１５）ｌｉＬ＼＼ＲＮａｓｅＦｒｅｅ姐〇４２冲６５Ｃ保温５分钟后冰上放置２分钟，然后加入下列试剂，１６ｒ反应１小时：ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／〇Ｌ）ＩｘＬ｜ｆ５ｘＲＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＢｕｆｅｒ８＾Ｌ４０％ＰＥＧ６０００２〇ＬｎＴ４ｉＲＮＡＬｇａｓｅ（４０Ｕ／ｎＬ）ｌｉＬ＾向上述反应液中加入２０咕的３ＭＱＢＣＯＯＮａ（ｐＨ５．２），１４０ｉＬ的ＲＮａｓｅＦｒｅｅｄＨ２０［后，充分混匀；ｘ：；１）加入２００咕的苯酪／氯仿／异戊醇（２５２４，充分混匀后１３０００室温离私５分，ｇ钟，将上层水相转移至新的Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ中；ｘ、加入２００阳的氯巧，充分混匀后１３０００室温离屯５分钟，将上层水相转移至新的，ｇＭｉｃｒｏｔｕｂｅ中；加入２ｎＬ的ＮＡＣａｒｒｉｅｒ后巧匀混合，加入２００ｎＬ的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却１０‘ｘＣ、分钟，１３０００４离屯２０分钟，弃上清，ｇ；？加入５００ｌＬ的７０％冷乙醇（ＲＮａｓｅＦｒｅｅｄＨ２Ｏ配制）漂洗，１３０００ｘ４Ｃ离也５分钟，弃＾，ｇ上清后干燥；加入６阵的ＲＮａｓｅＦｒｅｅ地２〇溶解沉淀，得到ＬｉｇａｔｅｄＲＮＡ。④反转录反应。‘’按下列组份配制反转录反应液；３０Ｃ１０ｍｉｎ４２ＣＩｈＣ１５ｍｉｎ，反应条件为；７（Ｔ：； 杨振：猪雖病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析６＿ＪＬｉｇａｔｅｄＲＮＡ６ｉＬ｜Ｒａｎｄｏｍ９ｍｅｒｓ（５０ｉＭ）０．５ｘＬ｜｜－ＭＬＶＳｘＭＢｕｆｆｅｒ２ｐＬｄＮＴＰ（ｌＯｍＭｅａｃｈ）１ｉＬ＼ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／ｉＬ）０．２５［阵－－０ＭＭＬＶ（ＲＮａｓｅＨ）．２５阵Ｔｏｔａｌ１０Ｌｐ？ＯｕｔｅｒＰＣＲ反应。＂６巧＂按下列组你配制ＯｕｔｅｒＰＣＲ反应液，ＰＣ民反应条件如下为９４Ｃ３ｍｉｎ；９４Ｃ３０ｓ，Ｃ＂°３０ｓ２０Ｃｃｌｅｓ７２Ｃ１ｍｉｎ７２Ｃ１０ｍｉｎ：，ｙ；，④的反转录反应液５ｎＬ？ｘｃ￣ＩＤＮＡＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｅｒ口５咕ｘ＋１〇ＬＡＰＣＲＢｕｆｆｅｒＩＩ（Ｍｇ２Ｆｒｅｅ）４ｉＬｊＭｇＣｂ（ｌＯｍＭｅａｃｈ３ｊＬｊＬＡＴａｑ０．２５ｐＬＯｕｔｅｒＰｒｉｍｅｒ２ｉＬ＼＇５ＲＡＣＥＯｕｔｅｒＰｒｉｍ知２ｉＬ｜ＲＮａｓｅＦｒｅｅｄＨｓＯ２８．７５Ｔｏｔａｌ５０Ｌｐ⑥ＩｎｎｅｒＰＣＲ反应。‘’ｅｒＰＣ民反应液：９４Ｃ３ｍｉｎ９４３０ｓ５５按下列组份配制Ｉｎｎ，ＰＣＲ反应条件如下；Ｃ，，’’Ｃ３０ｓ，２５Ｃｙｃｌｅｓ；７２Ｃ１ｍｉｎ，７２Ｃ１０ｍｉｎ：ＯｕｔｅｒＰＣＲ反应液１ＬｐｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭｅａｃｈ）ＳＬｐｌＯｘＬＡＰＣＲＢｕｆｆｅｒＩＩ（Ｍ２＋Ｆｒｅｅ）５ｉＬｇ＼ＭｇＣｌ２（ｌＯｍＭｅａｃｈ）５阵ＬＡＴａ０．５ｑ阵恃弄性ＩｎｎｅｒＰｒｉｍｅｒ（１０２＼＼Ｌ＇５ＲＡＣＥＩｎｎｅｒＰｒｉｍＫ（１０ｉＭ）２ＬｊｎＲＮａｓｅＦｒｅｅ姐２〇２６．５＾ｉＬＴｏｔａｌ５０ 竺扬州大学硕±学位论文＇（２）３ＲＡＣＥ反应°°：４２Ｃ６０ｍｉｎＣ１５ｍｉｎ；①反转录反应，反应条件为，７０。反应；，体系为ＴｏｔａｌＲＮＡＷ．Ｇｎ／３口ｇ阵）阵＇３ＲＡＣＥＡｄａｔｏｒ（５ｉＭ）１ｐ｜５ＸＭ－ＭＬＶＢｕｆｆｅｒ２ｊＬｊｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（ｌＯｍＭｅａｃｈ）１ｊＬｊＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／ｉＬ）０．２５ｔ咕－－ＭＬＶＭ（ＲＮａｓｅＨ）０．２５阵ＲＮａｓｅＦｒｅｅ肋２〇２．５ＬｎＴｏｔａｌ］〇Ｌｎ②套式ＰＣＲ反应。。。’〇山舟？〔民反应反应条（：９４０３１１１１１１９４１：３０，５５〇３０３，３０£（；１的：１１１１如件为；８７；７２＾‘７２ＣｌＯｍｉｎ。反应体系如下；．①的反转录反应液３ｎＬｘｃ１ＤＮＡＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｅｒＩＩ７Ｌｉｊ特异性ＯｕｔｅｒＰｒｉｍｅｒ（１０｜ｊＭ）２ｊｘＬ＇Ｍ３ＲＡＣＥＯｕｔｅｒＰｒｉｍｅｒ（１０）２Ｌｎｎｘ＋ＦｌＯＬＡＰＣＲＢｕｆｆｅｒＩＩ（Ｍｇ２ｒｅｅ）４ＬｐＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）３ｐＬＬＡＴａｑ？（５Ｕ／ｆｔＬ）０．２５［ｉＬＲＮａｓｅＦｒｅｅ姐〇２８．７５２阵Ｔｏｔａｌ５０ＬｐＩｎｎｅｒＰＣＲ反应反应体系及反应条件如下：ＰＣＲ产物ＦＺ②的ｆｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（２．５ｔｎＭｅａｃｈ）８＾Ｌ＋２ｘ１〇ＬＡＰＣＲＢｕｆｅｒＩＩ（ＭＦｒｅｅ）５ＬｇｐＭｇＣｂ（２５ｍＭ）５ＬｎＴａＫａＲａＬＡＴａ？（５Ｕ／Ｌ）０．５Ｌｑ＾ｐＧｅｎｅＳｐｅｃｉｆｉｃＩｎｎｅｒＰｒｉｍｅｒ（１０＼ｉＭ）２ｆｉＬ＾３ＲＡＣＥＩｎｎｅｒＰｒｉｍｅｒ（ｌＯ＾Ｍ）２ｉＬ＼ＲＮａｓｅＦｒｅｅｄＨａＯ２６．５ＬｐＴｏｔａｌ５０ 杨振：猪蜡病毒感染流行病学调查和全基因纽遗传进化分析？；１．２．５琼脂糖凝胶电泳．２％的琼脂糖凝胶１０ＰＣＲ。配制１，取阵的产慨进行电泳分析２目的基因片段的测序分析２．１目的片段连接一目的片段的回收、连接和转化参照研究巧容２．２、２．３和２．４所述方法。２．２阳性质粒的筛选与鉴定ＤＮＡ的提取和酶切鉴定参照研究内容一质粒２．５．１和２．５．２所述方法。２．３目的片段的拼接将含有鉴定为阳性的重组质粒的菌液送金斯瑞公司进行测序，测序结果使用ＤＮＡＳｔａｒ．３Ｌａｓｅｒｅｎｅ．ｖ７．１和ＭＥＧＡ５．０，ｓ用ＤＮＡＳｔａｒ丄ａｓ知ｅｉｉｅ．ｖ７．１ｇ软件分析将获得的ＰＫＶ各片段ｇＳｅＰＫＶ全基因序列已软件中的Ｍａｎ进斤首尾拼接，获得了两个ｓ。ｑ‘２．６ＰＫＶｓ全基因的序列分析２．（Ｓ．１同源性分析选取ＧｅｎＢａｎｋ公巧的峭病毒的全基因序列，用ＤＮＡＳｔａｒ．Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ．