抗菌肽met在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用

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1、分类号UDC密级编号硕士学位论文抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达及其与抗生素的体外联合抑菌作用TheexpressionofantimicrobialpeptideMETinpichiaandit’sassociatedwithantibioticsinvitrobacteriostasis学位申请人：张婷婷指导教师：牛明福副教授一级学科：生物学二级学科：生物化学与分子生物学学位类别：理学硕士2015年06月独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不

2、包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：摘要摘要抗生素滥用导致细菌对抗生素产生耐药性，对医疗和畜牧业产生较大影响，开发新模式的抗菌药物成为急需要解决的问题。抗菌肽能够作用于细菌的细胞膜使其发生裂解，导致细胞死亡，不容易产生耐药性，而且具有广谱抗菌活性，可以成为抗生素的理想替代品。但已知抗菌肽大多数是天然分离的，不仅含量小，成本极高，而且有些天然抗菌肽对细胞有一定毒性，不利

3、于抗菌肽在临床和畜牧业的应用。很多学者致力于研究人工合成抗菌肽、提高其生物活性。本试验将人工设计合成的抗菌肽MET在毕赤酵母中进行表达，并分离纯化对其抗菌活性和与抗生素的联合使用做了研究。根据Genbank中抗菌肽MET的氨基酸序列，人工设计合成一段可编码表达MET的核酸序列。将MET基因序列克隆到真核表达载体pPICZa-A中，并对克隆结果进行酶切鉴定来验证，然后将重组载体电击转化入毕赤酵母GS-115中，提取阳性重组子的基因组做PCR，结果表明转化成功。筛选阳性酵母重组子，定期添加甲醇发酵培养，提取发酵上清通过SDS-PAGE电泳对

4、条带进行分析。电泳结果表明，目的抗菌肽得到成功表达，而且蛋白分子量的大小与预期相符。用考马斯亮蓝法测定抗菌肽MET的表达量约为132μg/mL。测定抗菌肽MET和抗生素(Ampicillin、Cephalexin、ciprofloxacin、Doxycyclinehyclate、Florfenicol、PolymyxinB、Roxithromycin、Streptomycinsulfate)的最小抑菌浓度(MIC)。分析抗菌肽MET与抗生素联合使用时的分级抑制浓度指数(FIC)，研究抗两者之间的联合药效:(1)抗菌肽MET与盐酸强力霉素

5、结合时对致病性大肠杆菌的抑菌效果表现为协同作用；(2)抗菌肽MET与多粘菌素B结合时对S.aureus的抑菌效果表现出协同作用，与罗红霉素结合时对S.aureus的抑菌效果表现出增强作用；(3)抗菌肽MET与罗红霉素结合时对猪沙门氏菌的抑菌效果表现出协同作用，与多粘菌素B结合时对猪沙门氏菌的抑菌效果表现出增强作用；(4)抗菌肽MET与氨苄青霉素、罗红霉素、硫酸链霉素联合使用对副溶血性弧菌的抑菌效果表现为协同关系，与头孢美唑、丙环沙星、盐酸强力霉素、氟苯尼考、多粘菌素B联合使用对副溶血性弧菌表现出增强作用；(5)抗菌肽MET与氨苄青霉素、

6、多粘菌素B联合作用于痢疾志贺氏菌表现出增强作用；(6)抗菌肽MET与氟苯尼考、多粘菌素B联合作用于嗜水气单胞菌表现出协同作用，与氨苄青霉素、头孢美唑、硫酸链霉素联合作用于嗜水气单胞菌表现出增强作用；(7)抗菌肽MET与氟苯尼考、多粘菌素B联合作用于铜绿假单胞菌表现出增强作用；(8)抗菌肽MET与多粘菌素B联合作用于产I摘要气荚膜梭菌表现出协同关系，与盐酸强力霉素、氟苯尼考、罗红霉素联合作用于产气荚膜梭菌表现出增强作用。结果表明，抗菌肽与不同抗生素联合使用对不同的菌株有不一样的效果。本研究为人工合成抗菌肽MET在毕赤酵母中的表达、为进一步

7、研究与抗生素联合使用提供了参考，对抗菌肽用于治疗一些细菌疾病奠定了基础。关键词：抗菌肽MET；毕赤酵母；真核表达；抗菌活性；协同作用论文类型：应用基础研究选题来源：横向项目“免疫活性肽的基因工程表达”IIABSTRACTABSTRACTOveruseofantibioticswillleadtodrugresistance,sothemostimportantthingistofindanewkindofantibiotics.Antimicrobialpeptidescandestroythecellmembraneofbacteri

8、athenitwillbedied.Intheotherhanditisdifficulttodevelopdrugresistanceandhaswideantimicrobialpropertiesso