ｖ７．１软件中的’’－ＭｅＡ－ｌｉｎ对其５ＵＴＲ、３ＵＴＲ、ＣＤＳＷ及ＶＰ１序列进巧同源性分析。。ｇｇ２．６．２重组分析ｅｎＢａｎｋ已３－２）选取目前Ｇ公布的所有ＰＫＶｓ的全基因序列巧，使用生物信息学软件４Ｓ－－－０２ａ－ｉｍＰｌｏｔ３．５．ｌ软件包和ＲＤＰ３．４４软件包对ＪＳ０１ＣＨＮ和化ＣＨＮ可能发生的重组事件进行检测。表３－２文中选用的在ＧｅｎＢａｎｋ公布的ＰＫＶｓ全序列Ｔａｂ－ｉｉｒｓｒａｉｎｓｗｉｈｓｅｉｌａｂｌｅｉｎｈｅＧｅｎＢａｎｋｌｅ３２ＰｏｒｃｎｅＫｏｂｕｖｕｓｔｔｑｕｅｎｃｅｓａｖａｔｄａｔａｂａｓｅｔｈａｔｗｅｒｅｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ参考序列国家ＧｅｎＢａｎｋ登录号Ｓ－－ｌＨＵＮ匈牙利ＮＣ０Ｕ８２９Ｙ－－２巧巧９ｌＣＨＩ中国ＧＵＫ－３０－ＨＵＮ匈牙利Ｇ２４９Ｑ１６ＩＣＨ－ＨＮＸＸ－４中国１Ｘ４０１３３ＣＨ－ＨＺ中国ＪＸ８２７巧８ Ｍ扬州大学硕击学位论文参考序列国家ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＧＳ－－１２０１２中国ＫＣ４２４６３９ＧＳ－２－２０１２中国ＫＣ４２４６４０ＸＸ中国ＫＣ２０４６８４ＳＨ－Ｗ－ＣＨＮ中国Ｎ６３０Ｊ５１４ｓｗＫｏＶｃｈ４４１中国ＫＦ５：３９７６３ＷＵＨ１中国ＪＱ的２０的３结果３．１ＰＣＲ护增基因组各片段使用针对猪嘴病毒全基因序列的１０对特异性引物，用ＬＡＴａｑ酶扩增出了清晰地目的ＫＪＳ－０－－１ＣＨＮＫ１Ｋ１０；１４８５ｂ片段，各片段用命名，其中各片段大小分别为７４６ｂｐ，ｐ，’８０８ｂｂｂｂ－－－，１１４抓，９３６，８１６ｂ，７７０，９４８ｂ，９３４，６４５ｂＪＳ０２ａＣＨＮ段ＫｌＫｌＯｐｐｐｐｐｐｐｐ；各片大小分别为：７４６ｂｐ，１４８５ｂｐ，８０８ｂｐ，１１４８ｂｐ，８４６ｂｐ，８１６ｂｐ，７７０ｂｐ，９４８ｂｐ，９３４ｂｐｒ６４５ｂ。ｐＭＫ１Ｋ２Ｋ３Ｋ４Ｋ５Ｋ６Ｋ７Ｋ８Ｋ９ＫＩＯＡＭＫ１Ｋ２Ｋ３Ｋ４Ｋ５Ｋ６Ｋ７Ｋ８Ｋ９ＫＩＯ２５０ｂｐ■■■■■■■Ｂ－图３－ＴＰＣ１ＲＲ扩增ＰＫＶｓ基因组各片段－ＡＪ－Ｏ－ＣＨＮＤＬＫ－－ＭｌＫｌＯＪＳｋ；Ｓｌ；：２０００；：１０再段；Ｂ：０２ａＣＨＮＭ：ＩＫｂＤＮＡＭａｒｅｒ；；－－Ｆｉ．３１ＡｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＫＶＳｃｏｍｅＲＴＰＣ民ｇｐｐｌ化ｅｎｏｍｅｂｙｇ 杨振？：猪啼病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析’’３．２ＰＣＲ扩増５端和３端’’＂＂按照试剂盒说明书和设计的特异性套式ＰＣ艮引物，分别扩增出５端和３端外套＂＂和内套，结果见下图；ｍｍ誦．．．ＪＳＯＯｂｐＭ〇Ｈ４３８ｂＭｐｌｏｏｏｂ＾Ｊｐ７５０２５０ｂｐＨ２９３ｂｐ５４７ｂｐ＾ｍＨ＾ｇｌＯＯｂｐ２５０ｂ４４０ｂｐｐ藤ｐ’’－２图３ＰＣ民扩增ＰＫＶｓ基因组５端和３端’’’’ＭＤＬＭａｒｋｅｒ１５ＲＡＣＥ２；５ＲＡＣＥ３３ＲＡＣＥ：：２０００；；内套；外套；：内套；Ｂ３ＲＡＣＥ外套；’，，－ＦｉｆＰｋｉｇ．３２Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｏｎ５ＲＡＣＥａｎｄ３ＲＡＣＥｏｖＳｃｏｍｐｌｅ化巨ｅｎｏｍｅｂｙＰＣ民３．３质粒ＤＮＡ的酶切鉴定ｃｏＲ－－－－使用￡Ｉ对获得的ＪＳＯｌＣＨＮ和化０２ａＣＨＮ十片段阳性重组质粒进行酶切鉴定，经凝胶电泳分析结果如下；■麵―ｒＡＢ３－３－－－－图ＪＳ０１ＣＨＮ和化０２ａＣＨＮ全基因各片段阳性重纽质粒单酶巧电泳－－－－－Ａ：ＪＳ０１ＣＨＮＭ：ｂＤＮＡＭａｒｋｅｒＫ１Ｋ１０ＢＪ０２ａ１Ｋ：１０：ＳＣＨＮ；；片段；；－ＩｍＦｉｒａｓｍｎｅｎｚｉｇ３３ｄｅｎｔｉｆｃａｔｉｏｎｏｆｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｉｄｂｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｙｅｄｉｅｓｔｉｏｎｐｙｇ３．４ＰＫＶｓ全基因的序列分析３乂１全基因序列的拼接ｓ－－将获得的各片段首尾拼接后，获得了两株ＰＫＶ全基因序列，ＪＳ（ＨＣＨＮ检测自腹泻猪样本，除去ｐｏｌｙ（Ａ）尾基因组全长为８２１４ｎｔ，开放阅读框（ＯＲＦ）基因全长为７４７０ｎｔ， 扬州大学硕壬学位论文＾；’’－－－５ＵＴＲ长度为５７６ｎｔ－，３ＵＴＲ基因序列长度为１６８ｎｔ。ＪＳ０２ａＣＨＮ来自临床健康仔猪，除’ｏ－去ｌＡ基因姐全长为８１別化开放阅读框ＯＲＦ基因全长为７３７６ｎｔ，５ＵＴＲ长度为ｐｙ（）（）’５７７ｎｔ－ａｓ上传到ＧｅｎＢａｎｋ，３ＵＴＲ基因序列长度为化７ｎｔ。经ｍｔ分析后，获得的登录号分－别为－－－９ＫＰ１４４３１８和ＫＰ２６０５０７。与参考序列Ｓ１ＨＵＮ（ＮＣ０１１８２９）和Ｙ１ＣＨＩ（ＧＵ２９２５５）’－－比较发现ＪＳ０－１ＣＨＮ的ＶＰ１基因编码的氨基酸第２３７位插入Ｈ个连续的碱基，在３ＵＴＲ’一一－基因的ＪＳ０２ａ－ＣＨＮ２Ｂ３０－ＵＴＲ插入１０８位插入个碱基；的编码区缺失个氨基酸，５个碱基。ＰＫＶｓ全基因－－使用ＭＥＧＡ５．０软件绘制序列的进化树。结果显示，ＪＳ０１ＣＨＮ和一－ＪＳ０２ａ－ＣＨＮ与猪峭病毒处于个大的分支，而与其它峭病毒亲缘关系远，但又与其它不同一－４来源的猪崎病毒不同，形成独立的个小分支（图３）。ｎｅｕ￣￣＼ｒｕ▲Ｐｏｒｃｉｋｏｂ＾ｓ／ＪＳ０２ａＣＨＮ／２０１４Ｋ戶２６０５０７（）１００１ＩＰｏｒｃ￣￣ｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓＷＳ０１ＣＨＮ／２０１３ＫＰ１４４別巧■（Ｐ－－ｒｃｉｎｋｂｕｉ／ＳＨＷＣＨＮＪＮ６３０５１４，ｏｅｏｖｎｊｓ（），？Ｐｏｒｃｖｒｉｎｅｋｏｂｕｉｕｓ／ＸＸＫＣ２０４６８４（）ｖ－Ｐｏｒｃｒｉｎｅｋ化ｕｉｕｓ／ＣＨＨＮＸＸ４（ＪＸ４０巧２３）ＩＴ６ｉ戶ｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／ｓｗＫｏＶＣＨ４４１（ＫＦ的９７６３）ｍｉＰｏｒｃｖ－ｉｎｅｋｏｂｕｉｒｕｓ／ＣＨＨ２ＪＸ８２７５如（）Ｐｏｒｃｒ－＂ＧＵ２９２５５９ｉｎｅｋｏｂｕｖｉｕｓ／Ｙ１ＣＨＩ（）ＩＰ－ｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ／ＧＳ１如ＣＨＫＣ４２４６巧１２（》［１００Ｉ８４Ｉｎｅｏｂｕｖ－戶ｏｒｃｒｕｓｉｋｉ／ＧＳ２２０１２ＣＨ（ＫＣ４２４６４０）ｎｅｖＰｏｒｕｒｃｉｋｏｂｕｉｓ／ＷＵＨｉｙＱ６９２０６９）ｊＰｏｒｃ－ｉｎｅｋｏｂｕｖｉ／Ｋ３０４ＨＵＮ／２００８２４９化ｒｕｓ但Ｑ１）７４「ｖ－－Ｐｏｒｃｒｉｎｅｋｏｂｕｉｕｓ巧１ＨＵＮ（ＮＣ０１１的９）ｖｖ－Ｂｏｒｉｎｅｋｏｂｕｉｕｓ／Ｕ１（ＮＣ００４４２１）Ｉ品ＴＳｈｅｅｋｏｂｕｖ－ｉｒｕｓ／ＴＢ３ＨＵＷ２００曰（ＧＵ２４放９３ｐ）＊Ａｖｉｃｈｉｉｍｓ（ＮＣ００１９ｌ８）ＩＣａｎ－ｉｎｅｋｏｌｘｉｖｉｒｕｓ／ＵＳＰＣ００８２ｙＮ０说５４１》１００［ＩＭｏ－－１００ｕｓｅｋｏｂｕ＼ｉｒｕｓ／Ｍ５ＵＳＡ（ＮＣ０１５９３６）Ｉ１０．０５－－－－－４ＪＳ０图３１ＣＨＮ和ＪＳ０２ａＣＨＮ全基因组核苦酸序列进化树分析Ｆ￣－－－－ｉ４ＰｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｌｓｉｓｏｆｔｈｅＭｌｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎ说ｏｆＪｆＳ０１ＣＨＮｄｔｏｔｈｅｒＷ她ｇ．３ｙｇｎａｙｇａｎＪＳ０２ａＣＨＮｇｅ－ｏｔｈｅｒｓｋｏｂｕｖｉｍｓｓｔｒａｉｎｓｄｅｏｓｉｔｅｄｉｎＧｅｎＢａｎｋｕｓｉｎｇｔｈｅＮｅｉｈｂｏｒｏｉｎｉ打ｍｅｔｈｏｄｗｉ化ｂｏｏｔｓｔｒａａｎａｌｓｉｓｐｇｊｇｐｙＩＯＯＯｒｅＨｃ汹ｅｓｗｉｔｈＭｅａＳｆｔｗｌｉｉ．Ｏｓｏａｒｅ．Ｂｏｏｔｓｔｒａｖａｕｅｓｏｆ＞５０％ａｒｅｎｄｉｃａｔｅｄａＵｈｅｃｏｒｒｅｓｏｎｄｎ（’ｐ）ｇｐｐｇｂｒａｎｃｈｅｓ．３．４．２同源性分析’’ａｒ软件对ＰＫＶｓ的５－ＵＴＲ－用ＤＮＡＳｔ、３ＵＴＲ、ＣＤＳＩ＾及ＶＮ序列进行同源性分析发现，－－－－０－ａ％和指１ＣＨＮ和ＪＳ０２ＣＨＮ全基因沮与参考ＰＫＶｓ全基因核昔酸同源性分别为８８．５％８９．７－８８－－－－．５％８９．９％ＪＳ０２ａＣＨＮ与ｓｗＫｏＶＣＨ４４１８９．９％ＪＳ０１ＣＨＮ与参，同源性最高，为；考株ＣＨ－ＨＮＸＸ－４同源８９性最高．７％。与Ａｉｃｈｉｖｉｍｓ、Ｂｏｖｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ、Ｓｈｅｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓ，为ｐ 杨振：猪婿病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析（ｎ＿－－－－ａｎ／ＴＢ３ＨＵＮ、Ｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓ／ＵＳＰＣ００８２、Ｍｏｕｓｅｋｏｂｕｖｉｍｓ／Ｍ５ＵＳＡ的核昔酸同源性为－－－－－５３．Ｐ／Ｏ６０．９％。在编码区，ＪＳ０１ＣＨＮ和Ｓ０２ａＣＨＮ与ＰＫＶｓ参考株的核昔酸和氨基酸同源－－－８７．．１％性分别为．８％８９．３％和９４．３％９６．４％，而与其它崎病毒的同源性分别为巧０％６６和％－１．２％６５．％对检测的两株ＰＫＶｓ的ＶＰ１基因分析发现与其它嚼病毒的核巧酸同源性为；８－－－－－１．０％８５．３％８７．５％９３．３％，ＪＳ０１ＣＨＮ的ＶＰ１蛋白在２３７位４７左右插，氨基酸同源性为调）’一Ｔ－－－－入个氨基酸（）ＪＳ０２ａＣＨＮ在２Ｂ区缺失３０个氨基酸（图３５）。与参考株相比，５ＵＴＲ，’。。－－－－９５和３ＵＴＲ区的基因同源性最高别为．１／〇９７．０／〇和８９．１％９７．０％表３３。，分（）巧夸巧呼琴呼巧呼ｒ！．．．．＊？．１＼辟巧．？，扣Ｉ￥，，，？！，，，，，巧絶欄辟蜘巧．Ａ．．．…々．ＷＭＵＷ沪£０１！？ＩＴ，Ｑ巧．ＳＴＩＤＳ战？卿巧。５１４）．．，．．４４Ｆ７ＸＴｔ．ＣＨｉＫ＞１９６；（＾ｔ．．．．．．‘．Ｖ．＆，…Ａ‘．ｒ…１ｉ．Ｖ？ｒ‘？．矿１《巧〇＾？？４巧．Ｑ（巧－‘．．．Ｊｉ。ｔ．－．．．－．！值ｒａ＞巧ＣＨｆ：＊２４６５巧Ｄ＇ｙＬＰＬＬＬＳＣＦＹＹＦｒＡＰｒＲＶＭ，ＹＦＳＫ？ＡｒｒＡＡＲＶｔｌｙＡＩＰＧ５￡ｆｇｉＫｒｒＳＳＳＭｒＹＳＩＱＡＳｌ？？Ｔ５￡ＡＹｌ：ｆｌ５Ｉ？ＹＡＳｒＬＳＡＩ巧ｅ崎ｊｙｙＩ说０ｔｉＯ１許甲呀严巧呼啤’说Ｉ．．ＩＹ．Ｖ．Ｖ．’如Ｃ術，兵辟巧？Ｖ０．．．．．ｙｃ．．ｆ．．巧＊々佩３４如巧Ｗ—，Ｕ，》，吹Ｈ、－．．．々Ｗ…，，，＂＞‘…？ＩＴ，ＰｉｆｉｋＹ…欣嘛巧Ｃ０１仪巧２ＭＡ，Ａ巧．Ｃ货＂阳５Ｗ７吗２ＷＦ．．ＣＩ！．私巧Ｖ．ｆＷＪＨ備‘＆巧游巧．－Ｃ位ａＳ＊ＶＩＹＨ：ｆｌＧＷ２９２ｉ＞９２Ｗ．５，ｔＡ．ｆ‘（）说Ａ．．Ｅ．．広ＡＶ．？－ＧＳｉ巧技ＣＫ４３４扣ｓ醉巧Ｍｆ各？ＶＲｆＬ＂ＡＡＡｉＲＳｒｒＣｒＳＳｙＡ田ｃｍｒｍ？於ｔＦＳｆＬＹｌＲＷ５ｒ々Ｃａ＞ｇｒＡ￥３ＶＩ＊ｆＡ巧ＡＰＧＳＦＣ田ＹＶｒＲＡｆｒＬＧｙｓｙＶｒＲＧＩＳＭ巧Ｑ啤耐２０。巧巧９？〇巧。１８０ｍ０？＞ＩＩｔ—＊Ｉｉ１１１ｉｒ－４？Ｖ＊’＊＇！，、｜？．，，Ｒ，，ｔＶ？，》？，？＆－．５巧，．Ｉｆｔ－ＶＶＴＦＴｉｉ，’？Ａ，，《＇、？‘？＊？Ｐ．、，，衣．ｉＷＭＮｃｏｉｌｓ巧？？？？？＊々ｃｔｔｉＩｆ解］ＩＭ７ＥＱＴ？ｒｉｉｒｆ巧‘淋ＷＣＫＫ４？‘…………Ｑ…．．．卿＊ＭｌＳ？．Ｍ＞Ｌｔ访＂扣９７辟巧－ＶＬ．．．Ｖ約Ｍ》ＪＵＡＰＭ？．Ｉ．．．ｔ－ＹＷ出《２巧５ｌ户巧９．々故．巧２己？￡２访Ｍｌ．．．．１１１１４４巧Ｕ｛—＇＇１１＇ａＨＨｉＨｍｒａｉ麗１＆＾ｉｆｔｉｉ■ｉ■■Ｇａ＞Ｌ５ＬＥＡｙＦＥ々ＷＱＡＡＫＥＷＡＤＳＴＥＳｙＡＳ９ＷＲ￡ＡＤ！ＬＡＫＳｒＬ？Ｍ＾ＭＡＡＳＲ々ＡＩＳ１ＥＴ，ＡＳＡＶＲＥ￣ＡＺ＞ＬＡ＾卿鮮３４巧呼＾？吁叩＊１０ａＣＨ色ＧＳ２ｉＸ辟巧ＩＴＴ－＾ｉｚｚＺｉＺＺＺｉＺｉＺｚｚｉＺｉＺｉＺｉＺｚｚｚｚｚｚｉｚｚｚｚ＾ｚｉｎｉ＾＊１，Ｔ．ＩＳＭ．占．．．Ｃ＊，．，，？ｔ复站批Ｉ掛Ｃ＂巧之巧．．．．．Ａ．．Ｉ＞．ＩＳＭ．．Ｍｆ．右．．．．亡ＭＭＷ６３０Ｍ１．ｙｇ々扣９１，．．，，．ｗＫ？口Ｃ汾？｝吹７啤１．．．．ｒ＆＊？？．ｓ＊巧５＾１巧兴約换巧－．．．ＳＴｆｌ＾ＣＨＩ？？？２Ｗ９１？Ｆ扛ｐ）＜．霞湿■宙函ＳＶＳ５ＳＩ＞ｆ＂ＳＳｌ１ｔＡｘＳ５ＹＬ？１５ＭＡＡＳＰ１ＲａＡＴＱ－ｙ〇＂ｍｇＬ５ＳｙＳＫＱＯＡＳＫＤＧｇＴＦＬＹ巧ＶＡＫ巧ｒＯＹ－ｈ＾ｆ＾户＾ｍＵ９Ｉ》７９９許畔＾＾－Ｉ１玄Ｃ４４０游如ＭｇｉＣ￡６巧＊６■？？，？？？，＜■■＞？？，？，？？巧＊？Ａｋ？？、Ｉ＃，Ｋ？Ｊ＊＊，！？０６．．－ａ－－巧．？，．，，－ｒ０２Ｃ触茲０乂巧１衣料－＊■Ｉ＊，》＞？？４￥１今２，》．？？？＊■■，ＩＶＶＩ巧－Ｗｉ巧．Ｒ＊．Ｓ过ＷＣＭＷＷ６５０）１Ｉ（Ｊ兮ｗＫｆｌＶ４ｉ．，ＣｍＳＭ々ＩＭ）ＵＭｌ權々沪批巧■ｆ－ｔＣ５９．．．々，．Ａ－．．．ＬＵ．．１Ｓｎ＆Ｕ２２５ｔ９６．￥巧？巧醒■■＾画ＶＬＦＣ＾ｙｒｒＭＳＩＡＯｉ－＾么巧ｔＩＣＱＡ５ｇＹＦＨＳＣ５Ｓ々ＬＧ＾ＩｒＹ＾ＡＴＫ＾ＬＣａＳ口ＴＰＥＲＡＫＡＡＴ巧Ｓ巧９呵？柳ｉ＾＾１７ｔ４０５０甲１０甲ｉＷ３０１路１汾玄规２４？＞３５１１换４９－，，？．．．？，．．．．，，，．．．．Ｕ，，，，．：，，ＪＳ々ｉＣＨ５？鮮？乙Ｉ巧５０．．．．任．的＊色试Ｍａ６０＊＊．护巧１仪９－＇ＪＪｌＺ？；１＜１ＳｌＨＵｊ０４６２＾．５々Ｋｌ＊ｌ？＊ａ＊Ｌ＜？？＊＊＊１＞■—＊＊ｂ？？＊，＜４＜４＊＊＊＊＊＊＊ｇ？＞ｌ＊？４＊＊？＞？乂１巧？－？ｗＥ＿ｅＷＣＨ＊＂Ｆ±ａ９７？ａＯ＾ｌ５ｙ－－巧Ｉ！Ｃ田１巧沪巧－ＶＰ图３５两株猎婿病毒ｌ基因和２Ｂ基因编码氨基酸和参考株叱对结果－ＦｉｄｕｅｎｈＰｄ２ｉｇ．３５Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆ化ｅｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｓｅｑｃｅｓｏｆｔｅＶ１ａｎＢａｎｄ＊ｒｅｗｉｅｆｅｒｅｎｃｅｒｇｉｏ打ｓｂｅｔｅｅｎ化ｅｓｔｕｄｙｓｔａｉｎｓ 扬州大学硕壬学位论文＾义４．３重组分析重组可Ｗ改变病毒的基因组构成一，是病毒进化的个过程，忽视重组的发生可能会影响基因的分析数据和结论推断。ＰＫＶｓ能在腹泻猪群和临床健康猪群中同时存在，Ｖｅｒｍａ５指出可能存在两种不同的ＰＫＶｓ；等致病性的和非致病性的，因此若当两种不同病毒感染一同宿主的时候，病毒基因姐之间就会随机的发生重组。亚型的花叶病毒（虹ｔｅｒｓｕｂｔｙｐｅｍｏ一６ｓａｉｃｖｉｒｕｓｅｓ）就是在地区内多个亚型的病毒循环感染发生重组的结果。为研究ＰＫＶｓ－－－－可能发生的重组用ＳｉｍＰｌｃ姑．５．１ＲＤＰ３．４４软件包对ＪＳ０１ＣＨＮ和ＪＳ０２ａＣＨＮ可，使软件包和能发生的重组事件进行检测。（１）ＳｉｍＰｌｏｔ３．５．１分析－－－－－选取最早发现的Ｓ１ＨＵＮＮＣ０１１８２９）和ＹｌＣｍ（ＧＵ２９２５５９）两个猪崎病毒的全基因（序列作为重组分析的参考株－－－－，ＪＳ０１ＣＨＮ和ＪＳ０２ａＣＨＮ为检测对象。根据ＳｉｍＰｌｏｔ３．５．１软件的使用方法，当参考序列的点图呈现近似开行线时，说明目的序列与其中某条参考序列的序列高度相似，不存在重組信号；当参考序列的点图呈交叉时，说明可能存在重组信号。一－－经Ｓｏｏｃａｎ－－－ｉｍＰｌｏｔ和Ｂ议分析发现ＪＳ０１ＣＨＮ有个重组信号，在４６６１ｎｔ４８０１ｎｔ区域，ＪＳ０１Ｃ－－ＣＨＩ有４８０－－－－ＨＮ与Ｙ４１ｎｔ５１６１ｎｔＪＳ０１ＣＨＮ与Ｓ较島的同源性，而在区域，１ＨＵＮ有较高的－－－同療性１４ｎｔＳ０２ａ－ｎ；而在４８３ｎｔ８２有若干不显著的重组信号；ＪＣＨＮ在４８０１；ｎｔ８１２Ｉｔ区域有若－－。－干不显著的重组信号虽然该重组信号不太明显，但可能Ｓ１ＨＵＮ和Ｙ４ＣＨＩ之前发生的－韋巧專件影日向了ＪＳ－０１－ＣＨＮ和－－■ＴＳＯＳａＣＨＮ的暮因构成（郎６）。（２ＲＤＰ３．４４分析）选取ＧｅｎＢａｎｋ公布的猪曠病毒和其它非猪嘴病毒的全基因序列，利用ＲＤＰ３．４４软件包中７Ｓ９ｉＧ＂ｉ２的ＲＤｐ，Ｇｅｎｅｃｏｎｖ，Ｂｏｏｔｓｃａｎ，Ｍａｘｃｈｉ，Ｃｈｉｍａｅｒａ和ＳｉＳｃａｒｄｎ六种算法随机检测－－ＪＳ－Ｏ－ｌＣＨＮ和ＪＳ０２ａＣＨＮ基因组可能发生的重姐事件。由于不同的计算方法得到的结果不一可能互相完全致Ｐ一，使用软件计算时规定六种算法中有四个值为个可接受的重组信号，其余参数按照ＲＤＰ３．４４说明书建议参数设置无参考序列比对方式。结果发现一－－－０－ＪＳ１ＣＨＮ可能是非主要亲本ＪＳ０２ａＣＨＮ和潜在的某亲本重组的结果，六种算法的值分－－—Ｍｉ４９＝＝＝、ｅｃｏｎｖ＞别为Ｘ．Ｘｌ〇、ｏｏｃａｎＸ、：ＲＤＰＰ１．３０６１〇ＧｅｎＰ１７Ｓ３Ｂｔｓ５＾８２１０（）（）巧）－—７？－＂＝＝Ｘ＝ＭａｘＣｈｉＰ２．５２４Ｘ１〇、Ｃ扣ｍａｅｒａＰ３．３８９ｌＯ和ＳｉＳｃａｎＰ３．０８９ＸｌＯ。根据基因（）（）（）－Ｊ６９２０６９为亲本参与ＪＳ０－组不同区段的进化树分析可发现ＷＵｍ（Ｑ）作１ＣＨＮ（ＫＰ１４４３１巧的－９）重组不明显（图３。根据设置参数对１３株猪哨病毒的全基因组进行重组分析发现，重姐在猪峭病毒全基因 杨振：猪峭病毒感染流行病学调查和全基因纽遗传进化分析６立一－－－Ｓ０１－ＣＨＮ在－巧８２区域有３７３８）。序列中普遍存在，软件检测到Ｊ５３０６个重组事件（图，ＪＳ－Ｑ２ａ－ＣＨＮＪＳ－０－１ＣＨ＂。■—Ｈ＾ｉ國－－－—ｉＪＳ－溫３－ＣＨＮ—ＪＳＧ２ａＣＨＮＩＣＨ－Ｈ＂ＸＸ－４Ｊ冷饼。；巧、■ｗＵｒｔｏｉｎ：■－圓〔Ｈ－ＨＺＪ（巧２７５鮮６Ｓ２Ｃ！Ｍ２恥Ｃ１２ＣＨ（ＢＢＨ＿）Ｉ义＞６Ｓ－１２Ｄ１２ＣＨＫＣ屯巧３（巧＿■ｉｉｉｉｉｉｉ祖画Ｉ■Ｕｎｋｎｏｗｎ■辉琴画）ｔＷＬＨ１ＪＱ６９２０６£■■■（ＤＵ！圍圓Ｉｒｋｒｉｗｙｎ－２Ｄ１２ＣＨＫＤ６ＳＪ（屯巧呜＿）一Ｔ■ｉ■■■ＨｉＢ—．！Ｈ皂ＩＩＵ地＇ｒｋｆｉ试狮已填纖ｍｍｎｎｉｉｕ讀．奪Ｋ－３＆ＨＵＮ－２００＆ＨＵＮ６Ｃ（！２朵１６１＿）—舰＂＇化Ｍｊｌ—■——：Ｉ—ｍｍＵｎｋｎｏｗｉｉｌｌｌｌ、：Ｐｏｒｃｎｅｕｖｒｕ＾＾ｉｋＱｂｉｓＸ＞＾ＫＣ２０，＿＿Ｓ－－Ｈ１ＨＵ＂（Ｎ００１１８２９）‘Ｕ水顏峨：Ｖ：：‘ＳＨ－Ｗ－ＣＨＮＪＮ６３Ｃ６１４Ｃ）－，■—？，■—１—ｉＭ—，ｒ？％＊奶，ｆ；巧ｇ巧；巧－Ｃ作１ＨｌＧＵ２９２５５９ｇＨＢ（）ＵｓｗＫｃＷＣＨ４４１ＫＦ５３９７ｅ３；ｌ〔）背癸；｜＾－＾＊＾Ｓ２２０－１２ＣＨＫＣ＾＾６＿（ＢＢＨ＿＾ＷＵＨ１（ＪＱ０９２Ｏ６０）、＇■Ｍ、—ＨＨＵＨＨｉｉｉｉｉ——Ｉ—＇伽ｒｃｎｅｋｏｂ＝盐ＭＢｉＰｏｔｉｖｆ出＜：〇諭：ＭｉＵ浊ｎｏｉｉＸｉｒｉ＜Ｃ泌偽４）ＢＨＵ輪：Ｙ－－（１ＣＨＩ＾Ｕ２９２５５９（）ｎｋｎｏｗｎｒｃｎｅ＜ｏｕｙｒｕｓ＞ＫＣ２Ｄ＾４ＩｊＵＰｏｉＪｂｉ＾Ｅ＿；３－图３７ＲＤＰ３．４４软件检测１３株蜡病毒全基因组重组事俾－ＴｒｅｃｅｎＦｉ３７ｈｅｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｅｖｔｄｅｔｅｃｔｅｄｂＲＤＰｓｏｆｔｗａｒｅｇｙ 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杨振；猪踏病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析１＿１４讨论自猪峭病毒被发现Ｗ来，已有多个不同来源的的ＰＫＶｓ全基因组序列被测序分析，其各基因片段的分子特征也有详尽的描述ｅｒ－－ＨＵＮ的ＲＮＡ二级结构。民ｅｕｔ等对Ｓ１化及各基２因片段进行了比较系统的分析，为ＰＫＶｓ的全基因序列分析提供了很好的参考。本文中通－ＰＣ民方法从感染ＰＫＶｓ的仔猪粪便样本中获得了两份ＰＫＶｓ全基因序列过ＲＴ，并对其进ＰＫＶｓ全序列命名为ＪＳ－０－（ＫＰ１４４行了生物信息学分析。检测自腹泻仔猪的１ＣＨＮ３１８），’ｏＡＲＦ－除去ｐｌｙ（）尾基因组全长为８２１４ｎｔ，开放阅读框（Ｏ）基因全长为７４７０化５ＵＴＲ长’７６ｎ－－－度为５ｔ，３ＵＴＲ基因序列长度为１６８ｎｔ。ＪＳ０２ａＣＨＮ（ＫＫ６０５０７）来自临床健康仔猪，’ｏＡＲＦ－除去ｐｌｙ（）基因组全长为８１２１化开放阅读框（Ｏ）基因全长为７３７６ｎｔ，５ＵＴＲ长度’５７７ｎ－－－为ｔ，３ＵＴＲ基因序列长度为１６７ｎｔ。与不同来源的ＰＫＶｓ全基因序列比较发现ＪＳ０１’一ＣＨＮ的ＹＰ１基因编码的氨基酸第２３７位插入个氨酸酸－（Ｔ），在３ＵＴＲ基因的１０８位’一－０２ａ－ＣＨＮ的２Ｂ编码区缺失３０个氨基酸－插Ａｒ个碱基，５ＵＴＲ插入；ＪＳ个碱基。与参考株比较发现，这不是首次发现ＰＫＶｓ的ＶＰ１基因碱基的插入和２Ｂ区的氨基酸缺失，Ｃ＂４一ｉ２４８Ｈ－ＨＮＸＸ－４ＪＸ４０ＶＰＭＰ１７／２００７／ＴＨＡ发现在位插入个氨基酸（Ａ），Ｃ（１５２３）的１一－－编码氨基酸在２３９位插入个氨基酸。本文中ＪＳ０２ａＣＨＮ是从感染ＰＫＶＳｓ的健康猪样本ｓＨ－ＨＮＸＸ－－中发现的，Ｃ４ＪＸ４０１５２３、Ｇ１／２／Ｋ，这种缺失可能是ＰＫＶ进化的结果（）Ｓ０１２ＣＨ（ｉ５’６－ＫＣｗＫｏＶＣ４２４６３的和说１／２０１２／ＣＨ４２４６３９、ｓ／ＣＨ４４１ＫＦＷ９７６３在２Ｂ基因编码的氨（）（）一基酸相同的位置都有３０个氨基酸的缺失，与其致病性可能有定的关联，因此要对ＰＫＶｓ的一２Ｂ基因进行进步的研究。ＰＫＶｓ－－－－根据全基因序列构建的进化树分析显示，ＪＳ０１ＣＨＮ和ＪＳ０２ａＣＨＮ与ＰＫＶｓ一一个大的分支，ＰＫＶｓ不同立的处于而与其它峭病毒亲缘关系远，但又与其它，形成独个小分支ｉ７ＡｎｉｓＰＫＶ。Ｗａｎｇ和利用ＰＫＶｓ部分基因序列的研究表明其存在不同的型，通对ｓ一全基因序列的分析进步证明ＰＫＶｓ的多样性。一Ｗ－Ｗ－重组是病毒基因组进化的关键因素之。ａｎｇ等人用Ｓｉｍｐｌｏｔ对ＳＨＣＨＮ进行’一ｉ９重组分析发现３端有个明显重组的区域，对峭病毒株Ｈ０２３／２００９／Ｊｐ的ＶＰ１和３Ｄ基因研巧发现其可能是ＰＫＶｓ和ＢＫＶ发生自然重组的结果。对ＡｉＶ研究发现也有重姐序列Ｗ的存在，重组可能是嘴病毒属病毒成员普遍存在的现象。本文中通过生物信息学软件对ｔ获得的两个ＰＫＶｓ全基因序列进行重组事件检测，使用Ｓｏｉｍｐｌ分析时Ｗ－－－８１－印撕（：０１１８２１ＣＨＩＧＵ２９２５巧产为参考序列ＪＳ－０１－ＣＨＮ的的如和Ｙ（，检测结果发现在一４６６－－１ｎｔ５１６１ｎｔ区域，有个相对明盘的重组信号，而在４８３ｎｔ８２１４ｎｔ有若干不显著的重组 ｎ扬州大学硕击学位论文信号－－ｎ－。ＪＳ０２ａＣＨＮ在４８０１ｔ８１２１ｎｔ区域有若干不盈著的重组信号无明显的重姐信号。虽－－－－－－１ＨＵＮＹ１０１然重组信号不太明盈，但可能Ｓ和ＣＨＩ之前发生的重组事件影响了ＪＳＣＨＮＪＳ－－０２ａＣＨＮ的基因组成，，ＰＫＶｓ和。有趣的是对１３株ＰＫＶｓ的全基因组进行重组分析发现Ａ病一的重组现象是普遍存在的，就像其它小民Ｎ毒属成员样。并且重组主要位于编码区，２２一这与姬郭彪的研究是致的。根据参数显示发生重组的区域几乎全部位于基因组不同区段的交界处。由于ＰＫＶｓ目前尚无法体外分离，对其基因组的研巧也仅限于用特异性引物—就像鸟枪法（Ｓｈｏｔｇｕｎ）样进行随机的ＰＣ民扩増，因为提取的总ＲＮＡ来自未知的病料，里面可能含有不同来源的ＰＫＶｓ的核酸，ＴａＤＮＡ聚合酶的偏，当进斤ＰＣ艮反应的时候ｑ２３２４’好性会获得随机的可能发生重组的基因片段，在对不同片段进行拼接时，就会得到发生重组的基因组。一目前对ＰＫＶｓ的全基因测序数量有定的局限性，在进行重组分析时，无法准确的确定发生重组的亲代，限制了重组分析的准确性，因此，继续加大对ＰＫＶｓ全基因组的测序分析有助于准确的了解ＰＫＶｓ的基因特征，ｓ。另外尽快找到ＰＫＶ体外分离培养的适应性一ＰＫＶ细胞，对进步研巧ｓ的病原学特征具有重要的意义。参考文献１ＷａｎＣ．ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃ１：ｅｒｉ之ａｔｉｏ打ｏｆａｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｉｎＣｈｉｎａ．ｇ，ｐ－－Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖ１１１Ｍ２－ｉｒｏｌｏ５７５７３５７８ｄｏｉ：０．１００７／ｓ００７０５００５７２０１２．ｇｙ，，（）２民ｅｉＵｅｒ，Ｇ．，Ｂｏｌｄｉｚｓａｒ，Ａ．＆Ｐａｎｋｏｖｉｃｓ，Ｐ．Ｃｏｍｐｉｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｏｒｇａ打ｉｚａｔｉｏ打ｏｆｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓ，ａｍｅｍｂｅｒｏｆａｎｅｗｓｐｅｃｉｅｓ－ｉｎ化ｅｅｎｕｓＫｏｂｕｖｉｒｕｓｆａｍｉｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅＡｃｈｉｖｅｓｏｆｖ１１ｇｌＰ．ｒｉｒｏｌｏ１５４０１０，ｙｇｙ，ｄｏｉ－－－８：１０／ｓ００２２００９．．１００７７０５００８０２８８（），３Ｔａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔａｌ．ＭＥＧＡ５：ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇｍａｘｉｍｕｍｌｉｋｅｌ化ｏｏｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｄｉｓｔａｎｃｅａｎｄｍａｘｉｍｕｍａｒｓｉｍｏ打ｍｅ化ｏｄｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ｙ，ｐｙｂ－ｉｏｌｏａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ２８２７３１２７３９ｄｏｉ：１０．１０９３／ｍｏｌｂｅｖ／ｍｓｒｌ２１２０１１．ｇｙ，，（）４Ｅｌｔａｈｉｒ，Ｙ．Ｍ．，Ｑｉａｎ，Ｋ．，Ｊｉｎ，Ｗ．＆Ｑｉｎ，Ａ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｈｉｃｋｅｎａｎｅｍｉａｖｉｒｕｓｇｅ打ｏｍｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅｏｆｉｎｔｅｒｓｕｂｔｙｐｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙｏｕｒｎａｌ８，５１２，ｄｏｉ：１０．１１８ｊ－－－６／１７４３４２２Ｘ８５１２２０１１．（）ｒｍｒ－吐．ｅＭｏａｅｔａｎｄｍｏｌ５ＶｅａＭｏＳＫ．ＡｂｄｌＧｌｉｌ．Ｙ．底ＧｌＳ．Ｍ．Ｉｄｎｔｉｆｉｃａｉｏｎ，，，，，，ｙ－ｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｉｎＵ．Ｓ．ｓｗｉｎｅ．Ｖｉｒｕｓｅｎｅｓ４６５５１５ｐｇ，５３ｄｏ１ｌ１－－－２０１３ｉ：０．１００７／ｓ２６２０１３０８７９１．，（）＊Ａ－６Ｆｏｍｓａａｒｄ．ｅｔａｌｔｔｔＡｌＤｉｎｔ．ＦｕＵｌｅｎｈｃｈａｒａｃｅｒｉｚａｉｏｎｏｆ／ｅｒｓｕｂｔｅｉｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇ，ｇｙｐ－ＶｅｎｏｍｅｓｆｒｏｍａｔｈｅｒａｉｎｄｕｃｅｄＨＩｔｙｐｅ１ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒｄｕｒｉｎａｃｕｔｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｇｐｙｇｄｈ－ｉｓｎｏｎｃｏ打ｔｒｏｌｌｉｎａｒｔｎｅｒ．ＡＩＤＳｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｈｕｍａｎｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ２４４６３４７２ｇｐ，，ｄｏｉ：１０／ａｉｄ．２００６２９４２００８．１０８９．０（．）７Ｍａｒｔｉｎ，Ｄ．＆民ｙｂｉｃｋｉ，Ｅ．民ＤＰ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｍｏｎｇｓｔａｌｉｇｎｅｄｓｅｑｕｅｃｅｓＢｏｍｍａ５６２－５６３ｎ．ｉｆｂｒｔｉｃｓ１６０００．，口）８Ｐａｄｉｄａｍ．ＳａｗｅｒＳｔ．Ｍ．＆Ｆａｕｕｅ，ＭＰｏｓｓｉｂｌｅｅｍｅｒｅｎｃｅｏｆｎｅｗｅｍｉｎｉｖｉｒ，，ｙ，ｑ，Ｃｇｇ 杨振；猪蜡病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析１５＿ｕｓｅｓｂｆｒｅｕｅｎｔｒｅｃｏｍｂｔＶｉ２６５２１８－１０１０１ｉｎａｉｏｎ．ｒｏｌｏ２２５ｄｏｉ；．０６／ｖｉｒｏ．９９９．００５６ｙｑｇｙ，，１９９９．（）９ＭａｒｉｎＤ．ＰＰｏｓａｄａＤ．ＣｒａｎｄａｌｌＫ．Ａ．＆Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎｏｄｉｆｉｅｄｂｏｏｔｓｃａｎｔ．Ｃ．Ａｍ，，，，，，ａｌｇｏｒｉｔｈｍｆｏｒａｕｔｏｍａｔｅｄｉｄｅ打ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｏｉｎｔ－ｎｂｒｅａｋｓ．ＡＩＤＳｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｈｕｍａｎｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ２１９８１０２ｄｏｉ０１０８９／ａｉｄ．：１．２ｐ，，００５．２１．９８２００５．（）１０ＫｉｍＭ．Ｋ．ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｏｕｌａｔｉｏｎ，ｇｙｐｐｓｅｃｎｅｓｕｅ＇ｉｎｆｔｉｇｐｐｐｅｒｇｇｓｔｓｕｎｉｑｕｅｐａｔｅｒｎｓｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎＫｏｉｅａ．Ｐｈｔｏｐａ化ｏｌｏｇｙｙ４－－－－－１０９９３１０００ｄｏｉ：１０．１０９４／ＰＨＹＴＯ１０１３０２７５民２０１４．，，（）１ＰｏｓａｄａＤ．＆ＣｒａｎｄａｌｌＫ．Ａ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｍｅｌ；ｈｏｄｓｆｂｒｄｅｔｅｃｔｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏ打ｆ１，，ｇｒｏｍＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ｃｏｍｐｕｔｅｒｓｉｍｕｌａｔｉｏ打ｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ化ｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｅｎｃｅｓｏｆ－ｔｈｅｔｅｄｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｃａ１３７５７６２：１１０／ｎａｓ２４ｉＵｎｉＳｉ９８７１３ｄｏｉ０．７３．，ｐ，１３７０６９８２００１．（）－１２Ｇ化ｂｓＭ．Ｊ．ＡｒｍｓｔｒｏｎＪ．Ｓ．＆Ｇ化ｂｓＡ．Ｊ．Ｓｉｓｔｅｒｓｃａｎｎｉｎ：ａＭｏｎｔｅＣａｒｌｏｒｏ：，ｇ，，ｇｐｃｅｄｕｒｅｆｏｒａｓｓｅｓｓｔ－５８２ｉｎｓｉｎａｌｓｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｅｕｅｎｃｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｉｃｓ１６５７３ｇｇｑ，２０００．（）３ｓｕＳ．ｅａｌ．ＳｅｕｅｎｃｅａｎａｌｓｉｓｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓＶＰ１ｒｅｉｏ打ｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎ１Ｏｋｉｔｔ，ｑｙｐｇｐ－ｓａａｎａｎｄＴｈａａｎｄｒｕｓｅｎｅｓ２５３－２５７ｄｏ－－ｉｇｉｎＪｐｉｌ．Ｖｉｇ４４ｉ：１０．１００７／ｓｌｌ２６２０１１０６９２，，７（２０１２）．１４Ｃａｏ，Ｗ．ｅｔａｌ．（Ｊｂｍｐｌｅｌ：ｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆ１：ｈｅｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓｖａｒｉａｎｔＣＨ／Ｈ－４／２０１４７１ＶＩ１－ＮＸＸ１２．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｖｉｒｏｌｏ８６１９ｄｏｉ：０．１１２８／Ｊ．０２３７１２２０１．ｇｙ，，（巧１５ＦａｎＳ．ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉ円ｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃ化ｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓｖａｒｉａｎｔｉｓｏｌａｔ，ｐｅｄｆｒｏｍｓｕｃｋ－ｌｉｎｉｌｅｔｉｎＧａｎｓｕｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ．Ｖｉｒｕｓｅｓ５２５４８２５６０ｄｏｉ：１０．ｇｐｇｐ，，３３，９０／ｖ５１０２５４８２０１３（）．１６Ｗａｎ，Ｅ．ｅｔａｌ．Ｃｏｍｌｅ化ｓｅｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｎａｌｓｉｓｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｇｐｑｐｙｇｙｐｕＮｏｒｔｈｗｅＡ２５３３－２５ｓｉｎｄｏｍｅｓｔｉｃｉｓｉｎｓｔＣｈｉｎａ．ｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏ１５９３５ｄｏｉ：ｐｇｇｙ，，－－－１０１００７／Ｓ００７０５０１４２０８７２２０１４．．（）１７Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｌａｎ，Ｄ．＆Ｈｕａ，Ｘ．ＰｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｍｓｆｒｏｍｐｉｇｓｔｏｏｌｓｐｅｃｉｍｅｎｓｉｎＳｈａ－－－－ｎａＣｈｉｎａ．Ｖｉｍｓｅｎｅｓ４３３５０３５２ｉ：１０．１００７ｌｌ２６２０１１０６４３３２０１１．ｇｈｉｄｏ／ｓ，ｇ，，（）８ａ－１Ａｎ．Ｊ．ｅｔｌ．Ｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｆｒｏｍｉｓｔｏｏｌｉ打Ｋｏｒｅａ．Ｖｉｒｕｓｅ肛ｅｓ４２２０８，Ｄｐｇｇ，２１－－－：／ｓ２０１ｄｏｉ１０．１００７ｌｌ２６２０１００５６１９１１．，（）１９Ｋｈａｍｒｉ打Ｐ．ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｋｏｂｕｖｉｍｓｓｅｕｅｎｃｅｓｓｔｏｏｌｓａｍｌｅｓＣＯ，ｑｐｔａｎｔｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｈｅａｌｈｙｐｉｓｉｎＪａ．Ｉ打ｆｅｃｉｏｎｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：ｏｕｒｎａｌｏｆｇｐ，ｇｊｍｏ－ｌｅｃｕｌａｒｅｉｄｅｍｉｏｌｏａｎｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｅｎｅｔｉｃｓｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓ１０９５０ｐｇｙｙｇ，９５ｄｏｉ：６／．ｍｅｅｉｄ０１２０４１０．１０１ｇ．２０１０．０６．０（１０．，ｊ）２０Ｈａｎ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｘｕｅ，Ｙ．＆Ｓｈａｏ，Ｓ．Ｓｅｑｕｅ打ｃｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｍｏｓａｉｃｇｅ打０ｏｕｒｎａ１－－－ｍｅｏｆＡｉｃｈｉｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌｏｌ８３９０ｄｏｉ：１０．１１８６／７４３４２２Ｘ８３９０Ｏｉｌ．ｇｙｊ，，口）２１ＹｕＪＭｅａｌ．Ａｎａｌｓｉｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｆ化ｅｃｏｍｌｔｅｅｎｏｍｅｏｆａｍｅｍｂ．．ｔｏｅ，ｙｐｇｅｒｏｆａ打ｅｗｓｐｅｃｉｅｓｏｆｋｏｂｕｖｉｍｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｗｉ打ｅ．Ａｒｃｈｉｖｅｓｏｆｖｉｒｏｌｏｇｙ１５６，－－－７４７－７５１ｉｄｏ：１０１００７／ｓ００７０５０１００９０７６２０１１．．，（）２２姬郭處．河南猪嘴病毒分子流行病学调查、全基因序列分析、ＶＰｌ蛋白表达及其初１步应用．河南农业大学硕±论文口０３。）２３Ｓａ－ｉｋｉＲ．Ｋ．ｅｔａｌ．ＰｒｉｍｅｒｄｉｒｅｃｔｅｄｅｎｚｍａｔｉｃａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｗｉｔｈａｔｈｅｒｍｏ，ｙｐｓａｂ－ｔｌｅＤＮＡｏｌｍｅｒａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９，４８７４９１１９８８．ｐｙ（＾）２４Ｍａｒｔｏｎ，Ａ．，Ｄｅ化ｅｃｃｈｉ，Ｌ．底Ｂｏｕｒｇａｕｘ，Ｐ．ＤＮＡｎｉｃｋｉｎｇｆａｖｏｒｓＰＣ民ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－．Ｎｕｃｌｅｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｉｈ１９２４２３２４２６１９９１．，（） ７６扬州大学硕壬学位论文全文总结本文通过对江苏地区猪群中ＰＫＶｓ的流行情况进行流行病学调查，了解ＰＫＶｓ在江苏地区猪群中的感染状况，丰富猪峭病毒的流行病学数据；初步了解猪嚼病毒与猪腹湾疾病的关联性一，为防治斤猪腹泻提供定的理论依据。－１、建立了检测猪棉拭样本中的ＰＫＶｓ的ＲＴＰＣＲ方法，检测的猪赠病毒最低核酸量为０．１２６３。使用该方法对江苏地区采集的仔猪粪便样本检测发现临床健康仔猪ＰＫＶｓ阳性ｐｇ率为１９．８％腹泻斤猪ＰＫＶｓ阳性率４９．３％，表明ＰＫＶｓ广泛存在于江苏地区猪群中，并且；ＰＫＶｓ与其它致猪腹泻病毒存在混合感染，可能是致猪腹泻的潜在病原。２、对江苏地区猪群感染的ＰＫＶｓ的犯基因和ＶＰ１基因进行了测序分析。ｆ岡地区一的ＰＫＶｓ３Ｄ基因或ＶＰ１同源性较高，表明在江苏地区流巧的ＰＫＶｓ没有定的地理限制。３、江苏地区腹泻猪感染的ＰＫＶｓ的ＶＰ１基因分布在四个不同的淸猪群中；临床健康ＰＫＶＶＰ一ｓ的１基因分布在同个群，在猪群中可能存在致病和非致病两种不同类型的ＰＫＶｓｏ４、分别从腹泻仔猪和临床健康仔猪样本中获得了两株ＰＫＶｓ的全基因序列，并对其进－－巧了基因特征分析。表明ＪＳ０１ＣＨＮ可能是不同来源ＰＫＶｓ重组的结果。 杨振：猪曠病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析！］＿研究生期间发表论文１、ＺｈｅｎＹａｎｇ，ＷｅｎｊｉｅＪｉｎ，ｅｔａｌ《Ｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｏｉｎｆｅｃｔｉｎｇｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｄｉａｒｒｈｅｉｃｉｓｉｎ化扣巧８１１ＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ》ｐｇ，，－饼１０－－ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏ．１００７／ｓ００７０５０１４２２０４２．ｏｎｌｉｎｅｇｙ万（）；２、杨振，张笛，等，江苏省韦个县域猪峭病毒感染的流斤病学调查，中国兽医科学；－３－、杨振，金文杰，等，猪峰病毒ＪＳ０１ＣＨＮ株全基因测序及ＶＰ１基因遗传进化分析，中国畜牧兽医学会年会论文集４、ＷｅｎｊｉｅＪｉｎ，ＺｈｅｎＹａｎｇ，ｅｔａｌ（ＣｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＶＰｌｒｅｉｏｎｏｆｏｒｃｉｎｅｋｏｂｕｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎＪｉａｎｓｕｇｐｇＰｒｏｖｉｎｃｅＣｈｉｎａ．））ＩｎｆｅｃｔｉｏｎＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎ（ｕｎｄｅｒｒｅｖｉｅｗ），，，５－Ｍｅｎ、ＸｕｅＱｉｎＨａｏＬｉＺｈｅｎＹａｎｅｔａｌ《Ｉｍｉｄａｒｉｌｒｏｖｉｄｅｓａｒｏｔｅｃｔｉｖｅ，ｇ，ｇｐｐｐｅｆｆｅｃｔｏｎｕｌｍｏｎａｒｈｅｒｔｅｎｓｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｌｏｗａｍｂｉｅｎｔｔｅｍｅｒａｔｕｒｅｉｎｂｒｏｉｌｅｒｐｙｙｐｙｐｃｈｉｃｋｅｎｓ》ｒａａｓｏｎｌｉｎｅ，（）；ｊ－６－、ＺＨＡＯＺｈｅｎｐｅｎｇＹＡＮＧＺｈ畑ｅｔａｌ《ＣｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰｉｌｅｔ，ｇｄｉａｒｒｈｅａｖｉｒｕｓｅｓｉｎａｒｔｓｏｆＣｈｉｎａａｎｄＣｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ，ｐｐｇＰＫＶａｎｄＰＥＤＶ》ＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓｕｎｄｅｒｒｅｖｉｅｗ（）；７、赵振鹏，杨振，等，猪源奇异变形巧菌的分离鉴定及集群运动分析，中国畜牧兽医。 ７８扬州大学硕壬学位论文致谢，本论文是在金文杰副教授和秦爱建教授的的悉也指导下完成的，在此论文完成之际向我最尊敬的金文杰副教授和秦爱建教授表示衷也的感谢！Ｈ年来，金老师在论文选题、实验设计、实验过程Ｗ及文章的撰写方面给予细也地指导和建议，开拓我的视野，让我受益匪浅。金老师平易近人，和菌可亲，诲人不倦，Ｈ。年来给了我无微不至的关怀，特别是你积极乐观的态度让我在学习和生活中受益匪浅在、毕业之际，由衷的祝您身体健康工作顺利。感谢导师秦爱建教授在Ｈ年来对我实验方面的建议和帮助。秦老师给我们提供了良好的学习氛围，保证了我们实验的顺利进行。秦爱建老师学术功底深厚，治学态度严谨，。科学事业宽阔，在实验方面高屋建领，使我在科研思维方面有长足的进步在此祝您身体健康，万事如意。衷屯、感谢本实验室钱堀老师、叶建强老师Ｗ及邵红霞老师悉也教导和在谏题研究上的人、治，是。关也和帮助，你们平易近，知识渊博学严谨我学习的典范希望在Ｗ后的道路一上！、，能够得到你们如既往的帮助和支持，谢谢感谢本实验室的工作人员张萍老师顾美老师和沈志松老师的辛勤工作。，感谢你们不辞辛劳的实验准备工作感谢本实验室缪估、万志敏、邹海涛、周海生、陈春波、陶志云等博±在实验上的指导和帮助；感谢己经毕业的于恩琪、张笛、胡晓田、郭井、李玉、李旦、鲍衍清、徐文、＾财、朱明月、张娜、吕亚楠等师兄师姐等在实验和生活上的关屯与帮助，希望你们在！＾＞后的工作和生活中永远开也！感谢张丹阳、庄新宇、范忠、赵振鹏、胡海、石亚运、林伟东雷、王琳、宋娜、田晓彥、纪依依、张美红等师弟师妹在实验上及生活中给予我的帮助，、祝你们实验顺利！，屯想事成感谢黄健、涂飞、孙苹、高爱俊、王志明、徐亮亮、桑建君在实验上的帮助，Ｈ年的陪伴在生活上给我带来的欢乐，祝你们在Ｗ后的工作学习和生活中顺顺利利！感谢金文杰老师的爱人粪志云教授，感谢您和金老师Ｈ年来对我和我女友在生活上无微不至的关怀。感谢我的室友柴继田，感谢Ｈ年的陪伴、支持和照顾。感谢我亲爱的父母和弟弟！，谢谢你们对我无私的爱与关怀感谢我的女友张丹阳及家人，谢谢Ｈ年来你给我的包容、暗伴和鼓励。特别感谢中国农业科学院特产研究所张贺伟同学，谢谢你Ｈ年来在生活、学习和实验过程中的所有关也和支持！最后！，向在所有关也帮助过我的老师、同学和亲朋好友表示诚擎的感谢 杨振：猪赠病毒感染流行病学调查和全基因组遗传进化分析１９＿扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进巧研究工作所取得的研巧成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体邑经发表的研巧成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中Ｗ明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：签字曰期：年Ｌ月曰学位论文版权使用授权书本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被査阅和借阅。本人授权扬州大学可１＾＾学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可臥采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到忡国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年心月日签字日期：６月＞方日＾
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